Name: 3D 基质中哺乳动物细胞分裂的定量共焦反射显微镜观察 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 学习使用共焦反射显微镜和活细胞成像技术定量分析哺乳动物细胞在三维胶原基质中的分裂动态。该方法利用HEK-293 T细胞和MDA-MB-231细胞研究细胞与基质相互作用，为发育生物学和疾病研究提供重要工具。

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本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目R01CA174388和U54CA143868的支持。作者感谢约翰斯·霍普金斯大学提供的PURA奖项对陈 Wei-tong 的资助。本材料基于美国国家科学基金会研究生研究奖学金资助项目No. 1232825所支持的研究工作。

本方案遵循霍姆伍德机构审查委员会（HIRB）的指南。
1. 稳定表达H2B-mCherry作为细胞有丝分裂的标记
<ol>
	<li>从人胚胎肾293T（HEK 293T）细胞中产生慢病毒颗粒
	<ol>
		<li>将HEK 293T细胞以5 × 106 个细胞/皿的密度接种于10 cm细胞培养皿中，培养基为含高糖（4.5 g/L）、丙酮酸钠、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（Pen/Strep）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。在37 °C、5%二氧化碳（CO2）条件下培养24小时。转染当天细胞融合度应达到约70–80%。 
		注：此处使用HEK 293T细胞生产病毒颗粒，后续用于转导MDA-MB-231细胞，以建立稳定表达H2B-mCherry的细胞系。确保细胞在培养皿中均匀分布。将细胞悬液逐滴加入培养皿，并轻轻前后晃动培养皿有助于实现均匀分布。也可将细胞接种于其他尺寸的培养皿或培养瓶中，从而获得不同体积的病毒颗粒。</li>
		<li>使用转染试剂将三种质粒（慢病毒载体、CMV ΔR 8.91和pMDG-VSVG）共转染至HEK 293T细胞中。编码H2B-mCherry的质粒被克隆至含有磷酸甘油酸激酶启动子（PGK）的慢病毒载体中。CMV ΔR 8.91包含HIV所需的三个基因gag、pol和rev。pMDG-VSVG包含VSV-G包膜基因。 
		注：可选择多种不同的转染试剂。
		<ol>
			<li>使用前使转染试剂小瓶恢复至室温（RT），轻轻颠倒或涡旋混匀。</li>
			<li>将6 µg H2B-mCherry质粒、8 µg CMV ΔR 8.91和2 µg pMDG-VSVG共16 µg DNA溶于1 mL低血清培养基中，在室温下孵育5分钟。 
			注：三种质粒的用量及比例需根据不同慢病毒转移载体进行调整和优化。</li>
			<li>向上述DNA溶液中加入48 µL转染试剂（DNA与转染试剂按1:3比例），室温孵育至少15分钟。 
			注：DNA与转染试剂的比例需根据不同慢病毒转移载体进行调整和优化。确保转染试剂不要接触1.5 mL离心管管壁。</li>
			<li>将步骤1.1.2.3中制备的DNA-脂质复合物逐滴加入细胞中，轻轻摇动培养皿以确保复合物在皿内均匀分布。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>转染约6小时后，吸除培养基，加入新鲜细胞培养基（含高糖（4.5 g/L）、丙酮酸钠、10% FBS和1% Pen/Strep的DMEM）。</li>
		<li>在转染后24、48和72小时分别收集上清液，每次收集后更换新鲜培养基（DMEM，含4.5 g/L葡萄糖、丙酮酸钠、10% FBS和1% Pen/Strep）。</li>
		<li>用0.45 µm滤膜过滤慢病毒颗粒以去除细胞碎片。也可通过离心上清液去除细胞碎片。所得上清液可立即用于转导，或保存于-80 °C备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立稳定表达H2B-mCherry的细胞系 
	注：本方案以MDA-MB-231细胞为例进行详细描述。实验前，人乳腺癌细胞MDA-MB-231（美国国立卫生研究院物理科学肿瘤中心提供）需在含高糖（4.5 g/L）、丙酮酸钠、10% FBS和1% Pen/Strep的DMEM中培养。
	<ol>
		<li>以1 × 105 个细胞的密度将MDA-MB-231细胞接种于35 mm培养皿中。 
		注：不同细胞系的接种密度需进行优化，可能与MDA-MB-231细胞的最佳密度不同。</li>
		<li>细胞接种24小时后，加入1 mL病毒液和1 mL新鲜培养基（DMEM，含高糖（4.5 g/L）、丙酮酸钠、10% FBS和1% Pen/Strep）。</li>
		<li>将细胞孵育6小时至过夜。 
		注：病毒体积和孵育时间需根据不同细胞系进行优化。例如，若加入病毒数小时后细胞状态不佳，可在步骤1.2.2中使用1 mL病毒液和2 mL新鲜培养基（DMEM，含高糖（4.5 g/L）、丙酮酸钠、10% FBS和1% Pen/Strep）。步骤1.2.3中的孵育时间也可适当缩短。</li>
		<li>吸除培养基，加入10 mL新鲜培养基（DMEM，含高糖（4.5 g/L）、丙酮酸钠、10% FBS和1% Pen/Strep），在37 °C、5% CO2条件下孵育24至72小时。</li>
		<li>使用落射荧光显微镜检测细胞中H2B-mCherry的表达情况。 
		注：若细胞转导效率较低，可增加步骤2.2中的病毒体积和/或延长步骤2.3中的孵育时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 稳定表达H2B-mCherry的细胞同步化
<ol>
	<li>以50%至60%的汇合度接种细胞， 即 接种 2 × 104 24孔板中每孔的MDA-MB-231细胞。</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞2 24 小时。</li>
	<li>更换培养基，加入含 2 mM 胸腺嘧啶的 0.5 mL 培养基（DMEM，高糖（4.5 g/L），含丙酮酸钠，10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素），置于培养箱中孵育 24 小时。 
	注意：经胸苷处理的细胞会因DNA合成受到抑制，而在细胞生长（G1）期与DNA合成（S）期的转换阶段及整个S期发生阻滞。不同细胞系的孵育时间应进行调整并优化。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次，以解除胸腺嘧啶暴露。随后，将细胞在正常细胞培养基（DMEM，高糖（4.5 g/L），丙酮酸钠，10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素）中孵育 5 小时。 
	注意：解除胸苷处理后，原先在G1/S期被阻滞的细胞将进入细胞生长期（G2期）/有丝分裂期（M期），而原先在S期被阻滞的细胞将进入G1期。释放时间的长短应根据不同细胞系进行调整和优化。</li>
	<li>用 250 ng/mL 的诺考达唑处理细胞，阻断 12 小时。 
	注意：所有经诺考达唑处理的细胞均被阻滞在G2/M期。诺考达唑具有细胞毒性， prolonged exposure 可导致细胞凋亡。若观察到细胞死亡，应针对不同细胞系调整处理时间或浓度。成功同步化的细胞将呈现圆形形态。</li>
	<li>使用摇床以150至200 rpm的转速振荡细胞45秒至1分钟。 
	注意：有丝分裂细胞与培养基底的黏附性较弱，在此过程中会被振落。</li>
	<li>吸出培养基以收集细胞，用移液器将培养基转移至离心管中，然后向每孔加入 0.5 mL 新鲜培养基（DMEM，高糖（4.5 g/L），含丙酮酸钠，10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素）。</li>
	<li>重复步骤 2.6 和 2.7 三次。</li>
	<li>将含有有丝分裂细胞的收集培养基在800 × g离心3分钟。 
	注意：此步骤用于从细胞培养基中去除诺考达唑。</li>
</ol>
3. 将同步化细胞整合至I型胶原基质中
注意：I型胶原是人体内以及结缔组织细胞外基质（ECM）中最丰富的蛋白质，因此被广泛用于研究真核细胞功能如何受到三维环境的调控17,23,24。胶原可溶于乙酸。将胶原溶液中和并升温至20 - 37 °C后，胶原单体即聚合形成胶原原纤维的网状结构。
<ol>
	<li>通过将一包 DMEM 粉末、3.7 g 碳酸氢钠（NaHCO3）和 1 g 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）溶解于 50 mL 蒸馏水中，配制 10x&#160;DMEM 溶液。过滤该溶液，然后通过将 2 g 氢氧化钠（NaOH）颗粒溶解于 50 mL 蒸馏水中配制 1 M 氢氧化钠（NaOH）溶液。过滤后分装至 1.5 mL 离心管中。 
	注意：此步骤中不应使用常规 DMEM 溶液。胶原溶液的加入会显著稀释培养基，因此需配制浓缩的 DMEM 溶液，以确保胶原基质中 DMEM 的最终浓度与常规 DMEM 相同。</li>
	<li>继续使用步骤 2.9 中收集的细胞。吸除培养基，并用约 0.25–0.5 mL 新鲜细胞培养基（DMEM，高糖（4.5 g/L）、丙酮酸钠、10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素）重悬细胞。 
	注意：为在胶原基质中达到特定的细胞密度，细胞悬液的初始密度不能过低。因此，用于重悬细胞的培养基体积取决于可用细胞的总数。</li>
	<li>取步骤 3.2 中重悬的细胞溶液 10 µL，滴加至血细胞计数板上，计数溶液中的细胞密度。</li>
	<li>确定配制三维胶原基质所需各组分的体积。此处以 500 µL 浓度为 2 µg/µL 的胶原凝胶为例。
	<ol>
		<li>计算获得 40,000 个细胞/mL（或 500 µL 胶原凝胶中 20,000 个细胞）所需的细胞悬液体积。该数值以 µL 表示，记为 X。需要 50 µL 的 10x&#160;DMEM。需要 50 µL 胎牛血清（FBS）。</li>
		<li>计算所需 I 型胶原原液的体积。I 型胶原的浓度约为 4 µg/µL。所需胶原体积以 µL 表示，记为 Y。</li>
		<li>计算中和胶原溶液中乙酸所需的氢氧化钠体积：Y µL 胶原 × 0.023 × 1000 = 所需 NaOH 体积 Z µL。</li>
		<li>确定填充液的体积：（500 µL 总凝胶体积 - X µL 细胞 - 50 µL 10x DMEM - 50 µL FBS - Y µL 胶原 - Z µL NaOH）= R µL 
		注意：填充液为蒸馏水。若计算所得填充液体积为负数，则细胞悬液的初始细胞密度过低，需将细胞再次离心并用更小体积的培养基（DMEM，高糖（4.5 g/L）、丙酮酸钠、10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素）重悬。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按以下顺序将各组分加入洁净的 1.5 mL 离心管中：含培养基的细胞、10x&#160;DMEM、FBS、去离子水（DI 水）、胶原、NaOH。将所有组分置于冰上，以减缓胶原溶液的凝胶化过程。采用正确的移液技术，避免产生气泡。</li>
	<li>加入 NaOH 后，用 1 mL 移液器小心混匀溶液。 
	注意：加入 NaOH 后胶原将立即开始凝胶化，因此混匀操作应迅速且轻柔。</li>
	<li>溶液充分混匀后，向每孔 24 孔板中加入 500 µL 混合液。将 24 孔板置于 37 °C 培养箱中。同时将新鲜细胞培养基置于 37 °C 水浴中预热。 
	注意：塑料底板适用于工作距离大于 1 mm 的低倍活细胞显微成像；而玻璃底板因高倍物镜的工作距离较短，适用于高倍活细胞显微成像。</li>
	<li>在完成步骤 3.7 后 30 分钟，向凝胶表面加入 500 µL 预热的培养基（DMEM，高糖（4.5 g/L）、丙酮酸钠、10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素）。</li>
</ol>
4. 三维胶原基质中细胞分裂的活细胞成像（低倍率）
注意：使用安装在相差显微镜上的电荷耦合器件（CCD）相机，以10倍物镜，每2分钟采集一次细胞图像，显微镜由成像软件控制。
<ol>
	<li>打开安装在物镜上方的活细胞培养装置。等待温度稳定在 37 °C，CO2 浓度达到 5%，湿度达到 75%。</li>
	<li>将含有凝胶的 24 孔板放入显微镜的活细胞培养装置中。找到孔板的底部，然后向上移动物镜，使显微镜聚焦在距离孔板底部约 500 µm 的位置。 
	注意：靠近孔板底部的胶原基质中的细胞未能完全嵌入三维基质中。对距离孔板底部 500 µm 处的细胞进行成像，可确保细胞不受边缘效应的影响16,17,25。</li>
	<li>移动载物台以寻找细胞，并选择多个成像位置。</li>
	<li>设置每 2 分钟一次的时间序列实验。 
	注意：在 2 分钟间隔内可采集的最大位置数受限于电动载物台的移动速度以及图像采集时的曝光时间长度。</li>
</ol>
5. 细胞分裂过程中胶原网络的形变（高倍显微镜观察）
<ol>
	<li>打开安装在物镜上方的活细胞培养单元。等待温度稳定在 37 °C，CO2 浓度达到 5%，湿度达到 75%。</li>
	<li>为了在未染色的三维胶原基质中观察胶原纤维，请将共聚焦显微镜设置为仅采集用于照射样品的 488 nm 激光所产生的反射光（488 nm）。该激光使用 60X&#160;水浸物镜，数值孔径（NA）= 1.2，工作距离（WD）= 200 µm，并由成像软件控制。</li>
	<li>将样品（含细胞的胶原基质）放入活细胞培养单元中。先找到培养板底部，然后向上移动物镜，使显微镜聚焦在距离培养板底部约 100 µm 的位置。对距离培养板底部 100 µm 处的细胞进行成像，可确保细胞不受边缘效应影响。 
	注意：此处使用水浸物镜而非油浸物镜，因为油浸物镜的工作距离通常仅为约 100 µm，而培养板底部的玻璃厚度通常也约为 100 µm，使用油浸物镜会带来问题。</li>
	<li>移动载物台以寻找细胞，并选择多个成像位置。 
	注意：共聚焦显微镜可对样品进行光学切片，仅采集焦平面内的信号。在延时成像过程中，活细胞可能在焦平面内外移动。为了实现长时间连续成像，采用 Z 堆栈模式，以 5 µm 为间隔连续采集图像，共采集 5 层，覆盖 25 µm 的范围。</li>
	<li>设置延时成像实验，时间间隔为 5 分钟。 
	注意：此处使用 5 分钟作为时间间隔，而非第 4 节中使用的 2 分钟，因为每个成像位置需应用多种扫描模式，包括 H2B-mCherry 的荧光扫描、胶原的反射扫描以及 Z 堆栈扫描。多种扫描模式的使用相比低倍成像会降低单个位置的扫描速度。</li>
	<li>利用具有亚像素分辨率的粒子图像测速法（PIV）20，量化细胞周围胶原基质因细胞施加的力而产生的形变。在二维图像上进行此分析，可清晰显示 H2B-mCherry 信号和胶原纤维信号。应用各向异性低通滤波以增强胶原网络的信号20。</li>
	<li>为了测量位于 (x,y) 的子图像感兴趣区域从第 k 帧到第 k+1 帧的局部位移，需在第 k 帧中提取以 (x,y) 为中心的 15×15 像素区域窗口。然后，在第 k+1 帧的图像中，通过归一化互相关系数最大的位置确定最佳匹配位置 (x,y)*。形变矢量计算为 (x,y)* - (x,y)。</li>
</ol>

<ol><li>Ly, D. H., Lockhart, D. J., Lerner, R. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+misregulation+and+human+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitotic misregulation and human aging.</a> Science. 287 (5462), 2486-2492 (2000).</li>
<li>Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+anti-mitotic+drugs+kill+cancer+cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?</a> J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).</li>
<li>Brinkley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+the+centrosome+numbers+game%3A+from+chaos+to+stability+in+cancer+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Managing the centrosome numbers game: from chaos to stability in cancer cell division.</a> Trends Cell Biol. 11 (1), 18-21 (2001).</li>
<li>Phillip, J. M., Aifuwa, I., Walston, J., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanobiology+of+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">The Mechanobiology of Aging.</a> Annu Rev Biomed Eng. 17, 113-141 (2015).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Martin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ablation+or+inhibition+of+stromal+matrix+metalloproteinase-9+on+lung+metastasis+in+a+breast+cancer+model+is+dependent+on+genetic+background%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of ablation or inhibition of stromal matrix metalloproteinase-9 on lung metastasis in a breast cancer model is dependent on genetic background.</a> Cancer Res. 68 (15), 6251-6259 (2008).</li>
<li>Knox, J. J., Hotte, S. J., Kollmannsberger, C., Winquist, E., Fisher, B., Eisenhauer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+II+study+of+Triapine+in+patients+with+metastatic+renal+cell+carcinoma%3A+a+trial+of+the+National+Cancer+Institute+of+Canada+Clinical+Trials+Group+%28NCIC+IND.161%29%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+New+Drugs%22%5BJournal%5D)">Phase II study of Triapine in patients with metastatic renal cell carcinoma: a trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group (NCIC IND.161).</a> Invest New Drugs. 25 (5), 471-477 (2007).</li>
<li>Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D. L., Fojo, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+targeting+mitosis%3A+tales+of+how+great+drugs+against+a+promising+target+were+brought+down+by+a+flawed+rationale%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibitors targeting mitosis: tales of how great drugs against a promising target were brought down by a flawed rationale.</a> Clin Cancer Res. 18 (1), 51-63 (2012).</li>
<li>Tong, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+and+pharmacologic+study+of+SNS-032%2C+a+potent+and+selective+Cdk2%2C+7%2C+and+9+inhibitor%2C+in+patients+with+advanced+chronic+lymphocytic+leukemia+and+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I and pharmacologic study of SNS-032, a potent and selective Cdk2, 7, and 9 inhibitor, in patients with advanced chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma.</a> J Clin Oncol. 28 (18), 3015-3022 (2010).</li>
<li>Matulonis, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+II+study+of+MLN8237+%28alisertib%29%2C+an+investigational+Aurora+A+kinase+inhibitor%2C+in+patients+with+platinum-resistant+or+-refractory+epithelial+ovarian%2C+fallopian+tube%2C+or+primary+peritoneal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase II study of MLN8237 (alisertib), an investigational Aurora A kinase inhibitor, in patients with platinum-resistant or -refractory epithelial ovarian, fallopian tube, or primary peritoneal carcinoma.</a> Gynecol Oncol. 127 (1), 63-69 (2012).</li>
<li>Boss, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+evaluation+of+AZD1152%2C+an+i.v.+inhibitor+of+Aurora+B+kinase%2C+in+patients+with+solid+malignant+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical evaluation of AZD1152, an i.v. inhibitor of Aurora B kinase, in patients with solid malignant tumors.</a> Ann Oncol. 22 (2), 431-437 (2011).</li>
<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 211-224 (2006).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li>
<li>Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+a+dynamic+niche+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression.</a> J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).</li>
<li>Giri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arp2%2F3+complex+mediates+multigeneration+dendritic+protrusions+for+efficient+3-dimensional+cancer+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The Arp2/3 complex mediates multigeneration dendritic protrusions for efficient 3-dimensional cancer cell migration.</a> FASEB J. 27 (10), 4089-4099 (2013).</li>
<li>Fraley, S. I., Feng, Y., Giri, A., Longmore, G. D., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimensional+and+temporal+controls+of+three-dimensional+cell+migration+by+zyxin+and+binding+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dimensional and temporal controls of three-dimensional cell migration by zyxin and binding partners.</a> Nat Commun. 3, 719(2012).</li>
<li>Fraley, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinctive+role+for+focal+adhesion+proteins+in+three-dimensional+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility.</a> Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).</li>
<li>Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+forces+regulate+cell+division+in+three-dimensional+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments.</a> J Cell Biol. 205 (2), 155-162 (2014).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+3D+matrix+confinement+determines+division+axis+through+cell+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Local 3D matrix confinement determines division axis through cell shape.</a> Oncotarget. 7 (6), 6994-7011 (2016).</li>
<li>Held, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellCognition%3A+time-resolved+phenotype+annotation+in+high-throughput+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CellCognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging.</a> Nat Methods. 7 (9), 747-754 (2010).</li>
<li>Fallica, B., Maffei, J. S., Makin, G., Zaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+cellular+behavior+and+response+to+PI3K+pathway+inhibition+by+culture+in+3D+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Alteration of cellular behavior and response to PI3K pathway inhibition by culture in 3D collagen gels.</a> PLoS One. 7 (10), e48024(2012).</li>
<li>Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+a+three-dimensional%2C+microarray+environment+on+human+Cell+culture+in+drug+screening+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems.</a> Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).</li>
<li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+in+three-dimensional+collagen+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cells in three-dimensional collagen matrix.</a> Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-20 (2010).</li>
<li>Gunzer, M., Kampgen, E., Brocker, E. B., Zanker, K. S., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+dendritic+cells+in+3D-collagen+lattices.+Visualisation+of+dynamic+interactions+with+the+substratum+and+the+distribution+of+surface+structures+via+a+novel+confocal+reflection+imaging+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Migration of dendritic cells in 3D-collagen lattices. Visualisation of dynamic interactions with the substratum and the distribution of surface structures via a novel confocal reflection imaging technique.</a> Adv Exp Med Biol. 417, 97-103 (1997).</li>
<li>Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+cytoskeletal+organization+of+invasive+cancer+cells+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D.</a> J Vis Exp. (80), e50763(2013).</li>
<li>Lleres, D., James, J., Swift, S., Norman, D. G., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+chromatin+compaction+in+living+cells+using+FLIM-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of chromatin compaction in living cells using FLIM-FRET.</a> J Cell Biol. 187 (4), 481-496 (2009).</li>
<li>Poincloux, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+of+the+cell+rear+drives+invasion+of+breast+tumor+cells+in+3D+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Contractility of the cell rear drives invasion of breast tumor cells in 3D Matrigel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (5), 1943-1948 (2011).</li>
<li>Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+control+of+invasive+tumor+cell+behavior+by+extracellular+matrix+microarchitecture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture.</a> Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).</li>
<li>Langan, T. J., Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+mammalian+cell+cultures+by+serum+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation.</a> Methods Mol Biol. 761, 75-83 (2011).</li>
<li>Jackman, J., O'Connor, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+synchronizing+cells+at+specific+stages+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for synchronizing cells at specific stages of the cell cycle.</a> Curr Protoc Cell Biol. 8, (2001).</li>
<li>Zwanenburg, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+shake-off+to+synchronize+cultured+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Standardized shake-off to synchronize cultured CHO cells.</a> Mutat Res. 120 (2-3), 151-159 (1983).</li>
<li>Harper, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+cell+populations+in+G1%2FS+and+G2%2FM+phases+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle.</a> Methods Mol Biol. 296, 157-166 (2005).</li>
<li>Kihara, T., Ito, J., Miyake, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+biomolecular+diffusion+in+extracellular+matrix+condensed+by+fibroblasts+using+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Measurement of biomolecular diffusion in extracellular matrix condensed by fibroblasts using fluorescence correlation spectroscopy.</a> PLoS One. 8 (11), e82382(2013).</li>
<li>Ramanujan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+and+convection+in+collagen+gels%3A+implications+for+transport+in+the+tumor+interstitium%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium.</a> Biophys J. 83 (3), 1650-1660 (2002).</li>
<li>Harjanto, D., Maffei, J. S., Zaman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+effect+of+cancer+invasiveness+and+collagen+concentration+on+3D+matrix+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the effect of cancer invasiveness and collagen concentration on 3D matrix remodeling.</a> PLoS One. 6 (9), e24891(2011).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li>
<li>Petroll, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+interference+contrast+and+confocal+reflectance+imaging+of+collagen+organization+in+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Differential interference contrast and confocal reflectance imaging of collagen organization in three-dimensional matrices.</a> Scanning. 28 (6), 305-310 (2006).</li>
<li>Fraley, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+matrix+fiber+alignment+modulates+cell+migration+and+MT1-MMP+utility+by+spatially+and+temporally+directing+protrusions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional matrix fiber alignment modulates cell migration and MT1-MMP utility by spatially and temporally directing protrusions.</a> Sci Rep. 5, 14580(2015).</li>
<li>Ikeda, Y., Collins, M. K., Radcliffe, P. A., Mitrophanous, K. A., Takeuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transduction+efficiency+in+cells+of+different+species+by+HIV+and+EIAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene transduction efficiency in cells of different species by HIV and EIAV vectors.</a> Gene Ther. 9 (14), 932-938 (2002).</li>
<li>Ma, H. T., Poon, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of HeLa cells.</a> Methods Mol Biol. 761, 151-161 (2011).</li>
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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

由于实验限制和技术挑战，以往对三维环境中细胞分裂的研究效率较低18,19。高效研究哺乳动物细胞在三维胶原基质中分裂的关键步骤包括：（1）将荧光标记的有丝分裂标志物引入细胞；（2）同步化细胞分裂过程；（3）利用活细胞成像技术、时间分辨共聚焦反射显微镜及定量成像分析，对三维基质中的分裂事件进行监测。
在二维基质上，有丝分裂期细胞可根据其形态与间期细胞区分开来：有丝分裂期细胞呈圆形，几乎不贴附于基质；而间期细胞则铺展开并牢固贴附于基质。然而，在三维基质中，细胞形态并不能作为有丝分裂期细胞的可靠标志物，因为某些细胞在基质中几乎不铺展，始终保持圆形27,28。因此，在研究三维基质中的细胞分裂时，必须引入有丝分裂标志物。我们在 MDA-MB-231 细胞中稳定表达了 H2B-mCherry，该蛋白可作为识别不同有丝分裂阶段（包括前期、前中期、中期、后期以及末期/...

细胞有丝分裂是细胞生命过程中的关键事件，其调控在组织和器官发育中发挥着重要作用。异常的有丝分裂与自然遗传变异、人类衰老过程以及癌症进展相关1,2,3,4,5。尽管不同类型的肿瘤之间甚至不同患者之间的细胞行为存在较大异质性，但与正常细胞相比，肿瘤细胞增殖速率升高仍是癌症的重要特征之一。尽管一些新开发的抗有丝分裂药物在临床前研究中显示出良好前景，但在临床试验中并未表现出有效6,7,8,9,10,11。实验模型和临床前模型的相关性需要被充分考虑。许多类型的正常哺乳动物细胞和癌细胞在三维（3D）基质中进行分裂，例如富含I型胶原的三维结缔组织中的成纤维细胞和纤维肉瘤细胞，以及在三维间质细胞外基质（ECM）中的转移性癌细胞。然而，绝大多数哺乳动物细胞分裂实验和检测均是在二维（2D）基底上培养的细胞中进行的。工程化的三维基质能够更好地模拟正常和病变组织的三维ECM的微结构、力学特性以及生化信号12,13,14,15,16,17。
尽管哺乳动物细胞在三维环境中的分裂调控具有重要的生理相关性和治疗意义，但该领域的研究仍 largely 未被探索18,19。可能的原因包括在三维基质中研究细胞分裂所面临的技术难题和实验挑战。细胞有丝分裂在整个细胞周期中仅占很小的时间比例20。以往研究表明，许多哺乳动物细胞（如人乳腺腺癌细胞 MCF-7、人骨肉瘤细胞 U2OS 和人肝癌 HepG2 细胞）在三维基质中的增殖速率远低于其在二维基底上的对应情况21,22。此外，在活细胞成像过程中，嵌入三维基质中的细胞会移出或移入焦平面。上述所有因素共同导致利用成像技术在三维培养中捕获细胞分裂事件的效率极低。
细胞外基质（ECM）与细胞之间的相互作用在调控细胞分裂过程中发挥着关键作用。本文介绍了一种在三维胶原基质中高效研究哺乳动物细胞分裂的方法。该方法包括将有丝分裂标记物引入细胞、同步化细胞分裂过程，以及利用活细胞成像技术、时间分辨共聚焦反射显微镜和定量图像分析来监测三维基质中的分裂事件。首先将荧光标记的组蛋白H2B导入细胞，作为区分有丝分裂期与间期细胞的标记物。随后采用胸苷阻断与诺考达唑处理相结合的方法对细胞进行同步化，并辅以机械振荡收获法。同步化后的细胞可直接包埋于三维胶原基质中。通过低倍率的时间序列活细胞成像，可高效监测多个细胞的分裂过程。利用高倍率共聚焦反射显微镜监测胶原纤维的形变，该形变为细胞-基质相互作用的重要指标。
我们此前已使用该技术在三维胶原基质中监测并量化了两种转移性癌细胞系——人侵袭性导管癌 MDA-MB-231 和人纤维肉瘤 HT1080 细胞——在有丝分裂前、中、后阶段的细胞-基质相互作用19。本文所介绍的方法为研究哺乳动物细胞在三维环境中的分裂过程以及细胞-基质相互作用提供了一种高效且通用的途径。全文以 MDA-MB-231 细胞系为例进行说明。该实验方案为理解正常组织发育及疾病发生的分子基础提供了新的见解，同时也可能有助于设计新的诊断和治疗策略。

<table><tbody><tr><td>人胚胎肾细胞 293T</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>美国国立卫生研究院物理科学肿瘤学中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 干粉</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12100-046</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 100X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life technologies</td><td>11668-07</td><td></td></tr><tr><td>编码 H2B-mCherry 的慢病毒载体质粒</td><td>Addgene</td><td>质粒 21217</td><td></td></tr><tr><td>胸腺嘧啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td></td></tr><tr><td>诺考达唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>GibcoBRL</td><td>11810-025</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>113375-100</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T. Baker</td><td>3722-01</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV 注射器滤器，0.45-&amp;mu;m，PVDF，33 mm</td><td>Millipore</td><td>SLHVM33RS</td><td></td></tr><tr><td>Nikon TE2000E 正置荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>TE2000E</td><td></td></tr><tr><td>Cascade 1K CCD 相机</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 成像软件</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td>A1</td><td></td></tr></tbody></table>

通过定量共聚焦反射显微镜观察三维基质中的哺乳动物细胞分裂

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

尽管哺乳动物细胞分裂在三维环境中的调控机制具有重要的生理相关性和治疗意义，但该领域的研究仍 largely未被充分探索。研究不足的可能原因在于实验限制和技术挑战，导致在三维培养条件下研究细胞分裂效率低下。本文介绍了一种基于成像的方法，可高效研究哺乳动物细胞在三维胶原基质中的细胞分裂过程及细胞-基质相互作用。通过胸苷阻断与诺考达唑处理相结合的方法对荧光标记组蛋白H2B的细胞进行同步化，随后采用机械振落技术收集细胞。将同步化的细胞包埋于三维胶原基质中，利用活细胞显微镜实时监测细胞分裂过程。通过定量共聚焦反射显微镜，可监测并量化细胞分裂期间及分裂后胶原纤维的形变，该形变是细胞-基质相互作用的指标。该方法为在生理相关的三维环境中研究哺乳动物细胞分裂和细胞-基质相互作用提供了一种高效且通用的策略。此方法不仅有助于深入理解正常组织发育及疾病发生的分子基础，也为设计新型诊断和治疗策略提供了可能。

本文的目的是介绍一种基于成像的方法，用于在三维基质中研究哺乳动物细胞的分裂过程，并量化细胞在分裂期间及分裂后与三维细胞外基质之间的相互作用。为了便于观察细胞有丝分裂，我们通过慢病毒转导将H2B-mCherry导入MDA-MB-231细胞中。H2B与荧光蛋白的融合体被用作有丝分裂标记物，以区分有丝分裂细胞与间期细胞，并定义细胞有丝分裂过程中的不同阶段19,20,26。利用该方法，我们能够监测稳定表达H2B-mCherry的MDA-MB-231细胞在三维胶原基质中完整的分裂过程（图1A）。有丝分裂各阶段始于核膜的解体（前期；第1帧，图1A）；随后为染色体的重新排列（前中期：第2帧）；染色体在细胞体中央排列（中期；第3帧）；染色体分离（后期；第4帧）；最后为染色体与核膜的重新...

本方案通过整合细胞分裂同步化、利用活细胞成像技术在三维胶原基质中监测分裂事件、时间分辨共聚焦反射显微镜以及定量成像分析，高效地研究哺乳动物细胞在三维胶原基质中的分裂过程。

哺乳动物细胞分裂在三维环境中如何被调控的研究，尽管具有重要的生理相关性和治疗意义，但至今仍 largely 未被深入探索。

本实验的总体目标是在生理相关的三维环境中研究哺乳动物细胞分裂以及细胞与基质的相互作用。该技术的主要优势在于，它提供了一种高效且通用的方法，用于研究哺乳动物细胞的分裂过程及细胞与基质之间的相互作用。该方法有助于解答细胞生物学领域的一些关键问题，例如正常组织和病变组织发育的分子基础。转染前一天，将五百万个HEK-293 T细胞接种于100毫升细胞培养皿中，加入10毫升正常细胞培养基。将细胞置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中培养24小时。次日开始转染前，从4摄氏度冰箱中取出一管转染试剂，放置于室温使其升温至室温。首先，向无菌微量离心管中加入一毫升低血清培养基。然后加入指定量的用于转染的慢病毒载体质粒，并用移液器吹打混匀。室温孵育五分钟。五分钟后，向该离心管中加入48 µL转染试剂，用移液器轻轻混匀。随后，将该混合物在室温下孵育至少15分钟。孵育完成后，从培养箱中取出含有HEK-293 T细胞的培养板。将制备好的DNA转染试剂混合物逐滴加入细胞中，并轻轻摇动培养板以确保液体在板内均匀分布。将培养板放回培养箱中。转染约六小时后，取出培养板并吸除培养基。加入10毫升新鲜培养基，将培养板放回培养箱中。在转染后的多个时间点（24、48和72小时），分别收集含有慢病毒颗粒的培养基至不同的离心管中。接着，将收集的培养基通过无菌的0.45微米滤膜过滤，以去除细胞碎片。每次收获后均需更换新鲜的培养基。含有慢病毒颗粒的滤液可立即用于转导，也可在负80摄氏度保存。将人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 接种于含正常培养基的35毫米培养皿中。将这些细胞置于含5%二氧化碳的湿润化培养箱中，在37摄氏度下孵育24小时。次日，吸去培养板中的培养基，并加入1毫升慢病毒颗粒与1毫升新鲜培养基。将细胞在培养箱中继续孵育约16小时。病毒颗粒孵育完成后，取出培养板以吸除培养基。随后加入两毫升新鲜培养基，并将培养板放回培养箱中继续培养24至72小时。使用落射荧光显微镜检测这些转导细胞中H2B-mCherry的表达情况。开始同步化实验时，首先将表达 H2B-mCherry 的 MDA-MB-231 细胞以 50% 至 60% 的融合度接种于 24 孔板中。将细胞在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养 24 小时。次日，将培养基更换为含有 2 毫摩尔胸腺嘧啶的 0.5 毫升培养基。将培养板置于培养箱中孵育24小时。孵育结束后，用PBS洗涤细胞三次，以解除胸腺嘧啶处理的作用。然后将细胞在培养箱中继续培养5小时，每孔加入0.5毫升正常培养基。此后，为了将这些细胞阻滞在有丝分裂期，向培养基中加入诺考达唑。将细胞在培养箱中孵育12小时。诺考达唑处理完成后，取出培养板，使用轨道摇床轻轻振荡细胞45秒至1分钟，以释放有丝分裂期的细胞。随后，将含有已提取有丝分裂细胞的培养基转移至新的离心管中。然后向每孔加入0.5毫升新鲜培养基。之后，再重复振荡和细胞提取操作两次。将收集的全部培养基合并，然后离心以沉淀有丝分裂细胞。离心后，用 0.25 毫升新鲜细胞培养基重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。在此步骤开始时，准备 50 毫升 10x DMEM 溶液并进行过滤除菌。接下来，根据文本方案中规定，确定用于制备 3D 胶原蛋白基质的所有组分的体积。将所有这些组分预先在冰上冷却，以减缓胶原蛋白的凝胶化过程。现在，向预冷的1.5毫升离心管中加入所需数量的细胞悬液，然后依次加入10倍浓缩的DMEM、FBS、去离子水、胶原蛋白，最后加入氢氧化钠。使用1毫升移液器轻轻混匀。待溶液充分混合后，将500微升混合液加入24孔板的每个孔中。将24孔板放入37摄氏度的培养箱中。30分钟后取出培养板，在凝胶上加入500 µL预热的培养基。成像前，打开相差显微镜和共聚焦显微镜的活细胞培养装置。为了捕获正在分裂的细胞，将含有包埋在胶原基质中细胞的24孔板放入荧光显微镜的活细胞成像单元。使用10倍物镜，先找到孔板底部，然后向上移动载物台，使显微镜聚焦在距离孔板底部约500微米的位置。移动载物台以寻找处于不同有丝分裂阶段的细胞，并选择多个位置进行成像。以两分钟为间隔设置延时实验。接下来，为了成像胶原网络，将共聚焦显微镜配置为仅采集488纳米激光的反射光。然后将含有细胞-胶原凝胶复合物的培养板放入该显微镜的活细胞成像单元中。找到培养板的底部，然后向上移动物镜，使其聚焦在距离培养板底部约 100 µm 的位置。移动载物台以寻找细胞，并选择多个成像位置。设置时间间隔为五分钟的延时成像实验。嵌入胶原基质中的表达 H2B-mCherry 的 MDA-MB-231 细胞分裂过程的荧光图像如图所示。有丝分裂的不同阶段清晰可见，符合预期。利用共聚焦反射显微镜同时观察到的白色胶原纤维分布，在整个有丝分裂过程中变化甚微。处于G2-M期同步化的细胞被包埋在胶原基质中后，可在前两小时内完成细胞分裂，而作为对照的非同步化细胞则随机进行分裂。对间期和有丝分裂各阶段胶原纤维分布的定量分析表明，细胞分裂过程中基质形变最小，而在间期细胞中形变程度较高。一旦掌握该技术，从稳定细胞系的构建到在三维基质中分析活细胞分裂视频，整个流程可在七天内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何利用活细胞成像技术在三维基质中同步并监测哺乳动物细胞的分裂过程，以及如何通过共聚焦反射显微镜结合定量成像分析技术来确定基质的形变情况。

mammalian-cell-division-3d-matrices-via-quantitative-confocal

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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通过定量共聚焦反射显微镜观察三维基质中的哺乳动物细胞分裂

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