3D 基质中哺乳动物细胞分裂的定量共焦反射显微镜观察

该协议有效地研究了3D 胶原基质中的哺乳动物细胞分裂, 结合细胞分裂的同步, 用活细胞成像技术监测3D 矩阵中的分裂事件, 时间分辨共聚焦反射显微镜和定量成像分析。

该程序的总体目标是在生理相关的 3D 环境中研究哺乳动物细胞分裂和细胞基质相互作用。该技术的主要优点是它提供了一种高效且通用的方法来研究哺乳动物细胞分裂和细胞基质相互作用。这种方法可以帮助回答细胞生物学中的关键问题，例如正常组织和疾病组织发育的分子基础。

转染前一天，将 500 万个 HEK-293 T 细胞接种在 100 mL 细胞培养皿中，放入 10 mL 正常细胞培养基中。将这些细胞在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳的加湿培养箱中孵育 24 小时。第二天，在开始转染之前，从 4 摄氏度中取出一小瓶转染试剂，并将其放置至室温。

然后，首先将 1 毫升还原血清培养基添加到无菌微量离心管中。为此，加入指定量的用于转染的慢病毒载体质粒，并通过移液混合。将试管在室温下孵育 5 分钟。

5 分钟后，向该试管中加入 48 μL 转染试剂，并通过移液轻轻混匀。随后，在室温下孵育该混合物至少 15 分钟。孵育完成后，从培养箱中取出含有 HEK-293 T 细胞的板。

将制备好的 DNA 转染试剂混合物逐滴加入细胞上，轻轻旋转板以确保在板中均匀分布。将板放回培养箱中。转染后约 6 小时，取出板并吸出培养基。

加入 10 mL 新鲜培养基，将板转移回培养箱中。在转染后 24、48 和 72 小时的多个时间点，在单独的试管中收获含有慢病毒颗粒的培养基。接下来，通过无菌 0.45 微米过滤器过滤收获的培养基，以去除细胞碎片。

每次收获后更换为新鲜培养基。含有慢病毒颗粒的滤液可以立即用于转导，也可以储存在零下 80 摄氏度。将人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 接种在正常培养基中的 35 毫米培养皿中。

将这些细胞在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳的加湿培养箱中孵育 24 小时。第二天，从平板中吸出培养基，加入 1 毫升慢病毒颗粒和 1 毫升新鲜培养基。将细胞在培养箱中孵育约 16 小时。

与病毒颗粒孵育完成后，取出板以吸出培养基。然后加入 2 mL 新鲜培养基，转移回培养箱中 24 至 72 小时。使用落射荧光显微镜检查这些转导细胞中 H 2 B-mCherry 的表达。

为了开始同步实验，首先在 24 孔板中以 50% 至 60% 汇合度表达 H2B-mCherry 的 MDA-MB-231 细胞。将培养物在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 24 小时。第二天，用 0.5 毫升含有 2 毫摩尔胸苷的培养基替换培养基。

将板在培养箱中放置 24 小时。孵育完成后，用 PBS 洗涤细胞 3 次，以将其从胸苷处理中释放出来。然后将细胞置于 0.5 mL 普通培养基中，在培养箱中放置 5 小时。

在此之后，为了在有丝分裂中阻断这些细胞，将诺考达唑添加到培养基中。将细胞在培养箱中放置 12 小时。诺考达唑处理完成后，取出板，使用轨道摇床，摇动细胞 45 秒至 1 分钟以释放有丝分裂细胞。

随后，将含有提取的有丝分裂细胞的培养基转移到新的离心管中。然后向每个孔中加入 0.5 mL新鲜培养基。之后，再重复摇动和提取细胞两次。

汇集收集的总培养基，然后离心以沉淀有丝分裂细胞。离心后，将细胞沉淀重悬于 0.25 mL 新鲜细胞培养基中。使用血细胞计数器计数细胞数。

在此步骤开始时，准备 50 毫升 10x DMEM 溶液并过滤消毒。接下来，确定将用于制造 3D 胶原蛋白基质的所有成分的体积，如文本协议中指定。将所有这些成分在冰上预冷却以减缓胶原蛋白的凝胶化。

现在，向预冷的 1.5 mL离心管中加入所需数量的细胞，然后加入 10x DMEM、FBS、去离子水、胶原蛋白，最后加入氢氧化钠。使用 1 毫升移液器小心混合。溶液充分混合后，将 500 微升混合物添加到 24 孔板的每个孔中。

将 24 孔板置于 37 摄氏度的培养箱中。30 分钟后，取出板，在凝胶上加入 500 μL 预热的培养基。在成像之前，打开相差显微镜和共聚焦显微镜的活细胞单元。

为了捕获分裂的细胞，将含有嵌入胶原基质中的细胞的 24 孔板放入荧光显微镜的活细胞单元中。使用 10 倍物镜，找到板的底部，然后将其向上移动，直到显微镜聚焦在距板底部约 500 微米处。移动载物台以查找处于有丝分裂不同阶段的细胞，并选择多个位置进行成像。

设置间隔为 2 分钟的延时摄影实验。接下来，要对胶原蛋白网络进行成像，请将共聚焦显微镜配置为仅捕获来自 488 纳米激光器的反射光。然后将含有胶原蛋白基质中细胞的板放入该显微镜的活细胞单元中。

找到板的底部，然后向上移动物镜，直到它聚焦在距板底部约 100 微米处。移动载物台以查找单元格并选择多个成像位置。设置间隔为 5 分钟的延时摄影实验。

此处显示了嵌入胶原基质中的分裂 H2B-mCherry 表达 MDA-MB-231 细胞的荧光图像。正如预期的那样，很容易观察到有丝分裂的不同阶段。在有丝分裂过程中，使用共聚焦反射显微镜同时可视化的白色胶原纤维分布变化很小。

细胞同步 G2-M 期并包埋在胶原基质中，在前两个小时内完成细胞分裂，而对照异步细胞随机分裂。间期和有丝分裂期胶原纤维分布的定量表明，细胞分裂期间基质变形最小，而间期细胞中的基质变形较高。一旦掌握，这项技术可以在 7 天内完成，从生成稳定细胞系到在 3D 矩阵中分析视频细胞分裂。

观看本视频后，希望您对如何使用活细胞成像同步和监测 3D 基质中的哺乳动物细胞分裂以及如何使用共聚焦反射显微镜和定量成像分析技术确定基质变形有很好的了解。