Name: 旋钮旋任务: 一种半自动评估大鼠前肢功能的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学习旋钮旋任务评估大鼠前肢功能的方法，该半自动化行为学实验通过量化旋前运动来检测皮质脊髓损伤，提高检测灵敏度与通量。此方法可客观测量临床重要神经通路功能，适用于运动系统损伤前后的功能评估研究。

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本研究由美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH-NINDS）R03 NS091737 项目资助。

本方案描述了任务设置、动物生存与喂养条件的建立，以及动物训练、损伤后动物测试和行为数据的分析。同时阐述了动物训练的四个步骤：适应环境、奖赏关联、配重训练和达到标准转弯角度的训练。所有动物实验均经威尔康奈尔医学院和德克萨斯大学达拉斯分校的实验动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
1. 任务设置
<ol>
	<li>设计一个由透明塑料制成的行为学实验箱，尺寸为宽150 mm、长200 mm、高250 mm。 
	注意：此处矩形孔径宽14.2 mm，高25.4 mm。直径为9.5 mm的旋钮操作杆由甲基丙烯酸甲酯制成，设有两个限位装置，使前臂旋后角度限制在100°以内。上述各项参数均已针对结果部分所述的功能缺陷进行测试与优化。行为实验箱及操作杆如图所示 图1A.</li>
	<li>将微控制器盒连接到计算机。每台计算机最多可连接四个微控制器盒。</li>
	<li>开始任务时，使用控制软件（图1C).
	<ol>
		<li>选择旋钮装置进行控制。输入受试者姓名 &#34;主题&#34; 领域。在下方选择用于训练的阶段 &#34;阶段&#34; 下拉菜单 
		注意：该阶段为每次试验规定了三个参数： &#34;命中窗口，&#34; &#34;命中阈值，&#34; 和 &#34;初始阈值&#34; 命中被定义为在规定时间内达到预设角度标准。 &#34;命中窗口&#34; 指动物开始试验并达到标准角度所需的时间。 &#34;命中阈值&#34; 成功试验的判定角度标准。 &#34;初始阈值&#34; 是启动试验和命中窗口的标准角度；这表示转弯的开始。有关阶段的更多信息，请参见下文部分 &#34;训练动物。&#34;</li>
		<li>点击 &#34;开始&#34; 开始训练会话。点击 &#34;喂养&#34; 手动饲喂动物并 &#34;停止&#34; 结束训练会话。 
		注意：应采用手动饲喂以维持受试对象对任务的兴趣，具体操作详见第3节。停止实验后，实验数据将保存至C盘。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 生活与饲养条件
<ol>
	<li>使用成年雌性Sprague Dawley大鼠（175–200 g）。将大鼠共同饲养在标准笼具中，采用反转的12小时黑暗/12小时光照循环。所有训练和测试均在黑暗期、弱光条件下进行。 
	注意：使用雌性大鼠，因为它们更容易训练 21此处使用Sprague-Dawley大鼠，因其是运动训练研究中常用的品系，也是转基因模型中的主要品系。然而，由于该任务具有可调节性（配重、转动角度阈值、旋钮距离及旋钮本身），这些参数可轻松调整以适应不同品系或体型更大的动物例如 雄性）或更小的（例如 Wistar大鼠</li>
	<li>在研究的前5天，除提供营养全面的巧克力味颗粒饲料外，还需为大鼠提供充足的饲料槽。从第5天后开始，将大鼠的食物摄入量限制为其正常体重曲线的85%。</li>
	<li>食物限制开始后，在整个训练期间每天喂食大鼠7.5 g巧克力颗粒（根据维持其年龄校正体重的85%可适当增减剂量）。若大鼠在训练过程中未摄取足量7.5 g巧克力颗粒，则在最后一次训练结束后补充标准饲料。 
	注意：周末喂养 随意摄取 标准饲料喂养至周日晚上，随后禁食过夜。在进行手术或其他侵入性干预操作时，允许提供食物 随意摄取 至少在手术前3天以及手术后3天（根据恢复时间而定）内，不要让大鼠重新进入食物限制状态。</li>
</ol>
3. 训练程序
注意：训练流程的概述见图3A。在整个实验过程中，每天训练大鼠两次，分别在上午和下午进行。下午训练开始前，需在上午训练结束后至少等待3小时。
<ol>
	<li>习惯化 
	注意：适应的目的是使大鼠熟悉测试箱和抓取操作。
	<ol>
		<li>通过按自动定位器上的向下箭头键，将旋钮装置完全缩回。</li>
		<li>将大鼠放入行为学箱中15分钟。</li>
		<li>在箱中放置15分钟后，用手抓握每只大鼠至少5分钟，使大鼠熟悉实验操作者。</li>
		<li>重复此操作五天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>奖赏关联 
	注意：训练的目的是使大鼠学会将旋钮转动与食物奖励关联起来。在训练的奖励关联阶段，每次训练任务应持续完整的30分钟。
	<ol>
		<li>打开软件并输入大鼠名称。设置阶段为 &#34;K1：旋钮成型——无滑轮&#34; 
		注意：此设置将操纵杆与孔径之间的距离设为 0.0 cm， &#34;初始阈值&#34; 在3°时， &#34;HIT 阈值&#34; 在5摄氏度下， &#34;HIT 窗口&#34; 2秒时。这使得大鼠在将旋钮转动超过3度时即可获得喂食。 &#34;HIT 窗口&#34; 在整个训练过程中将始终保持2秒。</li>
		<li>将大鼠放入行为学箱并按下 &#34;开始&#34; 开始实验。</li>
		<li>通过使用手动喂食按钮一次分配 2 - 3 粒食丸，并轻敲奖励食槽所在位置的箱体侧面，使大鼠熟悉奖励食槽。</li>
		<li>当大鼠已知晓奖励的位置后，手动分配1粒食丸给位于孔洞前方的大鼠。</li>
		<li>当大鼠移动至孔口以期待颗粒奖励时，训练其与操作装置进行交互。
		<ol>
			<li>通过将一颗45 mg的食物颗粒放置在操作杆附近，或将颗粒粉末直接涂抹于操作杆上，诱导大鼠进行互动，使其伸出爪子抓取。若大鼠离开通孔区域，可轻敲操作杆附近的箱体以重新引导其注意力。 
			注意：如果大鼠用其抓取爪触碰到旋钮，程序将给予喂食奖励。任何未使用爪子的交互行为（例如啃咬、用鼻子触碰操作装置）均属错误动作，不应给予奖励。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>一旦大鼠开始用目标爪触碰旋钮并在 0.0 cm 处连续 10 次获得奖励，使用自动定位器上的向下箭头键（图1A) 将操作杆向后收回 0.25 cm。以 0.25 cm 为增量重复此步骤，直至操作杆距离孔口 1.25 cm。</li>
		<li>按压 &#34;停止&#34; 30 分钟后结束实验。</li>
		<li>持续进行奖励关联训练，直至大鼠使用目标前爪将操作杆旋转至距离孔洞1.25 cm的位置（图1B).</li>
		<li>当大鼠连续完成两次旋后操作装置并成功获取颗粒奖励的训练后，开始进行配重训练。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用6 g配重对大鼠进行旋前训练。
	<ol>
		<li>将3 g的配重块通过其末端的连接器固定在操纵杆的L形连接点上。将配重块的绳索穿过滑轮，直至配重块自由悬挂。</li>
		<li>打开软件并输入大鼠名称。设置阶段为 &#34;K2：旋钮成型 - 滑轮&#34; 
		注意：此设置使操纵杆与孔径之间的距离为1.25 cm， &#34;初始阈值&#34; 在3°时，以及 &#34;HIT 阈值&#34; 在5度时，操纵杆距离将从此点起保持在1.25 cm。</li>
		<li>将大鼠放入行为学箱并按下 &#34;开始&#34; 开始实验。</li>
		<li>按压 &#34;停止&#34; 在成功完成100次以上试验后，当大鼠连续2个训练阶段均达到100次以上成功试验时，在某一阶段结束后将负重增加1 g。在后续训练阶段中，将负重从3 g逐步增加至6 g。</li>
		<li>在连续2次以6 g进行旋后操作且成功试验次数超过100次后，进入步骤3.4。 
		注意：从3 g增加到6 g平均需要6次训练（3天）。在开始配重训练时，必须对正确的旋后动作给予奖励，并纠正错误的旋后动作。有关正确与错误旋后姿势的图示说明，请参见 图2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基线训练 
	注意：请继续注意保持正确的旋后动作。再次参考 图2 为正确/错误的旋后动作提供视觉指导，并说明如何改善错误的旋后动作。训练大鼠达到基线标准；此处指在使用6 g配重的情况下，旋后角度达到75度，成功率不低于75%。
	<ol>
		<li>在操纵杆上放置一个6 g的配重。</li>
		<li>打开软件并输入大鼠名称。设置阶段为 &#34;KSB4：旋钮训练中位数 75 最大值&#34; 
		注意：这将设置 &#34;初始阈值&#34; 在5°时， &#34;HIT 阈值最低值&#34; 在15°时，且 &#34;HIT 阈值最大值&#34; 75°。这称为一个 &#34;自适应&#34; 训练阶段，意味着随着大鼠表现的提升，阈值将相应增加。对于 &#34;KSB4&#34; 在该阶段，阈值首先设定为上一阶段的最终阈值。若该阶段此前未进行过任何实验，则阈值设定为最小阈值15度。在当前实验的前10次试验结束后，阈值将根据此前10次试验中峰值角度的中位数进行计算。因此，每次试验的阈值均不相同，且取决于大鼠在之前试验中的表现。</li>
		<li>30分钟后停止实验。</li>
		<li>继续使用自适应阶段进行训练，直至平均峰值角度达到75度或以上，然后进入步骤3.5。此阶段通常在约10天或20次训练后实现。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录连续四个基线值的基线评估
	<ol>
		<li>在操纵杆上放置一个6 g的配重。</li>
		<li>打开软件并输入大鼠名称。设置阶段为 &#34;K27：75度。&#34; 这设定了 &#34;初始阈值&#34; 在5°时 &#34;75°时的HIT阈值。</li>
		<li>按压 &#34;停止&#34; 30 分钟或 100 次试验后结束实验，以先达到者为准。</li>
		<li>持续进行，直至出现四个连续的基线期，且每个基线期的成功率均达到75%或以上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 损伤后评估
<ol>
	<li>打开软件并输入大鼠名称。将阶段设置为与损伤前基线测试相同的静态阶段，以保持与基线测试相同的参数。</li>
	<li>按下 &#34;开始&#34;并运行会话，持续30分钟。 
	注意：损伤后大鼠的参与度可能较低。可通过使用手动喂食按钮，或将奖励颗粒放置在操作装置附近以吸引大鼠接触操作装置来改善。</li>
	<li>每周重复测试一次，直至达到预期的损伤后评估时长。 
	注意：本实验中，我们在损伤后每周评估一次，持续六周。</li>
</ol>
5. 分析数据
注意：数据将保存在 PC 的 C 盘默认位置。在击打时间窗口期间，数据以 100 Hz 的频率采集，并以二进制格式存储。此处数据使用一个名为 Dexterity 的自定义程序进行分析。如需获取该免费软件，请发送电子邮件至 Jason Carmel 博士。
<ol>
	<li>打开 Dexterity 并点击 &#34;标准。&#34;</li>
	<li>找到大鼠数据所在的目录，并选择所需的文件夹。</li>
	<li>选择目录后，选取用于分析的大鼠。</li>
	<li>点击 &#34;保持&#34; 或 &#34;弃去&#34; 保留或丢弃不完整或不含数据的文件。 
	注意：有时会因使用错误的参数和训练阶段而启动实验，尽管会立即停止，但仍会生成一个文件。在分析过程中，该文件需要被丢弃。此外，在某些情况下，尤其是在损伤后急性期，动物可能由于受伤而未执行任何试验，或仅执行极少量试验。对于此类实验，必须保留文件，因其反映了动物的实际表现。当保留无成功试验的文件时，计算所得变量的相应位置应填入 NaN。</li>
	<li>选择现在或稍后标注实验；如果 &#34;立即添加注释&#34; 选择后，将打开一个新窗口。输入 &#34;实验名称&#34; &#34;组名称&#34; &#34;事件数据，&#34; 和 &#34;总周数&#34; 在实验中。</li>
	<li>将受试者分配至各组。</li>
	<li>输入每周或每个时间点的数据会话数量。各会话数之间用空格分隔，并确保最后一个数字后不添加空格 即 (1 1 1 1).</li>
	<li>输入时间点标签。标签之间用空格分隔，最后一个标签后不要添加空格 即 （实验前 第1周 第2周 第3周）</li>
	<li>选择事件发生的时间；此时将出现保存分析会话的选项。点击 &#34;是&#34; 保存分析会话。</li>
	<li>标注数据与未标注数据的概览将显示出来。这提供了绘制数据的选项。</li>
	<li>对于未标注的数据，请点击 &#34;图主题&#34; 绘制单个受试者或 &#34;图示对象&#34; 将所有受试者绘制在同一张图上。</li>
	<li>如需查看带注释的分析，请点击 &#34;绘图&#34; 绘制实验图</li>
	<li>对于已标注和未标注的数据，点击下拉箭头以查看可绘制的变量列表。点击相应变量即可查看其图表。</li>
	<li>单击“导出”以导出图表和/或与该图表相关的数据。</li>
</ol>

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</ol>

Rennaker 博士和 Sloan 博士是 Vulintus 公司的所有者，该公司生产本出版物中涉及的设备。其他作者声明无利益冲突。

旋钮旋前任务通过定量和半自动化方法评估大鼠前肢的旋前功能。为实现这些终点指标，该任务所设计的多个参数（包括旋钮对齐方式、操作装置设计和训练标准）已在多年实践中不断优化。在旋钮对齐方式方面，我们尝试了旋钮相对于孔口的三种不同对齐位置：旋钮左侧与孔口左侧对齐、旋钮居中于孔口、以及旋钮右侧与孔口右侧对齐。最终我们确定采用旋钮右侧与孔口右侧对齐的方式，因为该设置能使大鼠在最短时间内完成训练，并以最少的代偿机制进行旋前动作，特别是可最大程度减少左前爪的干扰。
在操纵装置的设计方面，我们调整了多个设计特征，以最大化前肢的旋后动作并尽量减少身体的参与。此外，我们根据预期功能缺损的严重程度调整了任务的难度。在锥体束切断术后，受影响最显著的是旋后运动，但其功能障碍仍相对轻微。因此，我们在损伤前将大鼠训练至较高的基线标准（75°），以确保损伤后能观察到明显的功能缺损。对于造成更严重功能障碍的皮层损伤，采用7.5 g负荷下60度的阈值已足以在损伤后显示出显著的功能缺损。其他通过试错法优化的参数包括开口尺寸、旋钮与开口之间的距离以及完成一次成功试验的时间窗口。
在整个训练方案中，有一些关键点需要仔细监督。在达到基线水平的训练中，自适应阈值法已成功用于将大鼠训练至75°10。然而，大鼠可能在低于75°的峰值角度出现平台期，即经过4-5次训练后表现不再提升。为了提高表现，可采用静态阈值方法。静态阈值是指阈值固定在某一特定角度，不随大鼠的表现而变化，这与根据近期表现动态调整的自适应阈值相反。如果大鼠在自适应训练期间出现平台期，实验人员应切换至静态阈值。静态训练阶段以10°为增量，范围从20°到70°（阶段K28-K33）。应根据大鼠在前两次训练中的平均峰值角度选择相应的静态阶段。例如，若大鼠的平均角度为45°，则应选择50°的静态阶段（K31）。所有静态阶段的&#34;初始阈值（Init. Thresh.）&#34;均设为5°。在训练过程中，若大鼠失去动机，可在其旋前动作接近但未超过阈值时进行手动喂食。
此外，在基线评估期间，约有5%的大鼠在旋后角度上会退步5 - 10°，成功率也会下降5 - 10%。如果发生这种情况，并且大鼠在3 - 4次训练 session 后仍未能恢复至平均峰值角度75°，则应在返回步骤3.5之前，将静态训练阶段调整至该大鼠当前平均角度的10°范围内。一旦大鼠进入静态训练阶段，切勿再次将其重新引入适应性训练阶段。
该任务存在一些局限性。一旦形成了错误的抓握位置，改变抓握行为（图2）可能会变得困难。因此，早期发现并纠正至关重要。为了纠正大鼠的抓握方式，可通过减小水平和/或垂直方向上的开口尺寸来调整开口大小；通常我们会将一块载玻片用胶带固定在需要调整的开口边缘。对于大多数大鼠而言，这能改善其抓握姿势，因为它迫使动物以特定方式抓握操作杆，从而提高其正确进行前臂旋后的能力。
除了这一挑战外，大鼠还可能发展出代偿机制以完成旋前动作。这些机制包括：利用头部辅助前肢进行旋前；降低肘关节和肩关节以转动旋钮；使用左前爪帮助转动旋钮或将用于抓取的前爪向下按压。所有这些行为都可能被用来成功完成任务。如上所述，与抓握相关的行为问题可通过调节开口大小进行纠正。然而，抓握之外的代偿机制则需要实验人员主动干预，避免对代偿行为给予奖励。在损伤后，我们观察到大鼠需要经过多次尝试才能将前爪置于正确位置，随后进行旋前动作。尽管我们尚未分析任务中哪些具体环节可能导致旋前能力丧失，但可能的因素包括精确抓握能力的丧失以及力量调节功能的受损等。
半自动化的旋后任务平均需要 20 ± 5 天来训练大鼠达到基线水平，且有 25% 的动物无法完成该任务的训练。训练时间较长的原因之一在于，我们并未选择天生偏好使用右侧前肢的大鼠，而是强制所有动物均使用其右前肢，这与大多数抓取实验中的常规做法一致。我们尚未尝试使用偏好左侧前肢的大鼠，但若能首先鉴定出前肢偏好，再对优势前肢进行训练，将是一项有趣的探索性研究。为实现这一点，我们需要调整门板的方向，使开口位置相反；这一调整可轻松完成。
与传统的任务（如IBB任务或单颗粒抓取任务）相比，旋前任务能够对前肢抓取动作进行定量且客观的测量。该任务对严重损伤（皮层损伤）和细微损伤（锥体束切断）均具有敏感性，并且训练程序可根据损伤模型的严重程度进行调整。由于该任务为半自动化，实验人员可根据训练阶段同时训练多只大鼠，从而显著提高实验效率和大鼠处理通量。该任务在不同大鼠之间具有良好的可靠性和可重复性。通过为实验人员提供训练方案期间可参考的故障排除指南（图2），我们已对多种不正确行为及其解决方案进行了标准化。最后，该任务提供了一种直观的方法来分析大量数据，使实验人员能够更深入地研究旋前运动的动力学特征。
未来，我们将利用半自动化的旋后任务作为评估康复类型、剂量和时机的平台。我们的实验室关注刺激对损伤后功能改善的影响。此外，我们还关注那些能够促进神经修复或改善神经传导与通信的疗法如何影响康复效果。我们还希望改进该任务，使其兼容电生理学记录，以便研究运动学习；佩戴头帽的大鼠可常规执行该任务，增加集电环用于记录或刺激也较为简便。文中所述任务适用于大鼠，但目前也有实验室正在尝试在小鼠中开展该任务。总体而言，该任务可用于多种损伤模型和疾病状态下啮齿类动物前肢功能的评估，进而用于评估各类康复策略。未来，我们将持续优化该任务，通过改进以减少错误行为，提高任务习得率并缩短训练时间。

神经系统损伤或疾病后手部灵巧性的丧失会显著降低患者个体的独立性和生活质量1,2,3,4。因此，灵巧性是理解神经修复与康复科学、以及神经运动控制和运动学习基础的重要结局指标。传统上，研究人员使用单颗粒取物、意大利面操作以及Irvine、Beatties和Bresnahan（IBB）前肢功能评分等手动任务来评估动物（尤其是啮齿类动物）的灵巧性5,6,7。这些任务因其较短的学习周期而被广泛采用。然而，它们本质上属于定性评估，对实验人员而言耗时费力，且在某些情况下对损伤后轻微功能障碍的检测不够敏感5,7,8,9。传统任务的这些局限性推动了动物运动功能更定量评估方法的发展，特别是前肢取物任务。
自动化任务具有多项优势，包括客观性、通量提高以及分析时间缩短。新的自动化任务在评估损伤后的灵巧性方面，比传统任务提供更为敏感的测量指标8,10。此外，它们支持自适应训练与测试，可根据动物的表现动态调整训练和测试的难度。最后，自动化任务能够生成大量数据，带来两方面优势：首先，单次试验内的数据量以及试验次数的增加，可提升研究的统计效能；其次，它为神经科学家提供了更大的数据集，从而能够通过动力学和运动学信息的分析，更深入地研究运动学习、训练及功能代偿机制11。
多个研究团队已尝试对传统实验任务进行自动化。高速摄像机可用于采集单颗粒抓取任务等行为的运动学数据12。Alaverdashvili 和 Wishaw 使用高速摄像机记录抓取动作，并利用逐帧运动测量软件 Peak Motus 分析手指运动13。然而，该软件并未采用计算机视觉技术自动识别手指，而是需要实验人员通过光标手动数字化运动点。此外，一些实验任务已结合自动喂食器和饲养笼使用，以实现训练过程的自动化14,15,16。
其他研究团队也使用力传感器和高速摄像机，通过意大利面操作来评估熟练前肢抓取过程中的空间调整和受力情况，而另一些团队则设计了任务以捕捉更复杂的运动17。其中一项任务是抓取与牵拉任务，该任务采用一种具有三个自由度的机器人装置，用于记录大鼠前肢运动的平面和旋转动作18。这种方法的优势在于能够测量运动的动力学参数，但同时也增加了实验的复杂性和成本。
在此，我们演示一种可测量大鼠前肢旋后功能的半自动化任务8。前肢旋后是指 paw 从掌心向下旋转至掌心向上的过程。旋后不仅是皮质脊髓束功能的一个极佳指标，也是人类日常生活中所需的一种具有临床意义的动作8,19,20。此外，与单颗粒抓取任务相比，旋后动作对损伤和功能抑制尤为敏感8。该旋后任务由 Burke 医学研究所与德克萨斯大学达拉斯分校合作开发，用于测量大鼠在水平面内的旋转运动8,10。将大鼠置于行为学实验箱中（图1A），训练其完成三个动作（图1B）：通过矩形开口伸出前肢；抓握球形操作杆；旋转至指定角度。
行为任务由计算机软件控制（图1C）。控制软件向微控制器发送指令，该微控制器连接自动定位器、光电编码器、扬声器和喂食装置。微控制器及其外围连接组件统称为微控制器箱。信息流从光电编码器传送到微控制器，再传送到计算机，然后返回微控制器。如果控制软件向微控制器发出信号表明该次试验成功，则微控制器会触发喂食装置释放一粒食物颗粒。在每次实验开始时，控制软件将阶段信息传递给微控制器，后者指令自动定位器将旋钮定位至距离孔径设定距离的位置。自动定位器也可通过其上的箭头键手动操作。光电编码器以100 Hz的频率记录数据，并测量角度变化。所有数据均以二进制格式存储。
实验者利用软件中的顺序训练阶段，将大鼠从适应阶段训练至以预定角度和成功率完成旋后动作。在适应阶段，将旋钮操作装置置于开口窗内，不附加任何配重。经过一周高度监督的训练后，大鼠会将旋钮与奖励关联，并开始独立转动旋钮。一旦大鼠能够独立转动，旋钮便以0.25 cm为增量逐步回缩，直至回缩至1.25 cm时大鼠仍能独立转动。随后，配重以1 g为增量，从3 g逐步增加至6 g。自动化训练阶段进一步训练动物在6 g配重下将旋钮旋至75度。该阶段训练主要为非监督形式；一旦大鼠以正确动作模式掌握任务（如下所述），其便可持续正确完成旋后动作。当大鼠以75%的成功率（命中率）完成75度旋后时，即视为训练完成8。本文描述了一种典型的训练方案，并提出了我们遇到的常见问题的解决方案。我们展示了代表性成功与失败大鼠在训练方案中的进展过程，并证明该任务可经修改用于显示轻微或更严重功能缺陷所导致的功能障碍。

<table><tbody><tr><td>基础笼具 - 大鼠模型</td><td>Vulintus</td><td>MotoTrak Rat System</td><td>N/A</td></tr><tr><td>控制器</td><td>Vulintus</td><td>MotoTrak Rat System</td><td>N/A</td></tr><tr><td>行为模块</td><td>Vulintus</td><td>MotoTrak Rat System</td><td>旋前任务，甲基丙烯酸甲酯双限位旋钮</td></tr><tr><td>颗粒分配器 - 45mg</td><td>Vulintus</td><td>MotoTrak Rat System</td><td>N/A</td></tr><tr><td>自动定位器</td><td>Vulintus</td><td>MotoTrak Rat System</td><td>N/A</td></tr><tr><td>45 mg，巧克力味，每盒50,000粒</td><td>Bio-Serv</td><td>F0299</td><td>N/A</td></tr><tr><td>HP Z230 Tower 工作站</td><td>HP</td><td>N/A</td><td>Intel Xeon CPU E3-1225 v3 @ 3.20 GHz，16GB 内存，1TB 硬盘。最低要求：8GB 内存，多核处理器</td></tr><tr><td>灵巧性分析软件</td><td>Burke Medical Research Institute</td><td></td><td>用于数据分析的 Matlab 软件</td></tr><tr><td>环境控制箱</td><td>WF Fisher and Son</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

旋钮旋后任务：一种评估大鼠前肢功能的半自动化方法

The Knob Supination Task: A Semi-automated Method for Assessing Forelimb Function in Rats

准确测量动物模型灵巧性的任务对于理解手部功能至关重要。目前用于测量大鼠行为灵巧性的任务主要依赖对抓取动作或食物操控的视频分析。尽管这些任务易于实施，并且在多种疾病模型中具有良好的稳健性，但其评估过程对实验人员而言具有主观性且耗时费力。通过自动化传统任务或开发新的自动化任务，可使这些任务更加高效、客观且具备量化能力。由于大鼠的灵巧性低于灵长类动物，中枢神经系统（CNS）损伤所导致的灵巧性缺陷较为细微；然而，前肢旋后动作在啮齿类动物中受到显著影响，且该动作在灵长类动物手部功能中至关重要。因此，我们设计了一种半自动化的任务，用于测量大鼠前肢的旋后功能。实验中，大鼠被训练去伸手抓握一个 knob 形状的操作杆，并将其以旋后方式转动以获得奖励。大鼠通常可在 20 ± 5 天内掌握该技能。训练初期需要高度监督，但大部分训练过程可在无直接监督下完成。该任务能够可靠且可重复地捕捉损伤后的细微功能缺陷，并能准确反映临床恢复曲线所呈现的功能恢复情况。数据分析通过专用软件在设计直观的图形用户界面中完成。我们还提供了训练过程中常见问题的解决方案，并证明在训练早期对行为进行微小纠正即可促进旋后动作的可靠习得。因此，knob 旋后任务为评估大鼠灵巧性中这一关键运动提供了高效且定量的方法。

在训练初期，实验人员需要花费较多时间来塑造大鼠的行为。随着大鼠逐渐将前肢旋后动作与奖励关联起来，实验人员实际操作所需的时间随之减少（图3A）。在适应阶段、奖励关联阶段以及配重训练阶段，每次训练均需完成完整的30分钟任务时长。然而，当大鼠能够使用6 g重量完成旋后动作后，随着其旋后角度的增加，任务时长逐渐缩短至约15分钟。最终，当大鼠达到基线水平时，任务所需时间降至最低；此时实验人员仅需将大鼠放入行为箱并启动程序即可。实验人员可同时操作的大鼠数量在不同阶段有所不同：奖励关联阶段最多可同时处理2只大鼠，配重训练及达到基线前的训练阶段最多可同时处理4只大鼠，而在基线评估和损伤后测试阶段，则可根据行为箱的数量同时处理任意多只大鼠。平均而言，75%的大鼠（n = 56）能够成功掌握该任务。
当大鼠已将前臂旋后动作与奖励建立关联后，其旋后角度呈现正向进展（图3B）。在图3B中，大鼠在第3天至第7天期间，配重从3 g增加至6 g。完成配重训练后，从第7天到第9天进入短暂的适应性训练阶段，期间旋后角度从26度增加至30度。由于此阶段变化较小，从第9天到第18天采用了静态阈值。在此期间，大鼠在8天内从30度稳步增加至75度。整个训练过程中存在日间变异，尤其是第12天和第14天。但总体而言，旋后角度呈上升趋势。在适应后第17天结束时，大鼠记录了其首次基线值，又经过四个训练阶段后，完成了基线评估。从适应阶段开始至记录第四次基线值，整个训练方案平均耗时20 ± 5天。
在观察训练方案理想进展过程的同时，观察不成功的进展过程同样重要（图4）。在图4A中，橙色线条代表一只成功完成方案的大鼠，蓝色线条代表一只未成功的大鼠，灰色线条代表另外六只成功的大鼠。成功的大鼠在15 ± 0.6天内达到基线水平（n = 7）。代表性成功大鼠采用1点钟方向抓握方式，而未成功的大鼠则采用3点钟方向抓握方式。两只大鼠均在2天内建立了将旋钮与奖励关联的行为。此外，在加入配重后的前四天内，两只大鼠均表现出相似的旋前角度（图4A）变化趋势。然而，此后成功大鼠的行为开始与未成功大鼠出现分化。这是因为未成功大鼠的抓握方式在此前未能得到纠正（见图2）。
对于成功的实验大鼠，旋前角迅速上升，开始在50至60度之间趋于平稳，随后继续稳步上升至75度左右。然而，对于不成功的实验大鼠，旋前角的增长较为缓慢。当大鼠的旋前角在约20度处趋于平稳时，尽管研究人员通过手动喂食等方式继续鼓励其进一步旋前，但大鼠最终对该任务失去兴趣，在适应后第15天左右旋前角迅速下降。尽管在适应后第17天后略有恢复，该大鼠仍难以将旋前角维持在25度以上。若某大鼠在第20天仍未达到基线水平，我们即判定该大鼠为不成功，并将其退出实验研究。
除了旋后角度外，还可以对成功与失败的大鼠的旋后波形（图4B-D）进行视觉检查。在进行视觉检查时，我们关注以下几个波形特征：波形斜率、潜伏期以及试验时间窗口内的峰值数量。波形斜率定义为曲线从起始点到峰值点之间的导数。潜伏期定义为试验开始时刻与曲线跨越触发阈值时刻之间的时间间隔。最后，峰值通过计算导数以确定试验时间窗内的局部最大值来识别。此前我们发现，波形斜率（即速度）是评估旋后动力学的一个可靠指标，并且对细微的功能缺陷具有敏感性8。
在开始使用6 g进行旋后训练后的前三分之一阶段（图4B），成功的大鼠（图4B1）表现出单一波形，峰值接近20度，而未成功的大鼠（图4B2）则表现为双转向，即出现两个峰值，第一个峰值接近10度，第二个峰值接近5度。在训练的中期三分之一阶段（图4C），成功的大鼠（图4C1）峰值角度从20度增加到50度，波形更明显，呈单一峰值曲线；相比之下，未成功的大鼠（图4C2）峰值角度仅略微增加至20度，但动作形态有所改善，此时仅使用一次转向。在训练的最后三分之一阶段（图4D），成功的大鼠（图4D1）表现出非常显著的单一波形，峰值约为65°，而未成功的大鼠（图4D2）峰值角度为20度，并在2秒时出现另一个15°的附加峰值。这再次清楚表明，随着训练难度增加，该大鼠无法纠正其3点钟方向的抓握方式，因而无法正确完成旋后动作。即使该大鼠未被排除在研究之外，并最终可能达到75度的旋转角度，仍会存在疑问：其动作是否真正实现了旋后，还是通过代偿机制实现的伪旋后。
最后，旋后任务可检测多种类型损伤后的功能障碍，包括对锥体束（人类自主运动的主要通路）进行切断损伤，以及通过内皮素注射造成前肢运动皮层损伤(图5) 8,10,22。锥体束切断组大鼠（紫色，n = 8）被训练至在6 g负荷下至少完成75°的旋后动作，成功率不低于75%；而皮层损伤组大鼠（绿色，n = 10）则被训练至在7.5 g负荷下完成60°旋后，成功率不低于75%。两组大鼠在损伤后成功率均显著下降（图5A）。锥体束切断组大鼠的成功率从损伤前的90% ± 2% 下降至14% ± 8%；皮层损伤组大鼠的成功率从76% ± 1% 下降至10% ± 3%。至第6周时，两组大鼠仍存在明显功能障碍：锥体束切断组成功率为34% ± 11%，皮层损伤组为16% ± 7%。在旋后角度方面，两组从损伤前到损伤后均出现下降（图5B）。由于基线旋后角度标准不同，锥体束切断组的损伤前旋后角度（85° ± 2.9°）高于皮层损伤组（67° ± 0.52°）。损伤后，锥体束切断组下降至38° ± 10°，皮层损伤组下降至27° ± 2.9°。
<img alt="行为研究用旋后装置示意图，显示大鼠任务阶段及任务控制软件界面。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56341/56341fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：旋后任务描述。（A）将大鼠置于一个有机玻璃箱中，箱体上设有开口，大鼠通过该开口伸出肢体并抓握旋钮，随后必须完成前臂旋后动作以转动旋钮。旋钮设有两个限位装置，防止旋后角度超过100°。旋钮还连接带有配重的滑轮系统，产生一定扭矩，大鼠需克服该扭矩才能完成旋后动作。旋钮连接一个光学编码器，可精确测量角度，分辨率达0.25°。该光学编码器连接至微控制器，微控制器再与计算机相连，由计算机控制任务执行。当达到成功标准时，计算机向微控制器发送信号，触发音频反馈并从喂食器中释放一粒食物奖赏。微控制器还控制自动定位器的位置，其位置在0至1.25 cm之间变化，具体由计算机设定的训练阶段决定。（B）大鼠完成任务时经历三个连续动作：通过开口伸出肢体、以握力抓握位于1点钟位置的旋钮，并完成旋后动作。（C）旋钮旋后任务由控制软件管理。实验人员输入受试动物名称并选择训练阶段，程序则自动设定相应参数。单次成功旋后试验的波形以蓝色显示，成功与失败试验的序列分别以绿色和红色表示。若在规定时间窗口内旋后角度超过设定的命中阈值，则控制软件将该次试验标记为成功；否则标记为失败。该程序控制一个实验箱。每台计算机可同时运行四个此类程序。本图经改编自 Sindhurakar et al., 2017, Neurorehabilitation and Neural Repair8。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56341/56341fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="前肢抓握与操作方法表格；用于动物旋前研究的抓握位置及解决方案。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56341/56341fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：旋前运动。 训练方案中常见的正确与错误旋前运动的示意图及描述。正确的运动可实现真正的旋前，而错误的运动则包含可能阻碍真正旋前的代偿机制。图中还提供了纠正不正确运动的建议解决方案。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56341/56341fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="20天内负重训练对旋后角度影响的时间线与图表；行为学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56341/56341fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：训练方案。（A）标准时间线。共有五个训练阶段，总计持续约25天：适应期（5天）、奖赏关联期（1–3天）、负重训练期（3–4天）、基线训练期（8–12天）和基线评估期（2–4天）。时间线上的线条图案表示实验人员在每次训练会话中所需投入的任务时间。随着训练方案的推进，每次任务所需时间逐渐减少。（B）大鼠从奖赏关联到基线评估期间旋后能力的总体进展。总体而言，大鼠的表现呈正向线性进展并趋近基线水平，但如图所示，在整个训练过程中，大鼠的表现存在个体差异。在完成负重训练后，进入一段适应性训练阶段，期间根据大鼠的实际表现动态调整旋后角度的阈值。适应性训练之后采用固定阈值范式，直至大鼠达到基线水平。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56341/56341fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="旋后角度分析图；时间与角度关系；成功与失败结果对比；实验数据" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56341/56341fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4： 成功与失败的任务习得 (A八只大鼠在整个训练过程中的旋后角度进展，其中七只成功，一只失败。选取一只达到基线标准的成功大鼠（橙色）和一只失败大鼠（蓝色）作为典型案例进行进一步分析。在适应后的前七天训练中，成功与失败大鼠的旋后角度进展相似。至适应后第11天，成功大鼠已能够完成旋后动作 55° 而未成功的那只大鼠则呈旋后位 25°在适应后第15天，表现成功的 rats 表现出显著的上升趋势，而表现不成功的 rats 则在表现上出现下降。在适应后的训练最后三分之一阶段，表现不成功的 rats 的表现已达到平台期 30° 而成功的大鼠正在进行旋后动作 80°. (B加入6克配重后训练前三分之一阶段的平均波形（黑线），以及成功（橙色）与失败（蓝色）情况下的95%置信区间。B1成功的大鼠——单个峰出现在周围 20°. (B2) 失败的大鼠样本——出现双峰且全局最大值为 10°. (C) 添加6 g配重后训练第二个三分之一阶段的成功（橙色）与不成功（蓝色）95%置信区间内的平均波形（黑线）。C1) 大鼠成功——单峰 45°. (C2) 大鼠实验未成功——具有单个峰的改进形式 20°. (D加入6克配重后，训练最后三分之一阶段的平均波形（黑线），以及成功（橙色）与失败（蓝色）的95%置信区间。D1成功的大鼠——明显的单峰 65°. (D2) 大鼠实验失败——出现双峰，全局最大值位于 20°. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56341/56341fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="锥体束切断术与皮层损伤；成功率，旋后角度分析图，追踪结果的周数。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56341/56341fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：不同损伤模型对任务表现的敏感性。 锥体束切断组大鼠（紫色，n = 8）被训练在6 g负载下完成75°以上的旋后动作，成功率不低于75%；而皮层损伤组大鼠（绿色，n = 10）则被训练在6 g负载下完成60°以上的旋后动作，成功率不低于75%。图中数据表示均值 ± 标准误。(A) 锥体束切断损伤与皮层损伤的成功率对比。两种损伤模型在术前与术后（第1周）的成功率均出现显著下降。锥体束切断组的成功率从0.90 ± 0.02下降至0.14 ± 0.08，皮层损伤组则从0.76 ± 0.01下降。(B) 锥体束切断与皮层损伤的旋后角度对比。两组在术后均较术前出现旋后角度下降：锥体束切断组下降至38.2° ± 10.1°，皮层损伤组下降至27.1° ± 2.9°。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56341/56341fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文描述了一种可量化大鼠前臂旋后动作的半自动化任务。大鼠伸手抓握并旋动一个球形操作装置。如果旋转角度超过用户设定的阈值，大鼠将获得一粒食物奖励。与传统任务相比，该任务提高了实验通量、对损伤的敏感性以及结果的客观性。

准确测量动物模型灵巧性的任务对于理解手部功能至关重要。目前用于测量大鼠灵巧性的行为学任务……

该行为学实验的总体目标是训练大鼠将旋钮从掌心向下转动至掌心向上，这一动作称为旋后。该工具用于在损伤或干预前后测试运动系统功能。我们开发此任务以检测大鼠的皮质脊髓功能。我们发现，旋钮旋前任务对皮质脊髓束损伤的敏感性高于当前的灵巧性任务（如颗粒物抓取任务）。该任务为半自动化，具有定量、客观和高通量的特点。通过量化旋前动作，该任务可测量一种具有重要临床意义的运动，用于评估关键的神经通路。演示该实验操作的是我们的实验室主管兼研究技术员 Thelma Bethea。在整个实验过程中，每天对大鼠进行两次训练，分别在上午和下午各一次，两次训练之间至少间隔数小时。首先让大鼠适应环境，使其熟悉测试箱以及实验人员的抓取操作。首先，设置实验箱。通过按自动定位器上的向下箭头键，将旋钮装置完全缩回。然后将大鼠放入行为实验箱中，持续 15 分钟。15分钟后，用手抓取每只大鼠至少5分钟，使大鼠熟悉实验操作者。在开始实验前，连续重复此操作五天。下一阶段是建立奖励关联。目标是训练大鼠将转动旋钮与获得食物奖励联系起来。首先，打开软件，在“名称”下输入大鼠的编号，然后将阶段设置为 K1：旋钮塑形（无滑轮）。这样，在两秒的奖励窗口期间，只要大鼠将旋钮转动超过三度，即可获得食物奖励。接下来，将大鼠放入行为学实验箱，然后按“开始”以启动实验。通过手动释放两到三粒食丸并轻敲奖励槽所在位置的箱壁，使大鼠熟悉奖励槽的位置。一旦大鼠知晓奖励位置后，仅当大鼠移动到孔洞前方时才手动释放一粒食丸。这将使奖励与孔洞相关联。当大鼠能够稳定地朝孔洞移动以期待获得食丸奖励时，开始训练大鼠与操作杆进行互动。通过在操作杆附近放置一颗45毫克的食丸来引导大鼠与其接触。如果此方法无效，可直接将颗粒粉尘涂抹在操作装置上。当大鼠远离孔洞时，轻敲操作装置附近的箱体以重新引导其注意力。仅当大鼠用手触碰旋钮时才给予奖励，若其用嘴啃咬或用鼻子触碰操作装置则不予奖励。当大鼠连续获得10次奖励后，使用自动定位器上的向下箭头键将操作杆回撤0.25厘米。继续以0.25厘米为增量调整操作杆的位置，直至其距离孔洞1.25厘米。此步骤为奖励关联的最终目标，一旦大鼠在连续两次训练中均能达到该要求，即可进入配重训练阶段。训练半小时后，通过在软件中按下“停止”来结束训练。为设置配重训练，请先将一个3克的配重块放置在操纵杆的L形连接点上。然后将配重绳穿过滑轮，直至配重块自由悬挂。运行实验时，首先打开软件，输入大鼠的名称，并将阶段设置为 K2：旋钮塑形滑轮。此设置使操作装置距离孔洞 1.25 厘米。接着，将大鼠放入行为箱中，然后在软件中按下“开始”以启动实验。完成100次或更多成功试验后，通过在软件中按下“停止”来结束本次训练。当大鼠连续两次训练的成功试验次数均超过100次时，在下一次训练中将配重质量增加1克。按照此方案，在平均六次训练内逐步将配重增加至6克。在训练过程中，必须对正确的旋后动作给予奖励，同时逐步纠正错误的旋后动作。对旋后动作的塑造也延续到基线训练阶段。在纠正旋后行为时，应手动限制操作装置的运动，并对即使未成功的正确旋后行为也给予奖励，方法是按下软件上的“Feed”按钮。此时，训练大鼠达到基线标准，即在旋钮上施加6克配重的情况下，以75%或更高的成功率将旋钮旋转75度。设置配重后，在软件中选择KSB4：旋钮训练中位数75最大值选项，该设置将初始阈值设为5度。将命中阈值的下限设为15度，上限设为75度。软件会根据大鼠的身份及其过往表现自动提高旋钮转动的最低阈值，因此在此阶段用户输入被降至最低。30分钟后，结束该次实验。经过大约10天或20次训练后，大多数大鼠完成适应阶段，能够将旋钮转动至平均峰值角度达到75度或以上。基线训练完成后，将大鼠推进到下一阶段的训练，该阶段由软件阶段K27:75 Degrees控制。在此阶段，以30分钟或100次试验中先到达者为准，按下停止按钮以结束训练 session。每只大鼠在此训练阶段需持续训练，直至能够连续完成四次基线测试，且成功率不低于75%。达到标准的大鼠即可用于后续实验操作，并以此任务作为前肢功能的评估指标。在56只大鼠的样本中，75%成功掌握了初始任务。这一阶段包含最多的实际操作训练。接下来，大鼠在第七天开始使用六克配重，随后用10天时间学习旋转旋钮，其旋前角度总体呈上升趋势。到第17天时，大多数大鼠记录到了首次基线值，若某只大鼠在第20天仍未达到基线标准，则将其剔除出研究。一只不成功的大鼠可能在最初几天表现出一定的进展，但由于抓握方式不正确，无法与群体同步前进。在训练的前三分之一阶段，大鼠可能开始出现前臂旋后动作，但其动作的波形图可显示，它需要完成两次旋转才能达到成功大鼠仅需一次旋转即可完成的动作。在训练的中间三分之一阶段，正常大鼠的峰值角度会从20度显著增加至50度，并呈现出明确的单峰曲线，而未能正确完成旋后动作的大鼠，其峰值角度的增加则仅表现为轻微上升。训练进行到后期三分之一阶段时，应出现非常明显的单一波形；然而，训练不成功的 rats 可能表现出远低于规定成功标准的峰值角度，同时还伴有多个峰值。这些 rats 虽然最终可能学会完成任务，但可能依赖非旋前代偿动作，因此不建议将其用于后续研究。观看本视频后，您应能够充分掌握如何训练 rats 在基线水平执行前肢旋前动作，并能识别和纠正错误的旋前运动。在大鼠学习旋后动作的过程中，务必保持高度警觉和细致观察。在早期阶段纠正旋后行为对本训练方案的成功至关重要。总体而言，该方案旨在节省时间、提高效率。当大鼠达到基线水平后，实验人员只需将大鼠放入箱中，启动软件，待其完成实验阶段后将其取出即可。除本视频外，我们实验室网站上还提供多种相关资源。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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