兔巩膜中二次谐波信号作为近视治疗性组织交联（TXL）疗效评估的工具

本实验方案的总体目标是展示如何利用二次谐波产生显微技术，对经结膜下注射甲醛释放剂诱导的巩膜组织胶原交联效应进行可视化观察和定量测量，并通过差示扫描量热法加以验证。该方法可通过提供一种无创手段来评估诱导产生的交联效果，从而帮助解答治疗性组织交联领域中的关键科学问题。该技术的主要优势在于，所产生的二次谐波信号对胶原原纤维具有高度特异性，因此无需特殊的组织处理步骤（如抗体染色）。

我们在阅读有关该方法应用于治疗性角膜组织交联的文献时，首次产生了这一想法。该方法的可视化演示至关重要，因为成功的二次谐波生成显微成像需要精确放置组织并设置正确的成像条件，以防止组织损伤和信号测量中的人工假象。按照文本方案所述，首先对兔眼球进行筋膜下注射开始治疗。

图中显示的是筋膜下注射部位的示意图。根据眼睛的大小选择合适尺寸的开睑器。孵育三个半小时后，使用眼睑开睑器牵开眼睑，以充分暴露眼球便于操作。

分离角膜缘周围的结膜，并在巩膜附着处切断眼外肌。使用剪刀或刀片切开巩膜上部，制备一个边长约1厘米的区域，注射部位位于中央。刮除残留的视网膜和脉络膜层，用新鲜的PBS洗涤两次，每次将组织块置于溶液中约10秒。

将组织置于装有 PBS 溶液的 1 毫升离心管中，用于运输至成像中心。进行二次谐波生成（SHG）显微成像时，为获得最佳信号强度和分辨率，应使用专为透射红外光设计且具有高数值孔径的物镜。根据样本的深度调整物镜的校正环。

在此情况下，为0.17毫米。将25倍物镜安装到显微镜上，并在物镜表面覆盖足量的水基浸油凝胶。在将样品置于显微镜上后的30分钟内完成组织成像至关重要，以保持组织的水合状态，并防止物镜与载玻片之间的浸油凝胶干燥，否则会导致二次谐波生成（SHG）信号发生变化。

通过将直径25毫米的圆形盖玻片放置在灌流室底部组件上，组装细胞灌流室。将巩膜组织样本置于盖玻片上，并加入50至100微升缓冲液。用第二片圆形盖玻片覆盖组织，然后旋紧灌流室的顶部组件，注意不要按压或压平组织。

然后，将带有组织样本的细胞培养小室安装到显微镜载物台上。调整载物台位置，并调节物镜高度，通过目镜进行明场观察，使样本的下表面处于焦点位置。关闭除计算机显示器以外的所有光源，并用覆盖在显微镜载物台上的铝箔尽可能遮挡来自显示器的光线。

在软件中关闭眼孔模式。在TI Pad面板中，检查镜头定义是否正确。在A1 Compact图形用户界面面板中，选择用于成像的红外激光，选择非扫描探测器，并选择配备400至450纳米带通滤光片的DAPI通道。

在 A1 多光子图形用户界面面板中，将红外激光的波长设置为 860 纳米，并打开快门。等待发射波长改变，直至绿色指示灯稳定亮起。在 A1 Compact 图形用户界面面板中设置激光扫描条件时，选择检流计扫描器、单向扫描、帧尺寸为 1024 × 1024 像素、像素驻留时间为 6.2 微秒，以及 2× 线平均。

然后，使用查找模式开启实时成像，并在 AI Compact 图形用户界面面板中通过调整激光功率和探测器增益来设置成像条件。将激光功率设置在 50 毫瓦至 150 毫瓦之间，即对于 860 纳米的激光，设置在 2% 至 6% 之间。超过此范围可能导致组织损伤。

打开显示当前图像中像素强度值直方图的查找表面板，进一步调节标记为 HV 的条形图中探测器的增益，以在避免饱和的前提下最大化像素值的范围。使用SHG信号最强的样品来确定最佳的激光和增益设置。在同一实验中需要比较的所有样品应保持完全相同的设置。

此操作可确保实验中没有任何样品会使检测器达到饱和。要在预览模式下扫描组织区域，请打开 XYZ 概览工具。将成像设置为较低分辨率，以加快在此模式下图像的获取速度。

在 XYZ 概览面板中，右键单击当前位置，选择 5×5、3×3 或单视野扫描模式进行图像采集。扫描完成后，通过双击当前预览区域外的区域移动至新位置。开启实时扫描模式，然后调节组织焦点，因为组织的不同区域在轴向上可能具有略微不同的位置。

拍摄新的 5×5、3×3 或单个视野。重复此过程，直至预览到组织的较大区域。在 XYZ 概览工具中，双击胶原纤维充满整个视野的位置，以将载物台移动至该特定位置。

将成像设置为高分辨率，1024 × 1024 像素，并采用 2X 线平均。开启实时定位（Live Find）模式，调节物镜位置，使底部平面处于焦点位置，然后在 TI Pad 中使用 Z 轴驱动将光学平面从此底部层向上移动 10 微米。通过拍摄按钮获取图像，并使用 XYZ 回顾工具中的加号按钮保存该位置。

双击新的位置，重复深度调整和图像采集过程。每份组织采集10张图像。视野之间不应重叠，具体可参考XYZ概览工具中保存的位置。

最后，在显微镜检查完成后，立即将巩膜组织片放入含有1毫升PBS的离心管中，以备后续进行差示扫描量热分析。首先，用剪刀剪取对照组和处理组巩膜的中央部分。用吸水纸将每块巩膜组织片干燥，并使用带齿镊子将其平整地放置在DSC坩埚底部。

将组织放入坩埚内，压紧并盖好盖子后，称量坩埚以获得组织的湿重。然后，将已称重的样品放置在DSC自动进样器托盘上指定的位置。使用仪器管理软件创建方法，输入组织重量，并按照文本方案中列出的参数运行热分析。

完成实验后，使用仪器成像软件提取热变性发生时的相变温度峰值，以分析每个样本的数据。巩膜的SHG图像在Fiji软件中进行分析，以获取平均像素亮度。当打开图像并依次选择分析菜单中的“测量”功能时，将弹出一个包含信号平均亮度结果的数据表。

或者，在“分析”菜单中选择“直方图”，以生成像素强度值的直方图，该直方图包含图像中信号平均亮度和变异性的信息。该测量对对照组和交联处理组的所有图像均重复进行。此处展示了巩膜的代表性SHG图像及其相应的直方图分析结果，包括平均亮度。

对照样品表现出纤维呈波浪状排列。此处显示的是用400毫摩尔SMG交联的样品，其像素强度增加，揭示出更为笔直的胶原纤维。热分析结果显示变性温度峰值更高，证实了交联效应。

展示了对照样本和400毫摩尔交联样本的变性曲线。观看本视频后，您应能充分了解如何制备交联样本，以及如何对巩膜样本进行SHG显微成像。通常，初次使用该方法的研究人员在以下方面会遇到困难：在Tenon囊下间隙进行精确注射、手术切除注射部位周围的方形组织，以及在预览模式下设置图像条件以扫描组织。

在完成此操作后，还可进行其他方法，例如自发荧光检测，以回答更多问题，如弹性蛋白分析，包括定量和形态学观察。这种交联剂递送技术的应用意义延伸至高度近视和后巩膜葡萄肿的治疗，因为它为巩膜稳定化提供了更便捷的后极部介入途径。该显微技术的应用意义则延伸至高度近视的诊断以及由胶原弱化引起的并发症的评估，可通过检测病变巩膜中胶原交联状态，或在完成目标交联操作后评估其效果来实现。

因此，这种交联方法结合二次谐波产生显微技术，可为巩膜交联提供深入见解，同时也可应用于其他组织，如角膜、皮肤、软骨、肌腱、心脏瓣膜和血管。