利用下一代测序技术检测循环肿瘤DNA中的稀有突变

该技术的总体目标是检测循环肿瘤DNA（ctDNA）中低频突变，为临床医生提供一种强大的工具，用于肿瘤诊断以及监测治疗过程中肿瘤动态变化。通过检测ctDNA，可回答患者携带哪些类型突变这一关键问题，例如单核苷酸变异、插入缺失、拷贝数变异以及结构变异。该技术的主要优势在于具有高灵敏度和特异性，能够精确检测ctDNA中的低频突变。

演示实验操作的是我实验室的技术员 Yuliang Yang。首先，在采集管中抽取 10 毫升外周血，并轻轻上下颠倒管子 6 至 8 次，以充分混匀管内物质。将含有血液样本的采集管在 6 至 37 摄氏度条件下保存，最长可保存 72 小时。

在室温下以1,600 ×g离心收集管10分钟。然后使用一次性移液器将上清液或血浆从管中转移至四个洁净的、已正确标记的2毫升离心管中，注意不要扰动沉淀。使用洁净的一次性移液器将1毫升细胞转移至一个已正确标记的2毫升离心管中。

在进行基因组或基因组DNA（gDNA）提取前，将细胞储存在零下20摄氏度或更低温度下。接下来，在4摄氏度条件下，以1,600 ×g离心血浆10分钟。然后将血浆转移至正确标记为“血浆”的洁净离心管中，管底保留约0.1毫升残余体积，以避免污染。

在分离过程中应避免将血沉棕黄层混入血浆。否则，从细胞中提取的大量DNA片段可能会稀释循环肿瘤DNA（ctDNA），从而影响检测的灵敏度。使用 commercially available kit，按照制造商说明书从3 mL收集的血浆中提取游离DNA（cfDNA）。

然后，使用试剂盒，按照制造商说明书从200微升白细胞中分离基因组DNA（gDNA）。为了通过超声处理片段化gDNA对照样品，将1微克gDNA样品溶于100微升Tris-EDTA缓冲液中，置于洁净的超声管内。将超声程序设置为每次超声30秒，间歇30秒，共进行12个循环，总计12分钟。

确认产物含有200至250个碱基对片段后，将全部片段化产物转移至一个新的1.5毫升离心管中，管内含有150微升磁珠，孵育5分钟以筛选正确大小的片段。接着，将离心管置于磁力架上30秒，移除上清液。然后，在保持离心管始终置于磁力架上的同时，加入200微升 freshly prepared 80%乙醇洗涤磁珠。

将珠子孵育30秒后去除上清液，并重复洗涤步骤。将离心管保持在架子上并打开管盖，使珠子空气干燥。然后通过向珠子中加入32微升10毫摩尔的Tris-HCl来洗脱DNA片段。

根据制造商的说明进行末端修复反应：向一个无菌无核酸酶的离心管中加入7 µL反应缓冲液、3 µL酶混合物、30 ng cfDNA，并加入双蒸水至总体积为60 µL。在另一个离心管中加入相同组分，但以1 µg gDNA替代cfDNA。将混合物置于PCR仪中，于20 °C孵育30分钟，随后在65 °C孵育30分钟，期间不加热盖子。

孵育结束后立即向管中加入30 µL连接主混合液、1 µL连接增强剂和4 µL独特的测序接头。将反应体系置于热循环仪中，在20 °C孵育15分钟，无需加热盖子。涡旋振荡以重悬磁珠，并将磁珠在室温下放置至少30分钟。

然后将87 µL重悬的磁珠加入连接反应体系中，通过移液器吹打混匀，随后在室温下孵育样品5分钟。磁珠洗涤并空气干燥后，加入20 µL 10 mmol/L Tris-HCl，从磁珠中洗脱DNA目标片段。

加入20 µL接头连接的DNA片段、5 µL i7索引引物、25 µL文库扩增预混液，以及双蒸水至总体积为50 µL。对接头连接的cfDNA或gDNA进行PCR扩增。然后向PCR富集后的DNA中加入45 µL悬浮磁珠。

用移液器上下吹打混匀样品，并孵育5分钟。去除上清液并洗涤磁珠后，使用30 µL 10 mM Tris-HCl洗脱带有接头的DNA片段。为进行靶向DNA捕获，在无菌离心管中加入1.5 µg混合文库、P5阻断剂100P和P7阻断剂100P各8 µL，以及5 µL浓度为1 µg/µL的cock one DNA，对样品进行封闭。

使用设定在60摄氏度的真空浓缩仪干燥管内物质。通过加入8.5 µL的2X杂交缓冲液、2.7 µL杂交增强剂和1.8 µL无核酸酶的双蒸水，将DNA捕获探针与文库进行杂交。用移液器吹打混匀后，在95摄氏度的恒温混匀仪中孵育10分钟。

然后立即加入4 µL定制探针。将样品置于恒温混匀仪中，在65 °C下孵育4小时，同时将盖子加热至75 °C。将杂交后的目标DNA与链霉亲和素磁珠孵育，随后洗涤磁珠以去除未结合的DNA。

根据制造商的说明使用商用试剂盒，获得最终体积为 20 µL 的重悬磁珠，其中含有捕获的 DNA 片段。从链霉亲和素磁珠上洗去未结合 DNA 的步骤应迅速进行，否则可能影响目标 DNA 的捕获效率。

使用商品化试剂盒，按照制造商说明书，以2微摩尔的骨架寡核苷酸进行PCR扩增捕获的DNA片段。最后，将45微升悬浮磁珠直接加入PCR产物中，通过加入30微升10毫摩尔Tris-HCl洗脱液，富集与磁珠结合的扩增目标DNA片段。对片段进行定量，并根据文本方案进行测序和数据分析。

该表格概述了与传统方法相比，ER-seq 将覆盖深度提高了 23%。这归因于其对 cfDNA 分子的高效回收，从而显著增强了对稀有突变的分析能力。此外，ER-seq 中使用的独特测序接头能够轻松区分天然重复序列和 PCR 诱导的重复序列。

如本表中所述的检测结果，基于ER-seq的分析在EGFR p.L858R检测中一致性达到100%，且检测频率略高于传统分析方法。尤为重要的是，ER-seq分析能够检测出其他相对低频的突变，包括EGFR p.T790M，而该突变由于背景噪声较高，传统分析方法无法识别。一旦掌握该技术，若操作得当，可在48小时内完成。

在进行该实验操作时，重要的是要注意避免在提取、文库制备以及杂交后的磁珠洗涤过程中损失极微量的cfDNA。观看本视频后，您应能够充分理解如何从患者样本中收集、制备并基于已鉴定的独特序列对ctDNA进行靶向富集以进行测序。该技术建立后，为液体活检领域的研究人员探索更优的临床决策实践开辟了道路。