Name: Bioink Precellularization 无源混合装置打印软骨及皮肤组织类似物的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 学习利用无源混合装置对纳米纤维素-海藻酸盐生物墨水进行预细胞化处理，以实现高细胞存活率和均匀细胞分布的生物打印软骨及皮肤组织类似物。该方法可简化细胞悬液与生物墨水的混合流程。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者无致谢。

本方案遵循查尔姆斯理工大学人类研究伦理委员会的指导方针。
注意：所有步骤均须在无菌生物安全柜内进行。
1. 耗材、生物墨水和细胞的准备
<ol>
	<li>获取两支注射器，一支注射器（图1a）用于细胞悬液，而另一个注射器用于生物墨水（图1b).</li>
	<li>获取无菌的被动混合装置（图1c可通过鲁尔锁接头与双注射器连接。</li>
	<li>获取一个分配单元（图1d）能够以受控速率同时从两个无菌注射器中挤出液体体积。 
	注意：本研究中使用的混合比例为10:1。因此，应根据10:1的混合单位要求，使用12 mL注射器和1 mL注射器。</li>
	<li>获取无菌卡盒（图1e）以及一个无菌的雌-雌型鲁尔锁接头，用于直接混合生物墨水和细胞悬液。</li>
	<li>获取或制备用于与细胞悬液混合的生物墨水。 
	注意：在本实验方案中，使用了一种基于纳米纤维素/海藻酸盐的生物墨水。该生物墨水通过加入无菌的 100 mM CaCl₂ 实现交联2 打印后溶液</li>
	<li>使用0.5%胰蛋白酶/EDTA溶液消化细胞，并用台盼蓝排斥法计数细胞总数17. 
	注意：本方案中使用了人成纤维细胞。</li>
	<li>确定最终打印结构中所需的细胞密度。利用以下公式计算收获细胞的浓度，该浓度需经稀释以达到目标终末细胞密度。 
	注意：在本方案中，细胞终密度为 5 x 106 cells/mL 被使用。
	<ol>
		<li>为实验选择所需的细胞浓度： C细胞 (个细胞/毫升)</li>
		<li>计算所需的生物墨水量 V生物墨水，根据所需的构建体总数： 
		V生物墨水 = V构建 × N构建体 
		注意：例如，每个构建物所需的生物墨水体积为 100 µL。若打印 30 个构建物，则所需生物墨水总体积为 3 mL。</li>
		<li>计算所需细胞数量： 
		N细胞 = C细胞 (1.1 × V生物链接)</li>
		<li>重悬细胞（N细胞) 在 1/10th 生物墨水的体积： 
		V细胞悬液 = 0.1 × V生物链接 
		注意：例如，如果 V生物墨水 = 3 mL，然后 V细胞悬液 = 0.1 × 3 mL = 0.3 mL</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞悬液与生物墨水的混合
<ol>
	<li>将细胞悬液转移至细胞悬液注射器中。</li>
	<li>将生物墨水转移至另一支注射器，或取一支已装有生物墨水的注射器。</li>
	<li>向后拉动生物墨水注射器的活塞，并将注射器插入分配单元。将单元垂直放置，鲁尔锁接头朝上（图1f1）。</li>
	<li>将细胞悬液注射器的活塞向后拉动至与生物墨水注射器相近的长度，然后插入分配单元（图1f2）。</li>
	<li>通过旋转鲁尔锁接头，将两支注射器连接至混合单元（图1f3）。</li>
	<li>推动分配单元，排出注射器中的空气，以对混合系统进行预润。在溶液到达鲁尔锁接头前停止预润操作（图1g4）。</li>
	<li>预润完成后，通过鲁尔锁接头将填充筒连接至混合单元末端（图1g5）。连接前确保填充筒内的活塞位于底部。</li>
	<li>缓慢按压分配单元（图1h6），使生物墨水与细胞悬液混合并注入筒内（图1i7）。</li>
	<li>混合后，使用无菌移液器吸头向下推动填充筒内的活塞，使其接触生物墨水-细胞混合物。持续按压分配单元，以防止细胞/生物墨水混合物回流至混合单元中。</li>
	<li>盖上筒帽，并轻轻敲击工作台面，使任何气泡移至筒体顶部（活塞端）。 
	注意：此时细胞/生物墨水混合物已准备好用于打印。以下部分将介绍具体应用及打印程序。</li>
</ol>
3. 使用混合装置与手动刮勺混合测定细胞活力的比较
<ol>
	<li>在80%汇合度时，用0.5%胰蛋白酶/EDTA溶液消化分离人成纤维细胞（第7代），计数后重悬于培养基中，调整细胞密度，使其与生物墨水混合（细胞:生物墨水比例为1:10）后的终浓度达到5 × 10⁶ 个细胞/mL6 cells/mL</li>
	<li>使用被动混合单元技术（步骤2）或刮刀法将细胞混入生物墨水，以评估两种技术对细胞活力的影响。</li>
	<li>使用被动混合单元技术，在将细胞与生物墨水混合后，于注入模具进行交联前混合1、2或3次，交联使用100 mM CaCl₂2. 
	注意：如需进行额外的混合，可将细胞/生物墨直接混入注射器而非墨盒中。随后按照之前的方案通过混合单元重新混合，但无需使用细胞注射器组件。</li>
	<li>将细胞通过刮刀手动机械混合的方式分别混入另一种生物墨水，混合时间分别为30、60或90秒。将各混合时间的混合物转移至模具中，使用100 mM CaCl₂进行交联2.</li>
	<li>交联完成后，将样品转移至培养板中，并在标准条件下继续培养。</li>
	<li>培养1天后，洗涤构建物（n 每组3-4个，在无血清细胞培养基中孵育30分钟。将构建物中的细胞用染色液（4 µM Calcein AM，1 µM Ethidium homodimer-1）染色30分钟。
	<ol>
		<li>再洗涤两次，将样品置于无血清的细胞培养基中，在37 °C下孵育1小时。将样品转移至活细胞成像溶液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过数字彩色相机以10倍放大倍数采集图像&#160;使用配备 FITC 和 Texas Red 滤光片的倒置显微镜进行放大观察，并利用图像分析软件进行分析。</li>
	<li>从每种构建体中随机选取三张图像，用于细胞活力的定量分析。</li>
	<li>根据活细胞数与细胞总数的比例计算存活率。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）对数据进行分析，随后进行Tukey多重比较检验。</li>
</ol>
4. 使用单一细胞类型生物打印软骨类似物
<ol>
	<li>绘制所需组织类似物的三维模型。将其转换为适用于生物打印的Gcode文件，并将该Gcode文件加载至生物打印机上1。 
	注意：在本方案中，一个尺寸为4.8 × 4.8 × 0.9 mm3的方形结构被导出为STL文件。使用以下参数生成晶格结构的Gcode文件：层厚0.3 mm；填充模式为直线型；填充密度25%；打印速度10 mm/s。</li>
	<li>根据参考方案1，从患者体内分离并冷冻保存原代人鼻软骨细胞（hNC）。</li>
	<li>解冻冷冻保存的hNC，并在37 °C条件下使用标准培养基进行单层培养扩增一次。当细胞融合度达到80–90%时，用0.5%胰蛋白酶/EDTA溶液消化细胞，并采用台盼蓝排斥法计数。所有实验均使用第2代hNC进行。</li>
	<li>将hNC以100 × 106 个细胞/mL的密度重悬于300 µL培养基中，培养基中添加10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和50 µg/mL抗坏血酸，用于后续与生物墨水混合。</li>
	<li>按照被动混合单元方案，将hNC细胞悬液以10:1的生物墨水:细胞悬液比例混入基于纳米纤维素/海藻酸盐的生物墨水中，最终获得9 × 106 个细胞/mL的细胞浓度。</li>
	<li>通过紫外照射对生物打印机进行灭菌，并用70%乙醇擦拭表面。将设备置于超净工作台内以维持无菌环境。</li>
	<li>将无菌打印喷嘴安装到含有生物墨水/细胞悬液混合物的 cartridge 上，并插入生物打印机中。</li>
	<li>根据打印机的具体要求，手动或按照特定协议校准生物打印机。</li>
	<li>采用以下打印参数进行负载细胞的晶格结构生物打印：使用25G锥形喷嘴，施加25 kPa压力。同时打印不含细胞的对照组结构（与不含细胞的培养基混合）。</li>
	<li>通过加入100 mM CaCl2离子溶液交联5分钟。随后冲洗结构，并在标准培养条件（37 °C、5% CO2、95%相对湿度）下置于培养基中孵育。每隔两至三天更换一次培养基。</li>
	<li>在第2周和第4周采集样品进行组织学分析。使用阿利新蓝染色法对样品进行GAG生成染色18。</li>
</ol>
5. 两种细胞类型的皮肤类似物生物打印
<ol>
	<li>绘制所需组织类似物的三维模型，并转换为用于生物打印的Gcode文件。将Gcode文件加载到生物打印机上。 
	注意：在本方案中，一个尺寸为4.8 × 4.8 × 0.9 mm3的方形结构被导出为STL文件。随后使用以下参数生成晶格结构的Gcode文件：层厚0.3 mm；填充模式为直线型；填充密度25%；打印速度10 mm/s。</li>
	<li>准备细胞，用于与生物墨水混合以进行生物打印。在构建皮肤类似物时，使用了两种细胞类型。将这两种细胞混合至生物墨水中并进行生物打印。
	<ol>
		<li>获取原代人真皮成纤维细胞（HDF）。在添加10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和50 µg/mL抗坏血酸的DMEM培养基中培养这些细胞。当细胞融合度达到80–90%时，使用0.5%胰蛋白酶/EDTA溶液消化并计数。</li>
		<li>根据参考方案1从患者样本中分离并冻存原代人神经嵴细胞（hNC）。解冻后，在单层培养中扩增冻存的hNCs。当细胞融合度达到80–90%时，使用0.5%胰蛋白酶/EDTA溶液消化并计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将两种细胞分别以100 × 106 个细胞/mL的浓度重悬于生长培养基中。按1:1比例混合两种细胞悬液，最终获得总体积300 µL、总细胞浓度为100 × 106 个细胞/mL的混合液。</li>
	<li>按照被动混合单元方案，以10:1的生物墨水与细胞悬液比例，将HDF与hNC按50:50比例混合的细胞悬液加入基于纳米纤维素/海藻酸盐的生物墨水中，最终获得细胞浓度为9 × 106 个细胞/mL的打印材料。</li>
	<li>确保生物打印机已灭菌，或将其置于超净工作台内，以维持无菌环境。</li>
	<li>将无菌打印喷嘴安装至含有生物墨水/细胞悬液混合物的 cartridge 上，并插入生物打印机中。</li>
	<li>根据打印机的具体要求，手动或按照特定协议对生物打印机进行校准。</li>
	<li>使用以下打印参数进行负载细胞的晶格结构构建物的生物打印：采用25G锥形喷嘴，压力为25 kPa。同时打印不含细胞的对照组构建物（使用不含细胞的培养基混合物）。</li>
	<li>通过加入100 mM CaCl2离子溶液交联5分钟。随后冲洗构建物，并在标准培养条件下（37 °C、5% CO2、95%相对湿度）的培养基中孵育。每隔两到三天更换一次培养基。</li>
	<li>在第2周和第4周采集样品进行组织学分析。使用Masson三色染色法19对样品进行染色，检测I型胶原的生成情况。</li>
</ol>

<ol><li>Avila, H. M., Schwarz, S., Rotter, N., Gatenholm, P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405886616300045">3D bioprinting of human chondrocyte-laden nanocellulose hydrogels for patient-specific auricular cartilage regeneration.</a> Bioprinting. 1, 22-35 (2016).</li>
<li>Lee, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+human+skin+by+three-dimensional+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting.</a> Tissue Eng Part C Methods. 20 (6), 473-484 (2013).</li>
<li>Costantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic-enhanced+3D+bioprinting+of+aligned+myoblast-laden+hydrogels+leads+to+functionally+organized+myofibers+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Microfluidic-enhanced 3D bioprinting of aligned myoblast-laden hydrogels leads to functionally organized myofibers in vitro and in vivo.</a> Biomaterials. 131, 98-110 (2017).</li>
<li>Fedorovich, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofabrication+of+Osteochondral+Tissue+Equivalents+by+Printing+Topologically+Defined%2C+Cell-Laden+Hydrogel+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Biofabrication of Osteochondral Tissue Equivalents by Printing Topologically Defined, Cell-Laden Hydrogel Scaffolds.</a> Tissue Eng Part C Methods. 18 (1), 33-44 (2011).</li>
<li>Vijayavenkataraman, S., Lu, W. F., Fuh, J. Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+skin%3A+a+state-of-the-art+review+on+modelling%2C+materials%2C+and+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of skin: a state-of-the-art review on modelling, materials, and processes.</a> Biofabrication. 8 (3), 032001(2016).</li>
<li>Peltola, S. M., Melchels, F. P. W., Grijpma, D. W., Kellomäki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+rapid+prototyping+techniques+for+tissue+engineering+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Med%22%5BJournal%5D)">A review of rapid prototyping techniques for tissue engineering purposes.</a> Ann Med. 40 (4), 268-280 (2008).</li>
<li>Xu, T., Jin, J., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet+printing+of+viable+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Inkjet printing of viable mammalian cells.</a> Biomaterials. 26 (1), 93-99 (2005).</li>
<li>Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+damage+evaluation+of+thermal+inkjet+printed+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells.</a> Biotechnol Bioeng. 106 (6), 963-969 (2010).</li>
<li>Parsa, S., Gupta, M., Loizeau, F., Cheung, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+surfactant+and+gentle+agitation+on+inkjet+dispensing+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Effects of surfactant and gentle agitation on inkjet dispensing of living cells.</a> Biofabrication. 2 (2), 025003(2010).</li>
<li>Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev-matsci-070909-104502">Inkjet printing of functional and structural materials: fluid property requirements, feature stability, and resolution.</a> Annu Rev Mater Res. 40, 395-414 (2010).</li>
<li>Colosi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Bioprinting+of+Heterogeneous+3D+Tissue+Constructs+Using+Low-Viscosity+Bioink%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low-Viscosity Bioink.</a> Adv Mater. 28 (4), 677-684 (2016).</li>
<li>Ober, T. J., Foresti, D., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+mixing+of+complex+fluids+at+the+microscale%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Active mixing of complex fluids at the microscale.</a> Proc Natl Acad Sci. 112 (40), 12293-12298 (2015).</li>
<li>Shabnam, P., Madhuja, G., Frédéric, L., Karen, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+surfactant+and+gentle+agitation+on+inkjet+dispensing+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Effects of surfactant and gentle agitation on inkjet dispensing of living cells.</a> Biofabrication. 2 (2), 025003(2010).</li>
<li>Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+piezoelectric+cell+printing+accuracy+and+reliability+through+neutral+buoyancy+of+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions.</a> Biotechnol Bioeng. 109 (11), 2932-2940 (2012).</li>
<li>Niu, X., Lee, Y. -K. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/13/3/316">Efficient spatial-temporal chaotic mixing in microchannels.</a> J Micromech Microeng. 13 (3), 454(2003).</li>
<li>Liu, R. H., et al. <a target="_blank" href="https://asu.pure.elsevier.com/en/publications/passive-mixing-in-a-three-dimensional-serpentine-microchannel">Passive mixing in a three-dimensional serpentine microchannel.</a> J Microelectromech Syst. 9 (2), 190-197 (2000).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+protoc+immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr protoc immunol. , A3. B. 1-A3. B (2001).</li>
<li>Scott, J., Dorling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+staining+of+acid+glycosaminoglycans+%28mucopolysaccharides%29+by+alcian+blue+in+salt+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential staining of acid glycosaminoglycans (mucopolysaccharides) by alcian blue in salt solutions.</a> Histochem Cell Biol. 5 (3), 221-233 (1965).</li>
<li>Garvey, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+elastic+tissue-Masson+trichrome+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+technol%22%5BJournal%5D)">Modified elastic tissue-Masson trichrome stain.</a> Stain technol. 59 (4), 213-216 (1984).</li>
<li>Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. -M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+heterogeneous+tissue+constructs+containing+multiple+cell+types+prepared+by+inkjet+printing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology.</a> Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).</li>
<li>Kolesky, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+vascularized%2C+heterogeneous+cell-laden+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs.</a> Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).</li>
<li>Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+bioprinting+of+thick+vascularized+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues.</a> Proc Natl Acad Sci. 113 (12), 3179-3184 (2016).</li>
<li>Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimaterial+bioink+method+for+3D+printing+tunable%2C+cell-compatible+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels.</a> Adv Mater. 27 (9), 1607-1614 (2015).</li>
<li>KÖpf, M., Campos, D. F. D., Blaeser, A., Sen, K. S., Fischer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tailored+three-dimensionally+printable+agarose-collagen+blend+allows+encapsulation%2C+spreading%2C+and+attachment+of+human+umbilical+artery+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">A tailored three-dimensionally printable agarose-collagen blend allows encapsulation, spreading, and attachment of human umbilical artery smooth muscle cells.</a> Biofabrication. 8 (2), 025011(2016).</li>
<li>Gurkan, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+anisotropic+biomimetic+fibrocartilage+microenvironment+by+bioprinting+mesenchymal+stem+cells+in+nanoliter+gel+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Engineering anisotropic biomimetic fibrocartilage microenvironment by bioprinting mesenchymal stem cells in nanoliter gel droplets.</a> Mol Pharm. 11 (7), 2151-2159 (2014).</li>
<li>Ma, Y., Ji, Y., Huang, G., Ling, K., Zhang, X., Xu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+3D+cell-laden+hydrogel+microarray+for+screening+human+periodontal+ligament+stem+cell+response+to+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Bioprinting 3D cell-laden hydrogel microarray for screening human periodontal ligament stem cell response to extracellular matrix.</a> Biofabrication. 7 (4), 044105(2015).</li>
<li>Lu, H. H., Thomopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+attachment+of+soft+tissues+to+bone%3A+development%2C+healing%2C+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Functional attachment of soft tissues to bone: development, healing, and tissue engineering.</a> Annu Rev Biomed Eng. 15, 201-226 (2013).</li>
<li>Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+viability+of+stem+cells+during+syringe+needle+flow+through+the+design+of+hydrogel+cell+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers.</a> Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2011).</li>
<li>Parisi-Amon, A., Mulyasasmita, W., Chung, C., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Engineered+Injectable+Hydrogel+to+Improve+Retention+of+Transplanted+Adipose-Derived+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Protein-Engineered Injectable Hydrogel to Improve Retention of Transplanted Adipose-Derived Stem Cells.</a> Adv Healthc Mater. 2 (3), 428-432 (2013).</li>
<li>Qiu, X., De Jesus, J., Pennell, M., Troiani, M., Haun, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+for+mechanical+dissociation+of+cancer+cell+aggregates+into+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device for mechanical dissociation of cancer cell aggregates into single cells.</a> Lab Chip. 15 (1), 339-350 (2015).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+interactions+with+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell interactions with three-dimensional matrices.</a> Curr Opin Cell Biol. 14 (5), 633-640 (2002).</li>
<li>Loessner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+3D+platform+to+explore+cell-ECM+interactions+and+drug+resistance+of+epithelial+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells.</a> Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).</li>
<li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li>
</ol>

本文手稿的作者为 CELLINK LLC 的员工。

如本论文所示，预先接种细胞的生物墨水被用于生物打印软骨或皮肤类似物，并培养长达4周。采用被动混合单元技术混合后，细胞活力高于传统混合方法。此外，使用混合单元简化了混合过程，减少了操作步骤，提高了混合程度的一致性。最终，这使得生物墨水内的细胞分布以及不同构建物和实验组之间均具有更好的可重复性。培养4周后，分别在软骨和皮肤类似物中观察到特异性细胞外基质成分（如糖胺聚糖和I型胶原）的沉积。这表明该混合技术及所选构建几何结构在制备不同组织靶标方面具有灵活性。软骨和皮肤类似物的制备均体现了纳米纤维素-海藻酸盐生物墨水及生物打印技术在不同工程化组织靶标应用中的适应性。下文将讨论本研究的两个组成部分：（1）被动混合单元技术，以及（2）细胞在软骨和皮肤类似物中的行为。
开发并优化一种将细胞悬液混合到生物墨水中的技术，对于这些结构的制备至关重要。与传统的低黏度水凝胶材料不同，生物墨水的高黏度导致在打印前难以实现细胞的预加载。作为传统细胞掺入生物墨水方法的替代方案，本文建立并讨论了一种将细胞悬液一步混合入高黏度生物墨水的方案。此外，还评估了该混合技术在组织构建体制备中的实际应用。这种一步式混合方法相较于传统混合技术具有多项优势，包括可控制的混合比例、最大限度减少高且不规则的剪切应力，以及采用封闭系统以避免混合容器中样品的污染。然而，该技术中存在若干关键步骤，以确保其在细胞与生物墨水混合方面优于传统方法。在混合前，必须确保细胞注射器中的细胞处于悬浮状态且充分混匀。若在提起注射器转移细胞与开始混合过程之间间隔时间过长，会导致细胞沉降，从而造成混合不均及打印丝状物中细胞分布不均。若观察到沉降现象，在混合前立即对被动混合单元组件进行简单倒置（2–3次）即可重新悬浮细胞，确保混合前细胞分布均匀。同样重要的是，在混合前必须消除或尽量减少注射器中的气泡，以保证混合比例恒定。若在混合前生物墨盒中仍存在较大气泡，建议让溶液额外通过混合单元一次，以确保充分混合。若仍有气泡残留，可轻敲打印墨盒/注射器以驱除残余气泡。此外，若更复杂的构建体需要多种材料混合（多个混合单元或材料），则必须调整待混合的生物墨水/细胞悬液的浓度，以确保经过混合稀释后仍能达到所需的最终浓度。
与其他混合技术相比，被动式混合单元是一种用于细胞化生物墨水的新方法。与双注射器混合或使用刮刀或其他工具搅拌等其他混合技术不同，被动式混合单元在不同批次和不同操作者之间具有更高的混合一致性。而刮刀混合等手动混合技术的特性导致操作者之间的混合程度和混合速率存在较大差异。此外，与在培养皿或管内进行的手动混合相比，被动式混合单元和双注射器混合等封闭系统几乎不会造成样品损失。
本论文中制备的两种组织类似物均由单一类型的生物墨水以及一种或两种细胞类型构成。然而，为了构建更接近生理状态的组织结构，可能需要对包含不同生物墨水区域及不同细胞类型的复杂架构进行生物打印20,21,22。通过将多种现有生物墨水混合，可制备具有独特成分或功能的更专业化生物墨水，从而形成多材料生物墨水23,24。这种方法在组织过渡区域尤其重要，例如皮肤与皮下层之间，或软骨与骨骼交界处，这些区域可能需要生物墨水成分的梯度变化25,26，以确保天然组织中关键区域的正常发育27。此外，还可使用混合装置在生物打印前将生长因子和形态发生素掺入生物墨水中。封闭式混合系统可避免样品损失，这对于昂贵且浓度较低的生物活性因子尤为有利，因为样品损失可能导致生物打印结构中这些因子的终浓度发生改变，尤其是在涉及浓度梯度的情况下。
任何混合技术（包括本研究中使用的被动混合装置）的一个局限性是可能对机械敏感的细胞类型造成损伤。例如，分离的干细胞（如来自骨髓或胚胎的干细胞）以及诱导性多能干细胞更容易受到机械损伤28,29。混合过程会因剪切力的作用而在细胞上施加异常的机械应力，必须平衡这些应力以维持细胞活力30。尽管本研究中使用原代成纤维细胞和软骨细胞获得了较高的细胞活力（图2），但仍需进一步研究以确定更敏感细胞类型的安全混合速率和比例。在获得更充分的数据之前，建议在稳定且缓慢的条件下进行混合，以最大程度地保持细胞活力。此外，本研究中选用的细胞密度是基于先前的研究确定的1，该密度可能并不适用于所有细胞类型。特别是，以较高浓度混合细胞可能会增加细胞间接触，从而有助于提高细胞活力和组织形成能力31,32。类似地，被动混合装置也可用于将细胞球体或其他细胞聚集体33混入生物墨水。
本研究提出并验证了一种被动混合单元系统，可将细胞悬液快速混入高黏性生物墨水。尽管该方法仍存在对细胞造成机械损伤的风险，但其能够在单个研究内及不同操作者之间实现更一致的混合效果。采用该方法制备的预置细胞生物墨水被用于构建软骨和皮肤类似物，并培养长达4周，结果显示沉积了组织特异性的细胞外基质标志物。未来的研究将聚焦于利用被动混合单元系统，通过标准生物墨水混合制备专用生物墨水，以构建更为复杂的组织类似物。

近年来，三维（3D）生物打印技术对研究人员而言变得更加易于获取，使得该技术在组织类似物的制备中得到更广泛的应用。生物打印有望通过促进复杂组织结构的快速且可重复的构建，彻底改变生物医学研究。生物打印技术的核心在于能够精确控制生物材料（称为生物墨水）在三维空间中的沉积，从而生成具有不同基质成分、生物活性因子和细胞区域的复杂支架，更准确地模拟天然组织的结构。
生物打印已被用于制造多种组织的构建物，包括软骨1、皮肤2、肌肉3和骨组织4。这些组织因其固有的条纹状微观结构而成为生物打印的理想选择，可通过逐层沉积的方式进行复制。特别是皮肤具有明确的多层结构5，适合通过生物打印等逐层沉积技术进行制造。此外，生物打印还可用于生成具有修复组织缺损所需解剖尺寸和形状的构建物。能够制造出具有患者特异性尺寸和形状的生物材料6，有助于满足临床上对多种组织部分修复的需求，包括但不限于骨缺损、软骨损伤和皮肤病变，这些病变的范围在不同患者之间存在差异。
在本研究中，通过生物打印预载细胞的生物墨水制备了两种组织类似物（关节软骨和皮肤）。确保生物墨水与细胞悬液充分混合，以实现均匀的细胞分布同时保持细胞活性，是一项具有挑战性的任务。适用于挤出式生物打印的生物墨水通常具有较高的黏度，因此需要充分混合以确保均匀性。在剧烈的混合条件下，细胞可能受到机械损伤，从而对细胞活性产生负面影响。研究表明，在喷墨打印过程中，大多数细胞死亡发生在制备阶段，例如混合过程7,8。虽然传统的振荡混合9可能足以满足适用于喷墨打印的低黏度生物墨水的需求10，但将细胞混合到更适用于挤出式生物打印的高黏度生物墨水中则更为困难。为应对这一需求，混合喷嘴在生物打印过程中用于生物墨水的混合已变得越来越普遍11。这类混合器也广泛应用于微流控研究中，特别是在低雷诺数条件下流体混合至关重要时12。采用连续混合过程将细胞悬液与生物墨水混合，可在打印过程中实现均匀性。然而，由于细胞悬液的黏度远低于生物墨水，在打印过程中防止细胞沉降会面临困难9,13,14。另一种解决方案是在打印前将细胞预先混合入生物墨水中，以解决这一问题。
为了在将细胞混合到生物墨水的过程中尽量减少细胞死亡，我们开发了一种基于被动混合单元的技术，以最少的步骤将细胞混入生物墨水。当材料流经混合单元时产生的混沌混合足以可重复地将两种组分均匀混合15,16。该方法主要旨在简化任何细胞悬液与适用于挤出式生物打印的生物墨水之间的混合过程。通过将混合步骤数量最小化，消除了操作者之间在混合操作上的差异。过多的混合步骤不仅耗时，而且并非适用于所有生物墨水，尤其是在涉及细胞的情况下。其次，我们致力于开发一种封闭式的混合流程，以同时保持无菌性并尽量减少样品损失。
在本论文中，我们展示了使用一种被动混合单元技术将细胞悬液与生物墨水进行混合，该方法可最大限度减少操作步骤，并实现高细胞存活率和均匀分布。这些预先接种细胞的生物墨水随后被用于生物打印软骨或皮肤结构，分别包含一种或两种细胞类型，并可培养长达6周。所使用的生物墨水为海藻酸盐-纳米纤维素混合物，此前已证明其适用于生物打印1。

<table><tbody><tr><td>STARTINK 试剂盒</td><td>CELLINK</td><td>SK0001</td><td>包含 CELLMIXER 实验所需全部组分的试剂盒</td></tr><tr><td>活/死细胞检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>L3224</td><td>用于混合后细胞活力分析的试剂盒</td></tr><tr><td>Masson 三色染色试剂盒</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&lt;strong&gt;HT15-1KT&lt;/strong&gt;</td><td>用于分析皮肤构建物中 I 型胶原沉积的试剂盒</td></tr><tr><td>阿尔新蓝染色试剂盒</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&lt;strong&gt;B8438-250ML&lt;/strong&gt;</td><td>用于分析皮肤构建物中糖胺聚糖沉积的试剂盒</td></tr><tr><td>INKREDIBLE+ 生物打印机</td><td>CELLINK</td><td>Gen1+</td><td>本研究中使用的打印机</td></tr><tr><td>含 Glutamax 的 DMEM 培养基</td><td>Thermofisher</td><td>10566016</td><td>细胞培养用培养基</td></tr><tr><td>10% 胎牛血清</td><td>Thermofisher</td><td>A3160402</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>活细胞成像溶液</td><td>thermofisher</td><td>A14291DJ</td><td>活/死细胞成像中使用的组分</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td>所使用的显微镜</td></tr><tr><td>数码彩色相机</td><td>Olympus</td><td>XC10</td><td>显微镜配套相机</td></tr><tr><td>cellSens 成像软件</td><td>Olympus</td><td>n/a</td><td>显微镜标配软件</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>n/a</td><td>开源图像分析软件</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>GraphPad</td><td>n/a</td><td>用于统计分析的软件</td></tr><tr><td>Slic3r 软件 (v1.2.9)</td><td>Slic3r</td><td>n/a</td><td>将 .stl 文件转换为 gcode 的开源软件</td></tr><tr><td>原代成人人类皮肤成纤维细胞</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-012</td><td>成纤维细胞的细胞来源</td></tr></tbody></table>

利用新型被动混合单元技术实现生物墨水预细胞化的软骨与皮肤组织类似物生物打印

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

生物打印是一种强大的技术，可用于快速且可重复地制备用于组织工程应用的结构。在本研究中，利用一种新型的被动混合单元技术，在对生物墨水进行预细胞化后，成功制备了软骨和皮肤类似物。该技术的开发旨在简化将细胞悬液混合到高黏度生物墨水中的操作步骤。由于生物打印所沉积纤维的分辨率要求在打印前确保细胞分布的均匀性，以避免出现无细胞区域或形成大块细胞聚集体堵塞针头。我们展示了在打印软骨和皮肤类似物之前，能够快速将细胞悬液与生物墨水混合。两种组织类似物均可培养长达4周。组织学分析表明，细胞具有活性，并分别沉积了组织特异性的细胞外基质（ECM）标志物，如糖胺聚糖（GAGs）和I型胶原蛋白。

本文的结果分为两个部分。首先，分析了细胞在采用机械法或被动混合装置混合后的存活率。随后，对软骨和皮肤构建物进行培养，并检测了相关的组织学标志物。
两种情况下，细胞分布均呈现均匀状态。然而，使用刮刀手动混合（图2b）的变异程度高于使用被动混合单元进行混合（图2a）。刮刀混合的程度、速度和操作技术高度依赖于操作者。而使用被动混合单元将细胞混入生物墨水的过程实现了混合操作的标准化，并最大限度地减少了批次间的差异。此外，30、60 和 90 秒的混合时间可能不足以将大量细胞充分混入大量生物墨水中，此时通过刮刀进行更充分的混合可能是必要的。相比之下，使用被动混合单元在混合过程中能更好地维持细胞与生物墨水的混合比例，并确保实现均匀混合。另外，传统混合技术存在样品损失的问题，由于生物墨水黏度较高，部分样品可能残留在培养皿、离心管和混合工具中。使用混合单元混合1次、2次或3次后，细胞活力均保持较高水平（> 90%）。当采用被动混合单元时，以缓慢而稳定的速率混合约需1分钟。而使用刮刀混合时，混合30秒和60秒后细胞活力仍较高，但混合时间超过90秒则导致细胞活力显著下降（77.9 ± 14%，p < 0.05），与其余组相比具有统计学差异（图2c），这可能是由于过度混合造成细胞损伤所致。培养14天和28天后的长期活/死染色结果见补充图1。细胞在第14天开始铺展，至第28天时铺展程度显著，表明细胞具有良好的存活状态。
培养后，通过组织学方法对软骨和皮肤组织类似物进行了分析。在培养第0、14和28天对软骨构建体的分析显示，通过阿利新蓝染色可见糖胺聚糖（GAGs）的数量和分布范围逐渐增加（图3a-3c）。第0天未观察到染色信号，第14天染色仅局限于细胞附近区域；然而，至培养第28天时，阿利新蓝染色在整个构建体中均可见，表明已形成软骨细胞样细胞外基质（ECM）。通过马松三色染色对生物打印的皮肤构建体进行胶原蛋白I的组织学染色分析（图3d-3f）。与软骨构建体类似，第0天样本未见胶原沉积；培养至第14天时，细胞周围及构建体表面已出现大量胶原沉积，至第28天进一步增强，构建体表面及内部均可见致密的胶原层。
<img alt="注射器过滤过程示意图；标注组件的实验步骤，用于实验室中的实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56372/56372fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：被动混合单元系统。（a）用于细胞悬液的 1 mL 注射器，（b）装有生物墨水的 12 mL 注射器，（c）分配单元，（d）被动混合单元，（e）填充筒，（f）在分配单元中组装生物墨水注射器（1）和细胞悬液注射器（2），将被动混合单元连接至两支注射器末端（3），（g）连接雌-雌鲁尔锁紧接头（4），并将填充筒（5）连接完成整体组装，（h）压缩分配单元以预填充混合单元（6），（i）继续下压分配单元，使细胞悬液与生物墨水混合，并注入填充筒中（7）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56372/56372fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞混合活性；荧光显微镜图像（a, b）和用于分析的柱状图（c）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56372/56372fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：细胞活性图像与分析。 代表性图像显示人成纤维细胞在使用被动混合装置混合1次、2次或3次（a）或使用刮刀混合30秒、60秒或90秒（b）并进行三维培养1天后的活细胞（绿色）与死细胞（红色）。图像显示为4倍放大。比例尺表示200 µm。（c）人成纤维细胞经被动混合装置或刮刀混合并进行三维培养1天后的平均活性百分比。误差线表示平均值的标准偏差，* 0.005。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56372/56372fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示细胞结构的显微镜图像；光学显微镜下的染色组织切片。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56372/56372fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：组织特异性细胞外基质沉积。 利用阿利新蓝染色生物打印软骨构建物中的糖胺聚糖，分别在（a）第0天、（b）第14天和（c）第28天。图像以5倍放大倍数拍摄。利用马松三色染色法对生物打印皮肤构建物中的Ⅰ型胶原进行染色，分别在（d）第0天、（e）第14天和（f）第28天。图像以5倍放大倍数拍摄。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56372/56372fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示带有绿色荧光标记的细胞培养物以供分析的荧光显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/56372/56372supfig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Supplementary Figure 1"> 
补充图1：培养第14天（a）和第28天（b）的细胞活力。比例尺为200 µm，绿色表示活细胞，红色表示死细胞。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56372/56372supfig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

使用基于纳米纤维素-海藻酸盐的生物墨水对软骨和皮肤类似物进行生物打印。打印前通过单步被动混合装置对生物墨水进行细胞接种。结果显示，所构建的组织结构细胞分布均匀，细胞活力高，并表现出良好的分化标志物。

生物打印是一种用于快速、可重复地制备组织工程应用构建体的强大技术。在本研究中，两者均……

本实验的总体目标是通过在保持细胞活性的同时，实现生物墨水在生物打印应用中的快速且可重复的预细胞化。该方法有助于简化细胞悬液与生物墨水的混合过程，并提高其可重复性，从而确保活性细胞的打印。该技术的主要优势在于，可在封闭系统中将细胞与生物墨水进行混合，最大限度减少人为操作和样品损失的风险。该方法的可视化演示至关重要，因为如果组装操作不当，可能导致混合不充分。首先，准备两个注射器：一个用于细胞悬液，另一个用于生物墨水。本研究中使用的混合比例为10比1。因此，需准备一个12毫升注射器和一个1毫升注射器，以符合10比1的混合比例要求。同时，准备一个无菌的被动式混合装置，该装置可通过鲁尔锁扣连接与两个注射器相连，另备一个无菌的雌-雌鲁尔锁扣连接头。获取一个能够以受控速率同时从两个无菌注射器中挤出液体的分配装置。最后，准备一个无菌卡盒，用于直接混合生物墨水和细胞悬液。本方案中使用的是一种基于纳米纤维素-海藻酸盐的生物墨水，打印后通过添加氯化钙溶液进行交联。为准备细胞，使用0.5%胰蛋白酶EDTA溶液将细胞消化下来。本方案中使用人成纤维细胞。随后，采用台盼蓝排染法计数细胞总数。确定最终打印结构中所需的细胞密度。计算收获的细胞浓度，需将其稀释至该目标终末细胞密度。在本方案中，采用的终末细胞密度为每毫升五百万个细胞。将细胞悬液转移至细胞悬液注射器中。同时将生物墨水转移至另一注射器中。接着，向后拉动生物墨水注射器的活塞，并将该注射器插入分配单元。确保回抽注射器中的液体体积至少有一半是来自生物安全柜内的无菌空气。在将注射器插入分配单元时，必须保持注射器推杆的位置不变。将分配单元垂直放置，鲁尔锁接头朝上。然后将细胞注射器的活塞拉回至与生物墨水注射器相似的长度，并将其插入分配单元。确保混合单元均匀地连接到两个注射器上，以防止细胞悬液或生物墨水意外排出。混合前务必再次检查。通过旋转鲁尔锁接头将两个注射器连接到混合单元上。然后通过推动分配单元来排出注射器中的空气，以对混合系统进行预冲洗。在溶液到达鲁尔锁之前停止预冲洗。启动后，通过鲁尔锁接头将填充筒连接到混合单元的末端。连接前，确保填充筒内的推杆位于底部。缓慢压缩分配单元，将生物墨水与细胞悬液混合至筒内。混合后，使用无菌移液器吸头向下推动填充 cartridge 中的活塞，使其与生物墨水细胞混合物接触。保持分配单元处于压缩状态，以确保细胞生物墨水混合物不会回流至混合单元中。盖上 cartridge 的盖子，并轻轻敲击工作台面，使所有气泡移动至 cartridge 顶部。此时，细胞生物墨水混合物已准备好用于打印。在本方案中，一个尺寸为 4.8 × 4.8 × 0.9 立方毫米的方形结构被导出为立体光刻文件。根据文本方案中提供的参数设置，生成了该晶格结构的 G 代码文件。按照参考方案，从患者中分离并冷冻保存原代人鼻软骨细胞（HNCs）。解冻冷冻保存的HNCs，并在37摄氏度下使用标准培养基进行单层培养扩增一次。当细胞融合度达到80%至90%时，用0.5%胰蛋白酶-EDTA溶液消化使细胞脱落，采用台盼蓝排斥法进行细胞计数。所有实验均使用第二代人鼻软骨细胞（HNCs）进行。将HNCs重悬于300微升培养基中，细胞密度为每毫升1亿个细胞，培养基中添加10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和50微克/毫升抗坏血酸，用于后续与生物墨水混合。按照被动混合单元操作步骤，按10:1的生物墨水与细胞悬液比例，将HNC细胞悬液与基于纳米纤维素-海藻酸盐的生物墨水混合，最终获得每毫升900万个细胞的细胞浓度。通过紫外线照射对生物打印机进行灭菌，并用70%乙醇擦拭表面。将生物打印机置于超净工作台内以维持无菌环境。然后将无菌打印喷嘴安装到含有生物墨水细胞悬液混合物的 cartridge 上，并将其插入生物打印机中。校准生物打印机后，使用25号锥形喷嘴在25千帕压力下打印负载细胞的晶格结构构建物。以无细胞构建物作为对照。通过添加100毫摩尔的氯化钙离子溶液对构建物进行交联。五分钟后，冲洗构建物。随后在标准培养条件下将构建物置于培养基中孵育，每隔两到三天更换一次培养液。在第二周和第四周收集样品进行组织学分析。使用阿利新蓝染色法对糖胺聚糖（GAG）的生成进行染色。图中显示的是细胞与被动混合装置或手动混合技术混合后24小时的存活率。由于混合程度更高，被动混合装置显示出更佳的细胞存活率。这一点很重要，因为在制备大量预细胞化生物墨水时，可能需要更长的混合时间。此处展示了培养第14天和第28天的细胞活力。良好的细胞活力得以呈现，表明采用该技术可实现细胞的长期存活。通过阿利新蓝染色，在第0天、第14天和第28天观察生物打印软骨结构中糖胺聚糖的形成情况。这些图像展示了生物打印结构内新生软骨的形成。一旦掌握该技术，若操作得当，可在30分钟内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何利用被动混合单元系统对生物墨水进行细胞化。该技术问世后，为生物打印领域的研究人员提供了一种温和、快速且均匀地对生物墨水进行细胞化的方法。

bioprinting-cartilage-skin-tissue-analogs-utilizing-novel-passive

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

Bioink Precellularization 无源混合装置打印软骨及皮肤组织类似物的应用

采用生物打印机基于可牺牲模具制备出具有特定图案的水凝胶。首先用第二种水凝胶填充泊洛沙姆模具，随后将其洗脱，形成可被第三种水凝胶填充的孔隙结构。该方法利用泊洛沙姆快速洗脱和良好可打印性的特点，实现由生物聚合物构建复杂结构。...

打印热响应性反向模具以制备用于三维细胞培养的图案化双组分水凝胶

本文所述方法展示了如何将商用喷墨打印机改装为具有同步紫外光聚合功能的生物打印机。该打印机能够利用细胞和生物材料构建三维组织结构。本研究成功构建了三维新生软骨。...

利用三维喷墨打印技术制备人类软骨组织

设计并制造了一种笛卡尔式生物打印机，可实现多种材料在精确且可重复的几何形状中的沉积，同时允许对环境因素进行控制。利用该三维生物打印机，可打印出复杂且具有活性的结构，并能够轻松实现重复制备。...

使用三喷头笛卡尔打印机进行细胞构建物生物打印的活性研究

我们描述了一组联合使用的方案，可共同制备出具有组织模拟特性的水凝胶生物墨水，用于生物打印功能完整且存活的三维组织结构 体外...

使用组织特异性水凝胶生物墨水打印细胞化结构

本方案描述了一种使用自动化机器人沉积系统的生物打印方法，该方法结合了刻蚀的拓扑引导线索与承载细胞的水凝胶生物墨水的精确沉积。打印的细胞被直接递送至刻蚀结构中，并能够感知并沿其定向排列。...

用于细胞表面引导与生物打印的自动化机器人分配技术

我们提供一种基于微流控生物打印策略的通用方案，用于构建微纤维血管床，其中可进一步将第二种细胞类型接种于该微纤维结构的间隙空间，以生成带血管化的组织和类器官。...

用于构建血管化组织和类器官的微流控生物打印技术

本方案描述了制备嵌入含有脱细胞基质（DM）的聚乳酸（PLA）微球的聚己内酯（PCL）丝材的方法，用于3D打印结构组织工程支架。...

用于3D打印脱细胞基质的新工艺

本方案重点介绍了一种快速评估结晶纳米纤维素（CNC）/琼脂糖复合水凝胶生物材料油墨与小鼠骨髓来源肥大细胞生物相容性的方法，主要考察细胞活力以及细胞表面受体Kit（CD117）和高亲和力IgE受体（FcεRI）的表型表达。...

用于骨髓来源肥大细胞培养的结晶纳米纤维素嵌入琼脂糖生物材料油墨的制备

本方案描述了一种3D打印技术，通过在明胶基颗粒支撑材料中沉积磷酸钙墨水来制备类似骨组织的结构。所打印的骨类似物可实现自由成形，并具有灵活性，既可直接取出打印产物，也可在含活细胞的基质中进行交联，以构建多相复合结构。...

在含细胞悬浮液中进行陶瓷全向生物打印以生成骨类似物

水凝胶形成过程中的剪切处理可产生微凝胶悬浮液，该悬浮液具有剪切变稀特性，但在去除剪切力后能迅速重构。此类材料已被用作生物打印复杂、含细胞结构的支撑基质。本文描述了用于制备支撑床及相容性生物墨水的方法。...

通过凝胶化过程中剪切处理形成琼脂糖流体凝胶用于悬浮3D生物打印

本方案描述了利用嵌入甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶并添加脱细胞外基质的人类成骨细胞构建三维骨组织的方法。该方法成本低、可扩展，并且兼容基础实验室设备，为研究肌肉骨骼疾病过程提供了一个具有转化潜力的平台。...

一种利用人成骨细胞和脱细胞细胞外基质建立骨骼肌肉疾病模型的三维骨培养平台

学习利用无源混合装置对纳米纤维素-海藻酸盐生物墨水进行预细胞化处理，以实现高细胞存活率和均匀细胞分布的生物打印软骨及皮肤组织类似物。该方法可简化细胞悬液与生物墨水的混合流程。

利用新型被动混合单元技术实现生物墨水预细胞化的软骨与皮肤组织类似物生物打印

探索更多视频