Bioink Precellularization 无源混合装置打印软骨及皮肤组织类似物的应用

软骨和皮肤类似物是 bioprinted 使用 nanocellulose 藻酸盐为基础的 bioink。在通过单步被动混合装置打印前, bioinks cellularized。证明该结构具有均匀 cellularized, 具有较高的生存能力, 并具有良好的分化标志。

该程序的总体目标是促进用于生物打印应用的生物墨水的快速和可重复的预细胞化，同时保持细胞活力。在将细胞悬液与生物墨水混合时，这种方法可以帮助简化和提高可重复性，以确保活细胞的打印。该技术的主要优点是，它消除了我们在封闭系统中将细胞与生物墨水混合的能力，并且具有最少的处理和样品损失的风险。

这种方法的视觉演示至关重要，因为如果组装执行不当，则存在混合不当的风险。首先，获得两个注射器。一个注射器用于细胞悬液，另一个注射器用于生物墨水。

本研究中使用的混合比为 10 比 1。因此，请按照 10 比 1 混合装置的要求使用 12 毫升注射器和 1 毫升注射器。此外，获得一个无菌被动混合装置，该装置可以通过鲁尔锁连接和无菌母-母鲁尔锁连接器与双注射器连接。

检索一个分液装置，该分液装置可以以受控速率同时从两个无菌注射器中挤出一定体积。最后，获得无菌墨盒，将生物墨水和细胞悬液直接混合到其中。在该方案中，使用了基于纳米纤维素藻酸盐的生物墨水，该墨水通过在打印后添加氯化钙溶液进行交联。

要制备细胞，请使用 0.5% 胰蛋白酶 EDTA 溶液将其分离。在该方案中，使用人成纤维细胞。然后，使用台盼蓝排除法计算细胞总数。

确定最终打印构建体中所需的细胞密度。计算必须稀释以达到此目标最终细胞密度的收获细胞的浓度。在该方案中，使用的最终细胞密度为每毫升 500 万个细胞。

将细胞悬液转移到细胞悬液注射器中。同时将生物墨水转移到另一个注射器上。接下来，将 bioink 注射器柱塞向后拉，将注射器插入分配装置。

确保回拉式注射器中至少有一半的体积是来自生物安全柜内的无菌空气。在插入点胶装置期间，保持注射器柱塞的位置非常重要。垂直放置装置，使鲁尔锁连接器向上。

然后将细胞注射器的柱塞拉回与生物墨水注射器相似的长度，并将其插入分配装置。确保混合装置均匀地连接到两个注射器上，确保细胞悬液或生物墨水不会意外排出。混合前仔细检查。

通过扭转鲁尔锁连接器，将两个注射器连接到混匀装置上。然后通过推动分配单元以挤出注射器中的空气来灌注混合系统。在溶液到达鲁尔锁之前停止灌注。

灌注后，通过鲁尔锁连接器将灌装盒连接到混合装置的末端。在连接之前，确保填充盒中的柱塞位于底部。缓慢压缩分配单元，将生物墨水和细胞悬液混合到墨盒中。

混合后，用无菌移液器吸头向下推动填充盒中的柱塞，以接触生物墨水细胞混合物。保持分配单元压缩，以确保细胞生物墨水混合物不会被挤出回混合单元中。盖上墨盒并轻轻敲击工作台面，将任何气泡移动到墨盒顶部。

此时，细胞生物墨水混合物已准备好进行打印。在该协议中，尺寸为 4.8 x 4.8 x 0.9 立方毫米的方形结构被导出为立体光固化成型文件。使用文本协议中的设置生成了晶格结构的 g 代码文件。

按照参考方案从患者身上分离和冷冻保存原代人鼻软骨细胞 （HNC）。解冻和扩增冻存的 HNC，并使用标准培养基在 37 摄氏度的单层培养物中扩增一次。用 0.5% 胰蛋白酶 EDTA 溶液在 80% 至 90% 汇合处分离细胞，并使用台盼蓝排除方案计数。

所有实验均在第 2 代使用 HNCs 进行。我们将 HNC 以每毫升 1 亿个细胞悬浮在 300 微升培养基中，补充有 10% 胎牛血清、1% 青霉素链霉素和每毫升 50 微克抗坏血酸，以准备与生物墨水混合。按照被动混合单元方案，以 10 比 1 的生物墨水与细胞悬液比例将 HNC 细胞悬液混合到基于纳米纤维素藻酸盐的生物墨水中，以获得每毫升 900 万个细胞的最终细胞浓度。

确保生物打印机通过紫外线照射消毒并用 70% 乙醇擦拭。通过将生物打印机放置在层流柜中来保持无菌。然后将无菌打印喷嘴连接到含有生物墨水细胞悬浮混合物的墨盒上，并将它们插入生物打印机中。

校准生物打印机后，使用 25 号锥形喷嘴在 25 千帕的压力下生物打印载有晶格结构的细胞构建体。Bioprint 无细胞构建体作为对照。通过添加 100 毫升或氯化钙的离子溶液来交联构建体。

五分钟后，冲洗构建体。然后在标准培养条件下在培养基中孵育构建体，每隔两天或第三天更换一次培养基。在第 2 周和第 4 周收集样本进行组织学分析。

使用 alcian blue 染色剂对样品进行糖胺聚糖或 GAG 生产染色。此处显示的是与被动混合装置或手动混合技术混合后 24 小时的细胞活力。随着混合程度的增加，被动混合装置显示出更好的活力。

这很重要，因为在制备大批量的预细胞化生物墨水时，可能需要更长的混合时间。此处显示了培养第 14 天和第 28 天的细胞活力。良好的细胞活力可视化，使用该技术时显示长期细胞存活。

糖胺聚糖在生物打印的软骨构建体中可视化，在第 0 天、第 14 天和第 28 天使用阿尔新蓝染色。这些图像显示了这些生物打印结构中新软骨的形成。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 30 分钟内完成。

观看此视频后，您应该对如何利用被动混合单元系统对生物墨水细胞化有一个很好的了解。开发后，这项技术为生物打印领域的研究人员通过温和的混合技术快速均匀地细胞化生物墨水铺平了道路。