Name: 蜜蜂致死农药暴露对蜂群水平的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 了解如何通过测量成年蜜蜂质量、幼虫区和食物资源来客观量化蜂群健康状况，以评估亚致死农药暴露对蜜蜂的影响。该方法为养蜂学研究提供客观数据。

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作者们衷心感谢 K. Anderson、J.J. Adamczyk、E. Beren、I Carstensen、M. Giansiracusa、B. Mott、N. Holst 和 A.R. Stilwell 在实验设计与实施方面的讨论以及在野外工作中的帮助。

以下所述方案遵循美国农业部农业研究局的动物护理指南。
1. 全面评估
注意：必须进行一次全面评估，以确定 1) 蜂箱各个部分的重量，包括蜂箱盖、覆布、箱体、底板、巢框以及 2) 蜂子和食物资源的数量。将所有蜂箱部件的重量相加，并从蜜蜂全部在箱时的总重量中减去，即可得到所有成年蜜蜂的重量。对于重量基本恒定的蜂箱部件（如蜂箱盖、底板和箱体）的重量数据，可予以保留并在未来的评估中重复使用，从而加快评估速度。在研究开始时或接近开始时进行一次全面评估。由于木质部件的含水量可能发生变化24，因此建议在长时间间隔后重复进行全面评估。每次评估时，可称量蜂箱的某一部分（例如蜂箱盖），以估算其他蜂箱部件的变化。若附近有其他蜂箱且存在盗蜂风险，在评估期间应在工蜂和蜂箱周围放置带纱窗的隔离室。
<ol>
	<li>称量蜂箱所有部件。使用精度为1 g或更高的秤。
	<ol>
		<li>称量蜂箱顶部的盖子、内盖、蜂王隔离栅、糖浆饲喂器以及任何其他部件。</li>
		<li>使用刮刀或蜂箱工具，小心移除并称量框架顶部的任何食物或处理材料（例如蛋白质补充剂或油脂饼），之后如有必要，将其放回原位。</li>
		<li>将一个空蜂箱（下文称为&#34;临时箱&#34;）放置在蜂箱旁边，作为框架的临时过渡位置。将临时箱置于平坦表面（如箱盖或底板）上，以防止蜜蜂特别是蜂王从箱中掉落至地面。</li>
		<li>快速而轻柔地将框架（最好每次移动两到三个）转移至临时箱中，保持其在原箱中的顺序。当所有框架转移完毕后，将残留的蜜蜂轻轻抖落到临时箱的框架上，并称量该蜂箱箱体。</li>
		<li>如果该箱为最底层箱体，在将蜜蜂抖入临时箱后，称量底板、巢门调节器及任何其他蜂箱部件。在移动框架前，使用永久性记号笔为框架编号，以便后续按原始方向放回。</li>
		<li>重新安装底板、巢门调节器、育虫箱及其他设备。将框架从临时箱按原始顺序和方向移回原育虫箱中，注意避免对蜂群造成不必要的干扰。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从箱体一端取出一个框架，目视检查其两侧是否有蜂王。若发现蜂王，应将其轻柔地放置在已检查过的区域，以避免进一步干扰。尽可能将工蜂轻轻但有力地抖入框间空隙中，而非抖在框架顶部。</li>
	<li>称量该框架，并使用数码相机拍摄其两侧的完整图像，尽量靠近框架以清晰分辨封盖的幼虫和蜜房，但保持足够距离以确保整帧均被纳入画面。拍摄时应由另一名工作人员手持框架。
	<ol>
		<li>在秤上使用“框架支架”（任何可在称重时保持框架直立且不损伤蜂巢的夹具）。同时称量蜂箱内的糖浆饲喂器。 
		注意：照片中框架的尺寸将用于将表面积从相对测量值转换为绝对测量值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将框架按原始位置和方向放回蜂箱中。在放回前一个框架之前，先取出下一个框架，以便在箱体内留出更多空间，安全地抖落蜜蜂。依次检查蜂王是否存在，抖落蜜蜂，称重，拍照，并放回每个后续框架，直至所有框架处理完毕。</li>
	<li>若蜂箱包含两个或更多箱体，应先称量并拍摄最底层箱体的框架。
	<ol>
		<li>依次移除上层箱体，并按与原始顺序相反的顺序堆叠在蜂箱旁。当底层箱体评估完成后，将下一个待评估箱体置于底层箱体之上，将临时箱置于剩余未评估箱体的顶部，并如上所述将第二层箱体的框架转移至临时箱中。评估完成后，将框架按原始顺序和方向移回原箱体。 
		注意：通过优先检查下层箱体，抖落的蜜蜂将落入一个不再被扰动的蜂箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在蜂群近期不活跃时段（例如夜间或评估当天蜜蜂尚未起飞的清晨）获取蜂箱的总重量。该重量代表整个蜂群，包括外出采集蜂。</li>
	<li>通过累加所有蜂箱部件（木制结构、框架、蜂粮等）的重量，然后从上一步获得的&#34;蜂箱总重量&#34;中减去该总和，计算成年蜂的总质量。两者之差即为成年蜂质量的估算值。 
	注意：完成完整评估后，若非框架部件（如箱体和底板）的重量无明显变化，后续评估可采用部分评估方式。部分评估耗时更短。</li>
	<li>对于单箱蜂群的部分评估，无需将框架转移至临时箱，直接取出、拍照、称重并放回各框架即可。对于多箱蜂群，遵循上述步骤（步骤1.5）进行操作，但无需称量蜂箱箱体。</li>
</ol>
2. 将蜂箱安装到称重仪上
注意：本研究中使用的蜂箱秤为室外电子台秤，最大量程至少为 100 kg，传感器精度约为 1/5000，并具备温度补偿功能，秤盘尺寸为 460 mm × 610 mm。这些秤连接至一个 24 VDC 显示器和一个 12 位数据采集器。显示器输出可以是数字或模拟信号；本研究所用的秤系统输出单位为 mA，需通过校准曲线将数据转换为 kg。
<ol>
	<li>将秤安装在坚固、水平的表面上。 
	注意：使用混凝土块、陶瓷块或窑干木材垫高秤，可防止秤体及电气连接部分接触土壤或水分。</li>
	<li>用塑料、布料、纸板或其他材料覆盖秤的顶部托盘，以减少过度的光线反射以及蜂箱入口的受热。</li>
	<li>确保相邻蜂箱的入口朝向不同方向，以减少蜂群间的迷巢现象。</li>
	<li>安装蜂箱秤后应进行校准，并在之后定期重新校准，尤其是当秤被移动时。
	<ol>
		<li>将秤的校准砝码置于称重托盘上，记录秤的输出值。确保总重量超过秤最大量程的50%。 
		注意：如果秤的输出单位为电压或电流，而非质量单位，则需利用校准曲线的斜率和截距（即托盘上已知总重量与秤输出值之间的关系）将输出值转换为质量单位。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 温度传感器的安装
注意：本研究中使用的温度传感器有两种类型：1）热电偶，通过电缆直接连接至由电池供电的数据记录仪（若电缆足够长，可将数据记录仪置于蜂巢内部或外部）；2）小型电池供电设备，内置传感器和数据记录仪，需从蜂巢中取出后才能下载数据。
<ol>
	<li>获取一种能够置于蜂箱框间、耐受蜂巢内部高湿度环境，并具有足够电池续航和存储容量（或可通过有线或无线连接进行访问）的温度传感器。</li>
	<li>将可能受到蜂蜡或蜂胶影响的传感器放入保护性容器中，例如组织包埋盒（一种小型一次性塑料盒，带卡扣式盖子和通风槽）。该保护性容器可减少蜂蜡和蜂胶的积聚，避免堵塞传感器的数据端口或影响数据下载。</li>
	<li>将传感器固定在箱体中央巢框上梁正下方，以获取有关育虫活动的有效数据（见下文）。 
	注意：可在装有传感器的容器上连接一小段金属丝，并用订书钉将金属丝固定在巢框顶部，使容器沿一侧垂挂。直接放置在育虫区上的传感器可能干扰幼虫和巢脾的正常维护；而放置在靠近蜂箱外侧的巢框上，或内盖、箱盖上的传感器，则可能受外部环境影响较大，尤其在低温天气时更为显著。</li>
</ol>
4. 糖浆处理的制备
注意：每次饲喂当天需使用分析级吡虫啉现配处理溶液。吡虫啉水溶性很高，因此可轻松溶于糖浆中；某些杀虫剂水溶性较低，应采用其他方法施用。每份处理溶液配制量为1 kg，使用1 L塑料瓶按如下方式施用：
<ol>
	<li>混合对照（无农药）蔗糖溶液 1:1 w:w（例如 500 g 蔗糖：500 mL 蒸馏水。将蔗糖置于大烧瓶中，加入蒸馏水，使用置于加热板上的磁力搅拌器（温度不超过 60 °C）搅拌溶解。</li>
	<li>对于将包含吡虫啉的溶液，按上述方法配制蔗糖溶液，但需预留100 mL &#34;短&#34;以容纳相应体积的吡虫啉 &#34;刺突&#34; 溶液
	<ol>
		<li>将500 g蔗糖溶解于400 mL蒸馏水中，以便加入100 mL添加物后得到1 kg处理溶液。为便于野外操作，转移900 g &#34;短&#34; 将糖溶液转移至另一瓶子，然后向每个单独的瓶子中加入内标物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用分析天平称取1.0 mg杀虫剂，加入100 mL蒸馏水，用搅拌棒在不加热条件下溶解，配制10 ppm的吡虫啉储备溶液。 
	注意：为避免静电问题，应将吡虫啉称量至小型非反应性塑料容器中，并将这些容器直接放入溶液内。搅拌溶液，待吡虫啉完全溶解后取出容器。</li>
	<li>对于5 ppb溶液，将0.5 mL储备液加入99.5 mL蒸馏水中，配制成100 mL加标溶液。将此加标溶液加入900 g短链蔗糖溶液中，得到1 kg的5 ppb糖浆。对于20 ppb溶液，将2.0 mL储备液加入98.0 mL蒸馏水中，制备100 mL加标溶液。对于100 ppb溶液，将10.0 mL储备液加入90.0 mL蒸馏水中，制备加标溶液。</li>
</ol>
5. 蜂箱的准备与处理方法的施用
<ol>
	<li>在施用处理前和处理后评估蜂群，以确定成年蜂和蜂蛹的数量。采集感兴趣的样品（如蜂蜜、蜂粮、蜜蜂或蜂蜡），以测定处理前的农药本底水平。
	<ol>
		<li>采集蜂蜡样品时，打开一个50 mL离心管，选择一段无蜂蛹的蜂巢，将管口沿蜂巢刮取，直至收集到所需量的蜂蜡。避免用手接触管内的蜂蜡。盖上管盖并标记试管。将巢框放回蜂箱。</li>
		<li>采集蜂蜜或花蜜时，打开离心管，将管口紧贴含有蜂蜜或花蜜的蜂巢部位，让液体自然流入管中，避免刮擦以减少蜂蜡混入样品。盖上管盖并标记试管。将巢框放回蜂箱。</li>
		<li>采集蜂粮时，选择含有蜂粮的巢框，使用洁净的金属或塑料刮刀取出数个蜂房中的蜂粮内容物，并将其放入离心管中。将巢框放回蜂箱。 
		注：每框通常需要数分钟才能采集到足够样品。用于农药分析的典型样品至少需3 g；每个蜂箱应对蜂蜜、蜂蜡和蜂粮在至少2至3个不同位置取样，并将各子样品合并为一个整箱样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>评估后不久（例如次日），移除含有蜂蜜和花蜜但无蜂蛹的巢框，替换为巢础或空的已筑巢框，以促进糖浆储存。 
	注：目的是增加空置储蜜空间和对花蜜的需求。若处理剂需混合于蛋白质补充剂中施用，则可能无需移除食物巢框。</li>
	<li>确保蜂箱配备饲喂器。在处理前评估完成后尽快将糖浆（步骤4.4）迅速倒入饲喂器中进行施用。注意不要将糖浆洒到蜂箱外部，以免其他蜂群的蜜蜂发现并引发盗蜜。 
	注：内部饲喂器可能更有利于减少盗蜜行为；某些农药会影响成年蜂的活动能力，导致处理后的蜂群在防范盗蜜蜂方面警觉性降低9。</li>
</ol>
6. 蜂箱框照片分析
注意：每次蜂巢评估期间均需拍摄框架照片。可使用以下方案从照片中提取信息。
<ol>
	<li>启动一种图像分析软件（例如 ImageJ），该软件允许使用描边工具在照片上选择形状，并测量所选形状的面积。</li>
	<li>调取一个蜂框的数字照片。选择“文件”并点击“打开”。导航至存储照片的文件夹，选择一张用于分析的照片。图像将在 ImageJ 程序中打开，同时 ImageJ 工具栏将被激活。</li>
	<li>从工具栏中选择“多边形”工具。使用鼠标逐个点击蜂框覆有蜂巢的区域的各个角点以定义其范围。当回到起始角点时，形状将自动闭合。</li>
	<li>使用多边形工具定义蜂巢区域后，点击“分析”并选择“测量”；此时将弹出一个新的对话框显示测量结果。使用“面积”列来读取所绘制区域内包含的像素值。 
	注意：首次使用该程序时，需设定希望报告的结果参数。
	<ol>
		<li>在结果对话框中点击“结果”，然后选择“设置测量”。勾选“面积”，取消勾选其他所有选项。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为定义封盖子脾所占区域，选择“自由手绘”工具。在起始点按下鼠标按钮，围绕子脾边缘进行描迹。当回到起始点时，松开鼠标按钮；形状将自动闭合。
	<ol>
		<li>点击“分析”并选择“测量”。如果由于疾病等因素导致子脾分布不连续，可使用“多点”选择工具计数巢房数量。为便于比较，可直接将巢房数量换算为 cm2；通常每 cm2 约有 4.01 个巢房 20。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将描迹所得的子脾区域数值除以蜂框内部总面积数值，得到封盖子脾占蜂框面积的百分比。</li>
	<li>测量具有代表性的蜂框内部面积，建立标准，以便将子脾表面积换算为 cm2。 
	注意：一个标准的郎氏深框蜂脾其表面积约为 880 cm2 20。例如，若发现一个郎氏深框蜂脾内部有 20% 的区域被子脾覆盖，则其表面积为 0.20 × 880 cm2 = 176 cm2。</li>
	<li>汇总整个蜂群的子脾表面积。若需将其换算为质量，可将表面积乘以 0.77 g/cm2 20。</li>
	<li>使用步骤 6.3 至 6.6 所述方法，计算蜂蜜、未封盖花蜜以及储存花粉的表面积。 
	注意：若将花蜜和花粉合并视为&#34;食物储备&#34;，则蜂框的组成可简化为两项（食物储备和子脾）。一个带有塑料基底且蜂巢已筑成的典型郎氏蜂框重量约为 556 g20，因此要计算食物储备的重量，可将空框重量与子脾质量相加，再从实际测得的该蜂框总重量中减去此和值。</li>
</ol>

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</ol>

作者无竞争性财务利益。

正如作物科学家需要准确而精确的数据来评估不同处理对植物生长和产量的影响一样，蜜蜂研究人员也需要准确而精确的数据来评估蜂群的生长和活动情况。当处理效应可能较为微弱且具有长期性时，这类数据尤为重要，例如当蜜蜂暴露于低浓度农药时可能产生的影响。
持续的蜂箱重量数据包含大量关于被研究蜂群生长和活动的信息，以及这些蜂群对外部干扰（如盗蜂行为或向饲喂器中添加糖浆）的响应9。然而，对连续的重量和温度数据进行准确解读，需要定期了解蜂群的规模。在流蜜期期间，可以通过去趋势化后的逐小时数据的日振幅来估算成年工蜂的数量，这是由于采集蜂活动增加所致；但在非流蜜期，这种关系并不适用20。同样，蜂群重量的变化——由采集成功率、食物消耗以及蜂群数量增减（例如蜜蜂死亡）引起——在一定程度上取决于蜂群规模。例如，较小的蜂群可能健康状况良好，但由于采集蜂数量较少，其生长速率和采集蜂生物量可能较低。
确定蜂巢内一个稳定且具有代表性的温度传感器固定位置，对于获得可重复的实验结果至关重要，尤其是在越冬研究中。先前的研究表明，在育雏（底部）箱体中央巢框的上横梁处进行温度监测，其与环境（外部）温度的相关性低于蜂巢中其他多个位置，而更多地受到蜂群自身的影响20。在冬季，蜂群结团区域与环境之间的温差预计较大，因此蜂巢内部不同位置之间的温度差异也应比温暖月份更为显著。此外，蜂群会为了利用食物资源而在蜂巢内移动到不同的位置25,26。本文所述的冬季研究表明，从顶部中央至顶部外侧巢框的水平位置之间温度存在显著差异，而中央巢框上的垂直位置之间差异不显著。巢框之间的水平空气流动相对受限，而沿巢框方向的垂直空气流动则较为通畅，因此预期垂直方向的热量混合更充分。这些结果证实，将传感器置于中央巢框上横梁的位置，能够有效反映蜂群对温度的影响。
如本文所述，蜂群评估方法可解决其中一些问题。通过在蜂群不活跃时段（例如夜间）测量其总重量，并减去蜂箱各组成部分的重量之和，即可估算成年蜂的生物量，该方法不受外出采集蜂数量的影响，因而对评估时间不敏感。利用电子秤记录数据可最大限度减少主观因素，而巢脾照片则提供了永久性记录，因此如有需要，可对卵虫或食物覆盖面积的分析进行复查，从而降低了对分析人员经验水平的依赖。
本文所述方法并非没有误差来源。蜂箱部件应尽可能清除蜜蜂，移除的任何较大蜂巢碎片或其他材料均应在丢弃前称重。木质部件的含水量会随时间变化，空蜂箱会因环境相对湿度的昼夜变化而出现可测量的每日重量波动24。然而，含有蜂群的蜂箱重量变化可能较小，因为蜜蜂倾向于维持蜂箱内部相对恒定的湿度27，从而减弱环境因素的影响。这些方法还依赖于快速操作。一旦蜂箱被拆开，其内部温度和气体条件将发生剧烈变化，低温可能影响蜂子的健康14。在拆解蜂箱时若未使用隔蜂网以防止邻近蜂群的蜜蜂进入，可能引发盗蜜行为，尤其在蜜源匮乏时期更为明显。
这些操作程序有时需要进行调整。尽管研究人员希望尽可能多地收集数据，但在某些情况下，例如需要检查大量蜂箱、盗蜜压力较高或天气条件不理想时，工作人员必须加快工作速度，从而放弃部分数据的采集。如果食物储备的数据并非关键，则仅含有蜂蜜和/或花粉的巢脾，或仅含蜂蜡或巢础的巢脾，应称重但无需拍照。未封盖幼虫和卵的数量对部分研究人员也具有研究价值，这些通常可在巢脾照片中被识别；然而，为避免采样偏差，研究人员必须能够确信在所有照片中均能准确识别这些阶段。通常情况下，在田间条件下拍摄的照片中，仅封盖子脾能够被可靠且一致地识别。关于处理剂的应用，某些蜂群（尤其是接受了较高剂量吡虫啉处理的蜂群）可能会变得迟钝，导致糖浆摄食量减少以及蜂巢防御能力下降。若蜂群在5至7天内未能消耗其糖浆，则应将糖浆移除、称重并丢弃（以防止因发酵造成污染），并为该蜂群提供新鲜糖浆。通过称量丢弃的糖浆，研究人员可记录每个蜂群的实际摄食量，从而计算出总给药剂量。最后，当外界蜜源极少或没有其他蜜源时，以糖浆形式施用处理剂的效果最佳。其他蜜源的存在会以不可知的程度稀释处理剂浓度。研究人员应牢记，正如实验方案部分所指出的，杀虫剂（如吡虫啉）在不同浓度下可能与蜜蜂活动水平降低（包括蜂巢防护能力下降）相关。蜂群防御能力的减弱还可能导致盗蜜行为增加，进而可能干扰处理效果的判断。
本文展示的结果表明，对蜂巢重量和内部温度的持续监测能够灵敏地反映蜂群水平的行为变化，即使在极低浓度（5 ppb）的神经毒性杀虫剂所引起的行为改变下也是如此。将这些方法进一步应用于其他神经毒素以及具有不同作用机制的杀虫剂（如昆虫生长调节剂），将有助于加深我们对田间现实剂量下蜜蜂蜂群所受影响的理解。

最近人们日益关注蜜蜂暴露于低浓度农用化学品（尤其是杀虫剂）的问题。野外的蜜蜂可能通过多种途径接触这些化学物质，包括在田间直接接触施用在采集蜂体表的药剂，或接触被处理过的蜂群本身；通过接触经农药处理的表面，或种子处理过程中产生的粉尘；以及通过摄食花粉、花蜜和植物分泌物等植物源性产物。1,2,3,4,5急性毒性对蜜蜂显然有害，但导致试验昆虫50%死亡率的浓度（LC50）远高于蜂粮和蜂蜡中观察到的水平，包括吡虫啉等新烟碱类杀虫剂6 且高于被认为 &#34;符合田间实际情况的&#34; 范围7然而，近期研究显示，亚致死剂量的农药暴露对蜂群水平具有显著影响8，即使浓度低至5十亿分之一（ppb）9.
蜜蜂群体被称为&#34;超个体&#34;，因为许多通常由单个动物完成的功能，例如食物获取、繁殖（蜜蜂群体通过群体分裂进行繁殖）以及温度调控，均由成年工蜂群体协作完成10,11,12,13,14。将蜜蜂群体视为有机体进行研究具有独特优势，因为支持群体生存的结构可以被拆解、检查并重新组装，若操作谨慎，几乎不会产生任何不良影响。养蜂人和研究人员利用这一特性，通过拆解蜂巢来检查蜂王的存在与状态、病虫害情况、食物储备是否充足、幼虫数量以及其他相关因素15。蜜蜂群体还有一个重要特征：与大多数恒温动物不同，它们通常固定不动，而是通过派出采集蜂到最远达10 km的距离采集食物来获取资源16。因此，蜂箱可以长期放置在电子秤上，所获得的连续重量数据已被证明能够反映蜂蜜储存、采集活动、采集成功率、分蜂行为、糖浆消耗、农药的致死与亚致死效应、寄生虫侵扰以及盗蜜现象等信息9,17,18,19,20。由于包括幼虫在内的群体所有组成部分均可接触，因此可在蜂箱内部安装用于监测温度、湿度、CO2、声音及其他因素的传感器，以获取连续数据，从而评估蜂群的健康状况与整体状态21。
对成年蜂和蜂群数量的估计在解释许多类型的连续数据时非常有用，甚至至关重要。视觉评估法快速且广泛应用于野外研究22，但也存在局限性。视觉检查通常在白天进行，因此无法计入外出采集的蜜蜂，而采集蜂可能占蜂群总数的相当大比例23。视觉检查所得估计值的精确度和准确性还依赖于检查人员的培训水平和经验。客观性也是一个需要考虑的问题，特别是当蜂箱检查人员知晓各个蜂箱所属的处理组时；对于此类测量方法误差分布的假设可能难以成立。
蜂巢重量增加速率、采集蜂群数量以及蜂巢内部温度等，仅举几例，这些指标在大型与小型蜂群之间预计会存在定量差异，因此在随机实验中测量并控制蜂群规模，通常能显著促进处理效应的检测。出于研究目的，已基于如下原理开发出一种精确且客观的成年蜂数量测量方法：在无活动时段（例如夜间）的蜂巢总重量与所有蜂巢组成部分（包括木制结构、蜂蜡、蜂蜜和蜂蛹）重量之和的差值，即为成年蜂的总质量。通过称量巢框并利用巢框照片测量蜂蛹质量，在扣除空框和蜂蜡的重量后，同样可通过从巢框总重量中减去蜂蛹质量来估算食物资源量。这些方法旨在提高相对于田间目视评估所预期的精确度。

<table><tbody><tr><td>朗氏蜂箱设备（箱体）</td><td>Mann Lake Ltd, Hackensack, MN</td><td>KD-700</td><td></td></tr><tr><td>朗氏蜂箱设备（巢框）</td><td>Mann Lake Ltd, Hackensack, MN</td><td>WW-900</td><td></td></tr><tr><td>朗氏蜂箱设备（内盖和顶盖）</td><td>Mann Lake Ltd, Hackensack, MN</td><td>WW-302&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>朗氏蜂箱设备（底座）</td><td>Mann Lake Ltd, Hackensack, MN</td><td>WW-316</td><td></td></tr><tr><td>朗氏蜂箱设备（内部饲喂器）</td><td>Mann Lake Ltd, Hackensack, MN</td><td>FD-505</td><td></td></tr><tr><td>科多凡意大利蜂蜂王及蜂群套装</td><td>C.F. Koehnen &amp; Sons, Glenn, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>台秤（最大容量 100 kg）：型号 B-2418&amp;nbsp;</td><td>TEKFA, Copenhagen, Denmark</td><td>已停产</td><td></td></tr><tr><td>台秤（最大容量 100 kg）：Diamond 系列</td><td>Avery Weigh-Tronix , Fairmont, MN</td><td>1824-200</td><td></td></tr><tr><td>分析级吡虫啉，CAS 编号 # 138261-41-3</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103</td><td>37894</td><td></td></tr><tr><td>电子精密天平（精度 = 0.1 mg）：Adventurer Pro 260</td><td>Ohaus,&amp;nbsp; Parsippany, NJ</td><td>AV264C</td><td></td></tr><tr><td>便携式电子秤（最大容量 15 kg）：Ranger Count 3000</td><td>Ohaus, Parsippany, NJ</td><td>RC31P15</td><td></td></tr><tr><td>热电偶探头：TMC6-HD</td><td>Onset Computer Corp., Bourne, MA</td><td>TMC6-HD</td><td></td></tr><tr><td>12 位数据记录仪：Hobo U-12</td><td>Onset Computer Corp., Bourne, MA</td><td>U12-012</td><td></td></tr><tr><td>温湿度数据记录仪：iButton Hygrochron</td><td>Baulkham Hills, NSW 2153, 澳大利亚</td><td>DS1923</td><td></td></tr><tr><td>温度数据记录仪：iButton Thermochron</td><td>Baulkham Hills, NSW 2153, 澳大利亚</td><td>DS1922L</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 塑料瓶</td><td>Thermo Scientific, Rochester, NY</td><td>2104-0032</td><td></td></tr><tr><td>组织包埋盒</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>B1000731WH</td><td></td></tr><tr><td>数码相机：Pentax K-01</td><td>Ricoh Imaging Co., Ltd.</td><td>15241</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件版本 1.47</td><td>W. Rasband, 美国国立卫生研究院（NIH）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心管，50 ml</td><td>Fisher Scientific, Asheville, NC</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr></tbody></table>

监测亚致死剂量农药暴露对蜜蜂群体水平的影响

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

亚致死剂量的农药暴露对蜜蜂蜂群可能产生显著影响，但使用标准的视觉评估方法在田间往往难以察觉。本文介绍通过称量蜂箱及蜂箱部件、拍摄巢脾照片，以及将蜂箱安装在秤上并内置传感器等方法，来量化成年蜜蜂、蜂蛹和食物资源的数量。这些定期评估所得的数据随后与蜂箱重量和蜂箱内部温度的滑动平均值及日间去趋势数据相结合。由此产生的数据集已被用于检测低至十亿分之五（5 parts per billion）的吡虫啉糖浆处理对蜂群水平的影响。这些方法客观可靠，所需培训较少，并以传感器输出和照片形式提供永久性记录。

通过定期蜂箱检查结合连续称重监测所测量的蜜蜂蜂群生长状况和物候特征显示，暴露于100 ppb浓度吡虫啉的蜂群其子代产量显著降低。 
蜂箱检查结果表明，成年蜜蜂生物量在5 ppb和100 ppb两种亚致死浓度暴露条件下均未受到显著影响，但对子脾照片的分析显示，100 ppb处理组的子代产量显著较低（图1）。连续蜂箱称重数据揭示了暴露于不同吡虫啉浓度的蜂群组之间存在不同的生长速率。连续称重数据被分为两部分：一是25小时滑动平均数据，反映蜂群生长和觅食成效；二是每小时原始数据与25小时滑动平均值之间的差值，即每小时去趋势数据。去趋势数据的日振幅与蜂群的觅食活动相关19,20（图2）。尽管偶尔称重蜂箱可能在某些时间点检测到平均重量差异，但连续称重提供了关于蜂群行为的去趋势数据信息。
在典型的商用蜂箱中，中段巢框的上梁是安装温度传感器的有效位置。 
蜂群中的成年工蜂会产生并维持较高的温度（33–36°C），尤其是在有蜂子存在的情况下14，且蜂团本身具有移动性，以便利用蜂箱不同区域的食物储备25,26。为减少热量散失，蜂团会尽量避免与蜂箱外部结构（如侧壁或底部）形成较大的接触面，因此蜂箱顶部中心到蜂团的距离通常较短。研究表明，在夏季和秋季条件下，与蜂箱其他位置（如外侧巢框的顶部中心或第二层箱体（“继箱”）的顶部）相比，育子箱顶部中心位置的温度波动更小20。在冬季条件下，环境温度与蜂团温度之间的差异预期最大，而同一位置相较于环境条件表现出最高的温度和最低的温度变异性，表明该位置受蜂团自身产热的影响最大（图3 和 图4；表1）。温度模式的差异无法归因于成年蜂体质量的不同（表2）。
与5 ppb处理组相比，100 ppb处理组中正弦曲线拟合连续温度数据的振幅显著更高，而这两个处理组与对照组之间均无显著差异9。 
振幅与温度变异性呈正比，因此较高的振幅表明蜂巢该位置的温度波动更大。较低的振幅反映出5 ppb处理组和对照组的蜂子产量高于100 ppb处理组（图5）。这些结果，结合蜂巢检查和连续蜂巢重量数据，证实了暴露于100 ppb吡虫啉对蜂群水平行为产生了显著影响。
<img alt="随时间变化的蜂群质量和巢房面积；图表中的暴露水平" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56355/56355fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1： 成年蜂与子脾的测量结果。2014年5月至2015年3月期间，在美国亚利桑那州图森市附近，对暴露于含有0（对照组）、5和100 ppb吡虫啉糖浆的蜂群进行蜂巢检查所获得的数据。（A）成年蜂总质量的平均值（±标准误）；（B）封盖子脾表面积的平均值（±标准误）。灰色区域表示处理期（每群蜂每周饲喂4–6 kg处理过的蔗糖糖浆，持续6周）。每处理组4群蜂，其中100 ppb组有1群蜂在越冬期间死亡。8月份未记录成年蜂质量数据。此处数据此前已发表，经许可使用9。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56355/56355fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="杀虫剂引起的蜂箱重量变化；图表；按月显示的重量振幅变化，100 ppb 的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56355/56355fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2： 蜜蜂蜂群重量数据。2014年6月至12月期间，在美国亚利桑那州图森市附近，暴露于含有0、5和100 ppb吡虫啉糖浆中的蜜蜂蜂群的连续重量数据。 （A）蜂箱总重量（± SEM）；（B）对同期去趋势化重量数据拟合的正弦曲线的振幅。灰色区域表示处理期（每蜂箱每周饲喂4–6 kg含药蔗糖糖浆，持续6周）。每处理组包含四个蜂群；100 ppb组中有一个蜂群在冬季死亡。此处数据此前已发表，经许可使用9。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56355/56355fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="温度数据分析；图表显示从12月到2月高海拔与低海拔地点的温度变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56355/56355fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3： 蜂箱内不同位置的温度。2013年12月至2014年2月期间，美国亚利桑那州图森市附近两个不同海拔地点的蜂箱内部三个传感器位置的日平均温度（± 标准误，单位：°C）。（A）位于高海拔地点（MLEM：2412 m）的4个单箱蜂箱；以及（B）位于较低海拔地点（SRER：719 m）的3个蜂箱。蜂箱为木质朗氏深箱（容量43.65 L），配有木质内盖和金属包边的伸缩式外盖。热电偶温度探头安装在巢框的上梁处，集成的数据记录仪/温度传感器则放置在中间巢框的底梁上。这些数据表明，与其它传感器位置相比，位于中间巢框顶部的传感器所测得的温度始终高于环境温度，因此能够有效反映蜂群对温度的调控能力。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56355/56355fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="高海拔与低海拔温度图；时间序列，去趋势振幅分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56355/56355fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图 4: 不同位置蜂巢内的温度变异性 每日平均（± 标准误）振幅，基于对蜂巢内3个传感器位置的每小时去趋势温度数据拟合的正弦曲线。A）4 个蜂群饲养于高海拔地点（MLEM：2412 m）；以及（B) 3 个蜂箱于 2013 年 12 月至 2014 年 2 月期间安置在美国亚利桑那州图森市附近海拔较低的地点（SRER：719 m）。蜂箱为木质朗氏深箱（容量 43.65 L），配有木质内盖和金属包边的套叠式顶盖。热电偶温度探头固定在巢框的上梁处，集成的数据记录仪/温度传感器则放置在中间巢框的下横梁上。这些数据表明，与其他传感器位置相比，位于中间巢框顶部的传感器在温度变异性（此处通过拟合每小时去趋势数据的正弦曲线振幅来衡量）方面始终低于环境变异性，因此能够有效反映蜂群对温度的调控能力。各图中环境温度（黑色实线）的刻度位于右侧。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56355/56355fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="温度变化图；100 ppb、5 ppb 和对照组的季节性趋势数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56355/56355fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5： 处理蜂群的蜂巢内部温度。 2014年6月至12月期间，在美国亚利桑那州图森市附近，暴露于含有0、5和100 ppb吡虫啉糖浆中的蜜蜂蜂群的连续温度数据。(A) 平均蜂巢温度（± 标准误）；(B) 对同期去趋势化温度数据拟合正弦曲线的振幅。灰色区域表示处理期（每周每蜂巢饲喂4–6 kg处理过的蔗糖糖浆，持续6周）。每处理组四个蜂群；100 ppb组中有一个蜂群在冬季死亡。此处数据此前已发表，经许可使用（Meikle et al. 2016a）。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56355/56355fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>比较</td>
			<td>t 检验</td>
			<td>校正后 P 值</td>
			<td>地点</td>
			<td>平均差异 (°C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>位置 2 - 位置 1</td>
			<td>2.05</td>
			<td>0.0485</td>
			<td>MLEM</td>
			<td>1.00 ±0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SRER</td>
			<td>4.38 ±0.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>位置 2 - 位置 3</td>
			<td>0.84</td>
			<td>1</td>
			<td>MLEM</td>
			<td>2.05 ±0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SRER</td>
			<td>0.12 ±0.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1： 不同传感器位置在蜜蜂蜂巢内的平均温度差异及事后比较。 位置1：顶部外侧巢框；位置2：顶部中间巢框；位置3：底部中间巢框。2013年12月至2014年2月期间，4个单箱蜂巢饲养于高海拔地点（MLEM：2412 m），3个蜂巢饲养于较低海拔地点（SRER：719 m），均位于美国亚利桑那州图森市附近。蜂箱为木质朗氏深箱（容量43.65 L），配有木质内盖和金属包边的套叠式箱盖。热电偶温度探头安装于位置1和位置2，集成式数据记录仪/温度传感器安装于位置3。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组别</td>
			<td>日期</td>
			<td>成年蜜蜂平均质量（± 标准误）(g)</td>
			<td>蜂蛹表面积平均值（± 标准误）(cm2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLEM</td>
			<td>2013年11月18日</td>
			<td>2119 ±412</td>
			<td>1372 ±396</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRER</td>
			<td>2013年11月15日</td>
			<td>2270 ±312</td>
			<td>53 ±30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLEM</td>
			<td>2014年2月13日</td>
			<td>2171 ±105</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRER</td>
			<td>2014年2月11日</td>
			<td>2027 ±487</td>
			<td>867 ± 79</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2： 根据本文所述方案估算的四个位于高海拔地区（MLEM：2412 m）蜂箱及三个位于亚利桑那州图森市附近较低海拔地区（SRER：719 m）蜂箱在2013年12月至2014年2月期间的成年蜜蜂平均质量与蜂蛹质量。 蜂箱为木质朗氏深框箱（容量43.65 L），配有木质内盖和金属包边的套叠式顶盖。热电偶温度探头安装于位置1和位置2，集成式数据记录仪/温度传感器安装于位置3。

亚致死剂量的杀虫剂可能以仅通过定期观察或目测方法难以察觉的方式影响蜂群。本文提供了通过称量蜂箱及蜂箱部件、拍摄巢脾照片以及安装传感器来测量成年蜜蜂总质量、蜂子和食物资源的方法，并讨论了数据分析方法。

亚致死剂量农药暴露对蜜蜂蜂群的影响可能十分显著，但使用标准的视觉评估方法在田间难以检测。

这些操作的总体目标是通过测量成年蜜蜂数量、子脾面积以及食物资源量，客观地量化蜜蜂蜂群状态，从而评估农业化学品暴露对蜂群健康的影响。该方法有助于回答蜜蜂科学研究中的关键问题，例如亚致死剂量的农业化学品暴露对蜂群水平的影响。该技术的主要优势在于，成年蜂数量、子脾面积和食物资源均经过严格测量而非目测估计，并且保留记录以供核对观察结果。我们已开发出一系列组织系统，以尽量减少对蜂群的干扰。该操作流程存在一定的学习曲线，因此高效、快速地操作至关重要。由于该实验步骤较为复杂，通过可视化方式演示此方法将非常有帮助。为了尽量减少对蜂群的干扰，需系统地称量蜂箱的各个部件并对巢框进行拍照。应在环境条件适合操作蜜蜂时进行蜂箱评估。开始时，将一个临时的空蜂箱放置在蜂箱旁的平坦表面上，例如放在一个未使用的蜂箱盖上，以便在蜂王掉落时能够及时收集。然后称量蜂箱盖以及内盖（如有）。接着，使用刮刀取下并称量放置在巢框上的任何蛋白质补充剂或害虫处理剂。保留这些材料，并在评估结束时将其放回巢框顶部。现在用不易褪色的墨水标记所有巢框的顺序和方向。然后迅速而轻柔地将巢框每次两到三个地转移到临时蜂箱中，以保留蜂群的部分蜂团。当所有巢框都转移完毕后，将剩余的蜜蜂抖落到临时蜂箱中的巢框上。接下来，分别称量蜂箱的每个部分，包括底板、蜂箱盒和入口缩小器。称量完所有部件后，重新组装蜂箱，并将巢脾按原始顺序和方向放回育虫箱中，尽量减少对蜜蜂的干扰。随后，对每张巢脾进行单独记录。首先，检查蜂框中是否有蜂王。若发现蜂王，应轻柔地将其放回育雏箱中。然后，将工蜂从蜂框上轻轻但有力地抖落，使其落入箱内。如果可能，让它们落在框架之间。然后在助手的帮助下拍摄每个框架的两侧。收集能够区分封盖的蜂蛹巢房与蜂蜜巢房的图像。使用连接在天平上的巢框固定夹具称量无蜂巢框的重量。然后从蜂箱中取出下一个巢框，再次寻找蜂王并抖落其他蜜蜂。若此时已找到蜂王，将其放入已检查过的蜂巢区域中。然后将已记录的巢脾放回箱内，并对新取出的巢脾进行称重和拍照。以此方式处理所有巢脾。如果蜂箱包含多个箱体，应首先检查最底部的箱体。重新堆叠箱体时，务必保持其原有顺序。在最近一段不活跃时期（例如夜间，或评估当天的清晨）获取蜂箱的总重量。通过将蜂箱各个部分的重量相加，然后从蜂箱总重量中减去该总和，来计算成年蜜蜂的重量。两者之间的差值即为成年蜜蜂重量的估算值。蜂箱秤必须始终安装在坚实、水平的表面上。使用量程为100千克、可与24 VDC显示器及12位数据记录仪兼容的室外电子台秤。随后，用一种能够防止过度反光并减少蜂巢入口受热的材料覆盖秤盘。然后，使用至少为秤最大量程一半的砝码对秤进行校准。定期重复此校准操作，每次移动天平时都必须进行一次校准。对于温度传感器，使用连接到电池供电数据记录仪的热电偶，或使用带有集成传感器和数据记录仪的小型电池供电设备。保护传感器和容器，使其免受蜂蜡和蜂胶的影响。将传感器固定在盒子顶部横杆正下方的中央位置。使用一段短导线将带保护的传感器连接到框架顶部，可用订书钉固定。典型的采样方案包括从蜂箱中至少三个不同位置采集各三克的蜂蜡、蜂蜜和蜂粮，然后将这些样品合并为一个样本。采集蜂蜡时，打开一个50毫升离心管，选取一段空巢脾，将管口沿巢房刮取，直至收集到所需量的蜂蜡。在盖上管盖并贴标签时，务必避免触碰管内的蜂蜡。采集蜂蜜或花蜜时，打开离心管，将管口紧贴含有蜂蜜或花蜜的蜂巢部分，让样品自然流入管中，避免使用刮取法，以减少样品中混入的蜂蜡。采集蜂粮时，使用洁净的刮铲取出多个含蜂粮的巢房内容物，并将样品转移至同一离心管中。为了施用糖浆处理，应尽快将糖浆倒入饲喂器中，并注意不要将糖浆洒到蜂箱外部，以免其他蜂群的蜜蜂发现。在 ImageJ 中使用多边形工具定义巢框上巢脾覆盖的区域，然后点击分析并选择测量。此时将弹出一个新对话框，显示所定义区域内像素的数量。要定义封盖子代区域，请使用手绘工具围绕这些细胞，然后单击“分析”并选择“测量”。如果由于疾病等因素导致子脾分布不连续，应使用多点选择工具来计数蜂房。每个蜂房面积约为1/4平方厘米。利用已知的巢框面积将像素转换为平方厘米。根据这些测量结果，计算蜂房中育虫区所占的面积及其占整个蜂房的百分比。成年蜜蜂的生物量未受到5和100十亿分之一亚致死浓度暴露的显著影响。暴露于100十亿分之一浓度吡虫啉的蜂群，其蜜蜂群体增长和物候显示育虫量显著降低。蜂巢重量数据由25小时滑动平均值及每小时相对于该平均值的方差组成。每日重量变化的振幅与觅食活动相关，因此可提供有关蜂群行为的信息。蜂巢温度以正弦曲线表示，该曲线拟合了连续的温度数据。100 十亿分之一处理组的曲线振幅显著高于 5 十亿分之一处理组，但这两个处理组与对照组之间均无显著差异。观看本视频后，您应已充分了解如何对蜜蜂蜂群的种群数量和资源状况进行客观评估。一旦掌握，完整的蜂群评估可在 15 分钟或更短时间内完成，部分评估则耗时更短。在进行此操作时，重要的是要迅速而谨慎地工作，注意不要碰撞或掉落含有蜜蜂的蜂巢部件。这些技术的开发旨在为养蜂研究领域的科研人员提供一种方法，以获取客观数据，用于研究营养、农药暴露以及病虫害防治措施对蜂群水平生长和活动的影响。

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科研

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Biology

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