通过定量共聚焦反射显微镜观察三维基质中的哺乳动物细胞分裂

本实验的总体目标是在生理相关的三维环境中研究哺乳动物细胞分裂以及细胞与基质的相互作用。该技术的主要优势在于，它提供了一种高效且通用的方法，用于研究哺乳动物细胞的分裂过程及细胞与基质之间的相互作用。该方法有助于解答细胞生物学领域的一些关键问题，例如正常组织和病变组织发育的分子基础。

转染前一天，将五百万个HEK-293 T细胞接种于100毫升细胞培养皿中，加入10毫升正常细胞培养基。将细胞置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中培养24小时。次日开始转染前，从4摄氏度冰箱中取出一管转染试剂，放置于室温使其升温至室温。

首先，向无菌微量离心管中加入一毫升低血清培养基。然后加入指定量的用于转染的慢病毒载体质粒，并用移液器吹打混匀。室温孵育五分钟。

五分钟后，向该离心管中加入48 µL转染试剂，用移液器轻轻混匀。随后，将该混合物在室温下孵育至少15分钟。孵育完成后，从培养箱中取出含有HEK-293 T细胞的培养板。

将制备好的DNA转染试剂混合物逐滴加入细胞中，并轻轻摇动培养板以确保液体在板内均匀分布。将培养板放回培养箱中。转染约六小时后，取出培养板并吸除培养基。

加入10毫升新鲜培养基，将培养板放回培养箱中。在转染后的多个时间点（24、48和72小时），分别收集含有慢病毒颗粒的培养基至不同的离心管中。接着，将收集的培养基通过无菌的0.45微米滤膜过滤，以去除细胞碎片。

每次收获后均需更换新鲜的培养基。含有慢病毒颗粒的滤液可立即用于转导，也可在负80摄氏度保存。将人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 接种于含正常培养基的35毫米培养皿中。

将这些细胞置于含5%二氧化碳的湿润化培养箱中，在37摄氏度下孵育24小时。次日，吸去培养板中的培养基，并加入1毫升慢病毒颗粒与1毫升新鲜培养基。将细胞在培养箱中继续孵育约16小时。

病毒颗粒孵育完成后，取出培养板以吸除培养基。随后加入两毫升新鲜培养基，并将培养板放回培养箱中继续培养24至72小时。使用落射荧光显微镜检测这些转导细胞中H2B-mCherry的表达情况。

开始同步化实验时，首先将表达 H2B-mCherry 的 MDA-MB-231 细胞以 50% 至 60% 的融合度接种于 24 孔板中。将细胞在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养 24 小时。次日，将培养基更换为含有 2 毫摩尔胸腺嘧啶的 0.5 毫升培养基。

将培养板置于培养箱中孵育24小时。孵育结束后，用PBS洗涤细胞三次，以解除胸腺嘧啶处理的作用。然后将细胞在培养箱中继续培养5小时，每孔加入0.5毫升正常培养基。

此后，为了将这些细胞阻滞在有丝分裂期，向培养基中加入诺考达唑。将细胞在培养箱中孵育12小时。诺考达唑处理完成后，取出培养板，使用轨道摇床轻轻振荡细胞45秒至1分钟，以释放有丝分裂期的细胞。

随后，将含有已提取有丝分裂细胞的培养基转移至新的离心管中。然后向每孔加入0.5毫升新鲜培养基。之后，再重复振荡和细胞提取操作两次。

将收集的全部培养基合并，然后离心以沉淀有丝分裂细胞。离心后，用 0.25 毫升新鲜细胞培养基重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。

在此步骤开始时，准备 50 毫升 10x DMEM 溶液并进行过滤除菌。接下来，根据文本方案中规定，确定用于制备 3D 胶原蛋白基质的所有组分的体积。将所有这些组分预先在冰上冷却，以减缓胶原蛋白的凝胶化过程。

现在，向预冷的1.5毫升离心管中加入所需数量的细胞悬液，然后依次加入10倍浓缩的DMEM、FBS、去离子水、胶原蛋白，最后加入氢氧化钠。使用1毫升移液器轻轻混匀。待溶液充分混合后，将500微升混合液加入24孔板的每个孔中。

将24孔板放入37摄氏度的培养箱中。30分钟后取出培养板，在凝胶上加入500 µL预热的培养基。成像前，打开相差显微镜和共聚焦显微镜的活细胞培养装置。

为了捕获正在分裂的细胞，将含有包埋在胶原基质中细胞的24孔板放入荧光显微镜的活细胞成像单元。使用10倍物镜，先找到孔板底部，然后向上移动载物台，使显微镜聚焦在距离孔板底部约500微米的位置。移动载物台以寻找处于不同有丝分裂阶段的细胞，并选择多个位置进行成像。

以两分钟为间隔设置延时实验。接下来，为了成像胶原网络，将共聚焦显微镜配置为仅采集488纳米激光的反射光。然后将含有细胞-胶原凝胶复合物的培养板放入该显微镜的活细胞成像单元中。

找到培养板的底部，然后向上移动物镜，使其聚焦在距离培养板底部约 100 µm 的位置。移动载物台以寻找细胞，并选择多个成像位置。设置时间间隔为五分钟的延时成像实验。

嵌入胶原基质中的表达 H2B-mCherry 的 MDA-MB-231 细胞分裂过程的荧光图像如图所示。有丝分裂的不同阶段清晰可见，符合预期。利用共聚焦反射显微镜同时观察到的白色胶原纤维分布，在整个有丝分裂过程中变化甚微。

处于G2-M期同步化的细胞被包埋在胶原基质中后，可在前两小时内完成细胞分裂，而作为对照的非同步化细胞则随机进行分裂。对间期和有丝分裂各阶段胶原纤维分布的定量分析表明，细胞分裂过程中基质形变最小，而在间期细胞中形变程度较高。一旦掌握该技术，从稳定细胞系的构建到在三维基质中分析活细胞分裂视频，整个流程可在七天内完成。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用活细胞成像技术在三维基质中同步并监测哺乳动物细胞的分裂过程，以及如何通过共聚焦反射显微镜结合定量成像分析技术来确定基质的形变情况。