用酮抑制剂 PD0325901 和维生素 C 维持小鼠胚胎干细胞基因组低甲基化的一种替代培养方法

我们详细描述了两种基于化学的小鼠胚胎干细胞培养协议。这种新方法采用了促进甲基胞嘧啶介导氧化 (维生素 C) 的协同机制, 并抑制了 5-PD0325901 的合成, 以维持小鼠胚胎干细胞的 DNA 低甲基化和干细胞.

该方案的总体目标是使用小分子化合物 PD0325901 和维生素 C 来维持小鼠胚胎干细胞中的低甲基化和多能状态。该方法可以帮助回答 FBS 培养的小鼠胚胎干细胞领域的关键问题，例如形态的异质性和去高甲基化。因此，该技术的主要优点是小鼠胚胎干细胞能够维持良好的形态以及低甲基化和未分化状态。

制备板和缓冲液后，根据文本方案，在 37 摄氏度的水浴中预热小鼠 ES 细胞、培养基、胰蛋白酶和 PBS。要传代细胞，请从培养皿中吸出培养基，并使用 2 毫升 PBS 冲洗细胞两次。然后去除 PBS，向细胞中加入 0.3 毫升胰蛋白酶 EDTA，并快速倾斜培养皿以覆盖溶液中的细胞。

立即去除胰蛋白酶，并在 37 摄氏度下孵育板 1 分钟以分离细胞。加入 2 mL 预热的血清培养基以灭活胰蛋白酶，并使用 5 mL 移液管将细胞集落重悬 10 次，形成单个细胞悬液。将 150 μL 细胞溶液接种到一个新的 6 cm 明胶涂层培养皿中，并补充 3 mL 新鲜制备的 VCPD0325901 培养基。

在 37 摄氏度和 5% CO2 下培养细胞。由于 Vc 的不稳定性，孵育时每 24 小时去除旧培养基并加入 3 毫升新鲜的 Vcpd0325901 培养基。达到 70% 至 80% 的汇合度后，传代细胞并继续培养它们，就像刚才所示。

要进行 DNA 提取，如前所述用胰蛋白酶收集细胞，并按照制造商的说明使用基因组 DNA 纯化试剂盒。向 DNA 管中加入 100 微升超纯水，并通过移液约 15 次溶解 DNA。然后，使用分光光度计测量 Od260 与 280 的比率，以确定 DNA 的浓度和质量。

DNA 浓度应为每微升 500 円克左右。接下来，将 5 微克 DNA 与 5 微升 100 毫摩尔盐酸 tris PH7.6、两个单位的小牛肠磷酸酶、1 个单位的 Dnase 1 和 0.005 个单位的蛇毒、磷酸酯酶 1 混合，消化 5 微克 DNA。然后，使用超纯水将体积增加到 50 微升。

将反应在 37 摄氏度下孵育过夜。第二天早上，在室温下以 1， 000xg 离心 1 分钟来收集样品。然后将溶液转移到超滤管中，并在 13， 000xg 和 4 摄氏度下旋转样品 30 分钟以去除消化酶。

为了制备用于 5HMC 分析的样品，将 36 微升滤液转移到新的 1 毫升试管中，并加入 4 微升 D35HMC，最终浓度为 3 纳摩尔。对于 5MC 分析，将 196 μL 超纯水移液到新的离心管中，并加入 4 μL 滤液，因为基因组 DNA 中 5MC 的密度很高。将 36 微升稀释的 5MC 溶液转移到新的离心管中，并加入 4 微升 D35MC，最终浓度为 50 纳摩尔。

使用 D35HMC 和 D35MC 作为内标，分别校准 5HMC 和 5MC。在 UHPLCMS 软件中设置参数以分析 5MC 和 5HMC 后，根据文本协议，单击 MS QQQ 建立 QQQMSMS 的参数。对于 stop time （停止时间），选择 No limit （无限制） / As Pump （作为泵）。

对于 ion source （离子源），选择 ESI。对于时间筛选，选中 Peak width 并输入 0.07 分钟。要设置时间段，对于 start time （开始时间），请选择 0。

要在 MRM 中设置扫描模式以分析列中的典故，请为 Scan type （扫描类型） 选择 MRM。对于 Div Value （分区值），选择 To MS （至 MS）。对于 Delta EMV plus（增量 EMV 加），输入 200，对于 Delta EMV minus（增量 EMV 减），输入 0。首先单击 MSQQQ 一次采集，构建用于监控转换的参数。

要设置扫描分段，请为 Dwell （停留） 输入 90。要设置 Fragmentor 的 fragment voltages，请输入 90。对于 Collision Energy （碰撞能量），输入 5。

对于 Cell Accelerator Voltage （单元加速器电压），输入 4。要设置正离子模式，请为 Polarity （极性） 选择 positive （正离子）。为了进行单核苷的 UHPLC 分离，通过将 500 毫升超纯水与 500 微升甲酸混合用于溶液 a，制备 5MC 和胞嘧啶的溶液 a 和 b。

然后测量 500 毫升 100% 甲醇和溶液 b。以 95：5 的体积比混合溶液 a 和溶液 b 作为流动相，洗脱 5MC 和 C，然后将流速设置为每分钟 0.25 毫升。使用优化的梯度典故分离 5HMC。

然后将流速设置为 0.25 毫升/分钟。监视 5MC、D35MC、DC、5HMC 和 D35HMC 的转换。将毛细管电压设置为 3， 500 伏。

然后将进样体积设置为 5 μL，并分析每个样品 3 次。根据文本协议使用相应的标准曲线来评估 5MC 和 5HMC 的量。从通过 UHPLC MSMS 对小鼠 ES 细胞中基因组 DNA 的分析中可以看出，VcPD0325901 处理导致 DNA 甲基化下降得更快，并在 5 天后达到稳定的 5 MC 水平，而 Vc 2i 处理在第 11 天导致相当的水平。

该图显示，含有 Vc 的处理在一天后显着增加了 5HMC 频率，此后，由于 5MC 底物的逐渐减少，5HMC 水平逐渐下降。Western blot 分析显示，当细胞用 PD0325901 退缩时，Prdm14 显着升高，而 Dnmt3b 及其辅助因子 Dnmt3l 显着下调，表明 PD0325901 在擦除 5MC 中的作用。在该碱性磷酸酶测定中，小鼠 ES 细胞在 VcPD032590 中培养 26 天时全部染成紫色，呈球状形态，表明未分化状态。

相比之下，在单独含有培养基的 FBS 中生长的细胞呈浅色，部分扩散表明部分分化。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在五个小时内完成。在尝试此程序时，请务必记住 FBS 需要预先筛查。

此外，避免细胞通过传代过度移液和每天更换 VcPDO325901 培养基。经过这一发展，这项技术为体外培养小鼠 ES 细胞领域的研究人员铺平了道路，以探索体外胚胎的发育和过程以及产生的与再生医学相关的医学相关细胞。观看本视频后，您应该对如何使用两种小分子成分 MEK 抑制剂 PD0325901 来维持小鼠 ES 细胞的生长形态以及高甲基化和复数有效状态有了更深入的了解。

不要忘记，使用 Trisol、DMS 或 PMS 和 DTT 可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套、口罩和护目镜。