Name: 用酮抑制剂 PD0325901 和维生素 C 维持小鼠胚胎干细胞基因组低甲基化的一种替代培养方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 了解使用PD0325901和维生素C培养小鼠胚胎干细胞的替代方法，该方法可维持基因组低甲基化和多能性状态，改善细胞形态并解决传统培养中的异质性问题。

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本工作得到国家自然科学基金（21435008 和 21327006，资助 H.W.）以及中国科学院战略性先导科技专项（XDB14030200，资助 H.W.）的支持。

1. 准备工作
<ol>
	<li>配制含有1.0 mM PD0325901（MEK抑制剂）和3.0 mM CHIR99021（GSK3抑制剂）的溶液。
	<ol>
		<li>称取2 mg PD0325901，加入4.15 mL DMSO至棕色玻璃小瓶中。</li>
		<li>称取2 mg CHIR99021，加入1.43 mL DMSO至棕色玻璃小瓶中。</li>
		<li>溶解后，将溶液分装（每管50 µL，置于200 µL PCR管中），于-20 °C避光保存。使用前从冰箱中取出一管冷冻原液，在室温下解冻。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>称取0.0176 g Vc至1 mL离心管中，加入1 mL无菌水重悬，配制成终浓度为100 mM的溶液，使用前备用。</li>
	<li>灭活FBS：将500 mL FBS置于56 °C水浴中孵育30分钟。</li>
	<li>配制600 mL用于培养小鼠胚胎干细胞的基础培养基。
	<ol>
		<li>取一瓶DMEM高糖培养基（500 mL），移除40 mL。</li>
		<li>向460 mL DMEM高糖培养基中添加20%灭活FBS（120 mL）、1,000 U/mL LIF（107 U/mL原液60 µL）、0.1 mM非必需氨基酸（NEAA）（10 mM原液6 mL）、1 mM丙酮酸钠（100 mM原液6 mL）、2 mM L-谷氨酰胺（200 mM原液6 mL）、0.1 mM β-巯基乙醇（100 mM原液600 µL），以及33 IU/mL青霉素和33 µg/mL链霉素（青霉素-链霉素混合液（10,000 IU/mL青霉素和10,000 µg/mL链霉素）2 mL）。将此基础培养基定义为血清培养基。</li>
		<li>分别用移液器将50 µL PD0325901原液（1.0 mM）和Vc原液（100 mM）加入50 mL血清培养基中（终浓度：1.0 µM PD0325901和100 µM Vc），并将该培养基定义为Vc/PD0325901培养基。 
		注意：由于Vc不稳定，应在使用前新鲜配制Vc/PD0325901培养基。</li>
		<li>用移液器分别将50 µL PD0325901原液（1.0 mM）和CHIR99021原液（3.0 mM）加入50 mL血清培养基中（终浓度：PD0325901 1.0 µM，CHIR99021 3.0 µM），并将该培养基定义为2i培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备明胶包被的培养皿。
	<ol>
		<li>配制0.1%明胶溶液：将0.3 g明胶溶于带盖玻璃试剂瓶中的300 mL超纯水中，于121 °C高压灭菌20分钟。将灭菌后的溶液在室温下保存。</li>
		<li>在细胞培养皿（直径6 cm）中加入2 mL 0.1%明胶溶液，室温孵育15分钟，然后吸除明胶溶液。将培养皿在空气中干燥，并在12小时内使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在15 mL离心管中配制10 mL小鼠胚胎干细胞冻存液：90% FBS（9 mL）和10% DMSO（1 mL）。该冻存液需在1天内使用完毕。</li>
	<li>准备冷冻容器：将100%异丙醇加至冷冻容器的填充线处，并弃去旧的异丙醇。每使用五次后，直接添加新的异丙醇。</li>
	<li>配制酶消化缓冲液：称取1.2114 g Tris粉末溶于100 mL超纯水中，配制成100 mM Tris溶液，然后加入浓盐酸溶液（约12 M）调节pH至7.6（约需0.6 mL浓盐酸溶液）。</li>
	<li>配制50 mL放射免疫沉淀分析缓冲液（RIPA缓冲液）：20 mM Tris（pH 7.4）、1 mM MgCl2、150 mM NaCl、20%甘油、0.5% NP40、1 mM EDTA、1 mM EGTA。使用前补充1 mM DTT、1×蛋白酶抑制剂混合物和1 mM PMSF。加入PMSF后，缓冲液需在30分钟内使用完毕。</li>
</ol>
2. 在明胶包被的培养皿中培养小鼠胚胎干细胞
<ol>
	<li>将小鼠 ES 细胞（野生型，129 SvEv）培养基、胰蛋白酶和磷酸盐缓冲液（PBS）在 37 °C 水浴中预热。</li>
	<li>传代细胞。完全吸除培养皿中的培养基，加入 2 mL PBS 洗涤细胞。
	<ol>
		<li>用移液器吸除 PBS，并再次用 2 mL PBS 洗涤细胞。</li>
		<li>吸除 PBS，每皿加入 0.3 mL 胰蛋白酶-EDTA（0.25%）。</li>
		<li>迅速用胰蛋白酶覆盖整个培养皿，然后立即吸除。</li>
		<li>将培养皿放入 37 °C 培养箱中孵育 1 分钟，使细胞从皿壁脱落。取出培养皿，加入 2 mL 预热的含血清培养基以终止胰蛋白酶作用。</li>
		<li>用移液器（5 mL 移液枪头）反复吹打 10 次，将细胞团解离为单细胞悬液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取 2 mL 细胞悬液中的 150 µL（经血细胞计数板计数约为 190,000 个细胞），转移至新的明胶包被培养皿中，每 6 cm 培养皿加入 3 mL 新鲜配制的 Vc/PD0325901 培养基。将细胞置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。</li>
	<li>培养期间每隔 24 小时，因 Vc 不稳定，需更换培养基：吸除旧培养基，每皿加入 3 mL 新鲜的 Vc/PD0325901 培养基。预计在 2–3 天后达到 70–80% 汇合度。</li>
	<li>当细胞汇合度达到 70–80% 时，按步骤 2.2–2.4 所述方法进行传代并继续培养。</li>
</ol>
3. 冻存与复苏小鼠胚胎干细胞
<ol>
	<li>冻存小鼠胚胎干细胞
	<ol>
		<li>按照步骤 2.2 使用胰蛋白酶将细胞从培养皿中消化下来。</li>
		<li>将细胞转移至 15 mL 塑料离心管中，在室温下以 800 × g 离心 3 分钟。</li>
		<li>小心将上清液倒入烧杯中，用 1 mL 新鲜配制的冻存液重悬细胞沉淀。请在操作前 30 分钟配制冻存液，以确保使用时达到室温。</li>
		<li>用 1 mL 移液器将含冻存液的细胞转移至 1.8 mL 微量离心管中，并将微量离心管放入冻存盒内。向冻存盒中加入异丙醇至填充线处，并在使用前保持于室温。</li>
		<li>将冻存盒置于 -80 °C 超低温冰箱中过夜。</li>
		<li>将微量离心管转移至液氮容器中可保存 2–3 年。 
		注意：由于 DMSO 具有毒性，细胞不可在冻存液中长时间停留，应尽快转移至 -80 °C 超低温冰箱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>复苏小鼠胚胎干细胞
	<ol>
		<li>将 50 mL 血清培养基置于 37 °C 水浴中预热。</li>
		<li>从液氮容器中取出一支含细胞的冻存管，将管盖朝下浸入 37 °C 水浴中，快速晃动使其迅速融化。用 1 mL 移液器将细胞转移至 15 mL 离心管中，加入 2 mL 预热的血清培养基以稀释冻存液，然后在室温下以 800 × g 离心 3 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，用 5 mL 移液器轻轻加入 3 mL 新鲜的 Vc/PD0325901 培养基重悬细胞沉淀。</li>
		<li>将细胞从 15 mL 离心管转移至明胶包被的培养皿中，培养 24 小时。随后按照步骤 2 所述方法继续培养细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 从细胞中提取总蛋白
<ol>
	<li>用 1 mL PBS 清洗收集的细胞，然后在室温下以 800 × g 离心 3 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并用含有 DTT、蛋白酶抑制剂混合物和 PMSF 的 RIPA 缓冲液通过轻柔吹打充分重悬细胞沉淀。RIPA 缓冲液的体积约为细胞沉淀体积的 5 倍。 
	注意：细胞重悬操作需在冰上进行。</li>
	<li>将细胞在 RIPA 缓冲液中冰上孵育 30 分钟，然后在 4 °C 下以 13,000 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新管中，并分装后于 -80 °C 保存。</li>
	<li>使用 Bradford 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。</li>
</ol>
5. 从细胞中提取DNA并利用酶将DNA消化为单个核苷
<ol>
	<li>按照步骤 3.1.1 和 3.1.2 所述，用胰蛋白酶收集细胞。</li>
	<li>使用基因组 DNA 纯化试剂盒，按照制造商说明书进行 DNA 提取。</li>
	<li>将提取的 DNA 储存在 1 mL 离心管中。向离心管中加入 100 µL 超纯水，通过移液器反复吹打约 15 次以溶解 DNA。通过测定 260 nm 和 280 nm 处的吸光度来确定 DNA 浓度并评估其质量15。DNA 浓度约为 500 ng/µL。</li>
	<li>在 50 µL 溶液体系中消化 5 µg DNA：向离心管中加入 5 µL 100 mM Tris-HCl 溶液（pH 7.6，终浓度为 10 mM）、2 U 小牛肠磷酸酶、1 U DNase I、0.005 U 蛇毒磷酸二酯酶 I 以及 5 µg DNA（根据测得的 DNA 浓度计算加入体积，约为 10 µL），再用超纯水补足至 50 µL。将混合物在 37 °C 下孵育过夜。将消化后的 DNA 溶液在 1,000 g、室温下离心 1 分钟，使溶液沉降至管底。</li>
	<li>将消化后的 DNA 溶液从离心管转移至超滤管（分子量截断值：3 kDa），在 13,000 g、4 °C 下离心 30 分钟，以去除消化酶。</li>
	<li>准备用于 5mC 和 5hmC 分析的样品。
	<ol>
		<li>用于 5hmC 分析：将 36 µL 滤液移入新的离心管（1 mL），并加入 4 µL 5'-(羟甲基-d3)-2'-脱氧胞苷（[D3]-5hmC），使其终浓度为 3 nM。</li>
		<li>用于 5mC 分析：在新的离心管中加入 196 µL 超纯水，再移入 4 µL 滤液（50 倍稀释），因基因组 DNA 中 5mC 含量较高。将 36 µL 稀释后的溶液转移至另一新离心管，加入 4 µL 5'-(甲基-d3)-2'-脱氧胞苷（[D3]-5mC），使其终浓度为 50 nM。使用 [D3]-5hmC 和 [D3]-5mC 作为内标物，分别校准 5hmC 和 5mC 的定量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品溶液转移至进样管中，于 4 °C 保存。按照先前报道的方法15，采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术（多反应监测模式，UHPLC-MS/MS (MRM)）进行 5mC 和 5hmC 的分析。</li>
</ol>
6. 使用超高效液相色谱-串联质谱法分析5mC和5hmC15
<ol>
	<li>使用UHPLC-MS软件设置分析5mC和5hmC的各种参数。
	<ol>
		<li>建立一种新方法。打开软件并点击 &#34;文件 | 新建 | 方法&#34;. 显示消息框 &#34;方法编辑&#34; 与内容 &#34;您是否要保存当前方法的更改&#34; 并点击 &#34;无&#34;.</li>
		<li>构建采样器的参数。点击 &#34;采样器 | 设置 | 注入&#34;选择 &#34;标准注射&#34; 并输入 &#34;注射体积为 5 µL&#34;.</li>
		<li>在超高效液相色谱中建立泵的参数。
		<ol>
			<li>点击 &#34;BinPump2 | 安装&#34; 设置泵的参数。建立 &#34;流&#34; 在 &#34;0.25 mL/min&#34; 和 &#34;停止时间&#34; 在 &#34;15 分钟&#34;.</li>
			<li>设置 &#34;5% 溶剂B&#34; 和 &#34;压力限制&#34; 在 &#34;最大 600 bar&#34;.</li>
			<li>点击 &#34;BinPump2 | 时间表&#34; 建立用于5mC分析的等度洗脱参数。点击 &#34;附加&#34; 添加一行。输入 &#34;0.00&#34; 在 &#34;时间&#34; 和 &#34;5.0&#34; 在 &#34;B%&#34;. 点击 &#34;附加&#34; 再次添加新行。输入 &#34;15.00&#34; 在 &#34;时间&#34; 和 &#34;5.0&#34; 在 &#34;B%&#34;.</li>
			<li>点击 &#34;BinPump2 | 时间表&#34; 建立用于5hmC分析的梯度洗脱参数。点击 &#34;添加行以追加。在“时间”处输入 0.00，在“浓度”处输入 5.0 &#34;B%&#34;点击 &#34;附加&#34; 再次添加新行。输入 &#34;3.00&#34; 在 &#34;时间&#34; 和 &#34;5.0&#34; 在 &#34;B%&#34;. 点击 &#34;附加&#34; 再重复6次，以增加6行。输入 &#34;3.01&#34; 在 &#34;时间&#34; 和 &#34;15.0&#34; 在 &#34;B%&#34;, &#34;6.00&#34; 在 &#34;时间&#34; 和 &#34;15.0&#34; 在 &#34;B%&#34;, &#34;6.01&#34; 在 &#34;时间&#34; 和 &#34;100&#34; 在 &#34;B%&#34;, &#34;10.00&#34; 在 &#34;时间&#34; 和 &#34;100.0&#34; 在 &#34;B%&#34;, &#34;10.01&#34; 在 &#34;时间&#34; 和 &#34;5.0&#34; 在 &#34;B%&#34;, &#34;15.00&#34; 在 &#34;时间&#34; 和 &#34;5.0&#34; 在 &#34;B%&#34; 按顺序。 
			注意：由于UHPLC的分离条件不同，需分别对5mC和5hmC进行分析。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>建立超高效液相色谱中柱温箱（TCC）的温度参数。 
		点击 &#34;TCC | 设置 | 温度（左侧）&#34; 并输入 &#34;30 °C&#34;.</li>
		<li>建立三重四极杆质谱仪（QQQ-MS/MS）的参数。
		<ol>
			<li>点击 &#34;MS QQQ | 停止时间 | 无限制/随泵&#34;, &#34;离子源 | ESI&#34;, &#34;时间过滤 | 峰宽：0.07 min&#34;设置 &#34;时间片段：开始时间：0&#34;; &#34;扫描类型：MRM&#34;; &#34;Div值：至质谱&#34;; &#34;Delta EMV (+): 200&#34; 和 &#34;Delta EMV (-): 0&#34;.</li>
			<li>构建监测5mC和D转换的参数3-5mC、dC、5hmC 和 D3-5hmC
			<ol>
				<li>点击 &#34;MS 三重四极杆 | 数据采集 | 扫描片段：驻留时间：90&#34;; &#34;Fragmentor：90&#34;; &#34;碰撞能量：5&#34;; &#34;细胞加速电压：4&#34; 和 &#34;极性：正极&#34;.</li>
				<li>输入 &#34;5mC&#34; 在 &#34;化合物名称&#34;, &#34;242&#34; 在 &#34;前体离子&#34;, &#34;126&#34; 在 &#34;产物离子&#34; 用于5mC分析。单击右键并选择 &#34;添加行&#34; 添加新行。输入 &#34;D3-5mC&#34; 在 &#34;化合物名称&#34;, &#34;245&#34; 在 &#34;前体离子&#34;, &#34;129&#34; 在 &#34;产物离子&#34; 用于 D3-5mC 分析</li>
				<li>以相同方式补充另外三行。输入 &#34;dC&#34; 在 &#34;化合物名称&#34;, &#34;228&#34; 在 &#34;前体离子&#34;, &#34;112&#34; 在 &#34;产物离子&#34; 用于dC分析。输入 &#34;5hmC&#34; 在 &#34;化合物名称&#34;, &#34;258&#34; 在 &#34;前体离子&#34;, &#34;142&#34; 在 &#34;产物离子&#34; 用于5hmC分析。Input D3化合物名称处的-5hmC， &#34;261&#34; 在 &#34;前体离子&#34;, &#34;145&#34; 在 &#34;产物离子&#34; 用于 D3-5hmC 分析</li>
			</ol>
			</li>
			<li>设置气体源参数。点击 &#34;MS QQQ | 源 | 源参数：气体温度：300 °C&#34;; &#34;气体流速：11 L/min&#34;; &#34;雾化器：15 psi&#34;; &#34;正极毛细管：3500 V&#34;.</li>
			<li>保存所提出的方法。点击 &#34;MS QQQ | 仪器 | 另存方法为&#34;选择拟议方法的通路 &#34;目录&#34; 并输入内容为该方法命名 &#34;方法&#34;例如：5mC 和 5hmC 分析。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>超高效液相色谱分离与串联质谱分析单核苷
	<ol>
		<li>准备用于5mC和胞嘧啶（C）分析的流动相：配制溶液A和溶液B。溶液A：500 mL超纯水中加入500 µL甲酸（终浓度：0.1%）；溶液B：500 mL 100%甲醇。将溶液A与溶液B按95:5（v:v）混合，作为流动相用于洗脱5mC和C（见步骤6.1.3.3中的设置）。设定流速为0.25 mL/min（见步骤6.1.3.1中的设置）。</li>
		<li>通过溶剂 A 和溶剂 B 配制用于 5hmC 分析的流动相。溶剂 A 为 2.0 mM NH4HCO3 水溶液（pH 9.0）（500 mL），溶剂B为100%甲醇（500 mL）。采用优化的梯度洗脱分离5hmC：0–3 min，5.0% B和95% A（v:v）；3–6 min，15.0% B和85% A；6–10 min，100% B；10–15 min，5.0% B和95% A（在步骤6.1.3.4中设置）。流速设为0.25 mL/min（在步骤6.1.3.1中设置）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用电喷雾串联质谱在多反应监测模式（步骤6.1.5.1中设定）下分析色谱柱洗脱物，并采用正离子模式（步骤6.1.5.2.1中设定）。
	<ol>
		<li>监测以下离子跃迁：5mC，m/z 242→126（碰撞能量，5 eV）；[D3]-5mC，m/z 245→129（5 eV）；dC，m/z 228→112（5 eV）；5hmC，m/z 258→142（5 eV）；[D3]-5hmC，m/z 261→145（5 eV）（在步骤6.1.5.2.2中设置）。</li>
		<li>将毛细管电压和碎片电压分别设置为+3,500 V（在步骤6.1.5.3中设置）和90 V（在步骤6.1.5.2.1中设置）。</li>
		<li>将进样体积设为 5 µL，每份样品分析 3 次（在步骤 6.1.2 中设置）。使用相应的标准曲线评估 5mC 和 5hmC 的含量。
		<ol>
			<li>建立5mC的标准曲线：将1–50 nM（1、5、10、20、50 nM，终浓度）的5mC标准溶液分别转移至离心管中，并加入50 nM [D3]-5mC 加入离心管中，加水补足总体积至 50 µL。按照 5mC 样品的分析说明（步骤 6）进行标准品 5mC 的检测。</li>
			<li>构建5hmC标准曲线：将1–20 nM（1、2、5、10、20 nM，终浓度）的5hmC标准溶液分别转移至离心管中，并加入3 nM [D3]-5hmC 加入管中，加水补足总体积至 50 µL。按照 5hmC 样本的说明（步骤 6）进行标准品 5hmC 的分析。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 分析统计学显著性
<ol>
	<li>使用软件进行统计分析。
	<ol>
		<li>打开软件并选择 &#34;柱&#34; 在 &#34;新表格 &amp;#38; 图表&#34;设置参数如下： &#34;样本数据 | 从一个空的数据表开始&#34;; &#34;选择图表——第一种模式&#34;; &#34;绘制重复数据或误差线 | 作图 | 均值与标准误&#34;.</li>
		<li>点击 &#34;创建&#34; 输入对照组和Vc/PD0325901处理组的三个重复样本 &#34;A&#34; 和 &#34;B&#34; 分别选择这六组数据并点击 &#34;分析&#34; 在 &#34;分析&#34;.</li>
		<li>选择 &#34;t 检验（及非参数检验）&#34; 在 &#34;柱分析&#34; 并点击 &#34;好的&#34; 进入下一个界面。</li>
		<li>参数设置如下： &#34;选择检验 | 检验名称 | 非配对 t 检验；选项 | 双尾&#34;; &#34;置信区间：95%&#34;; &#34;有效数字 | 显示4位有效数字&#34;点击 &#34;好的&#34; 获取 p 对照组与Vc/PD0325901处理组之间的数值差异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用双尾非配对 t 检验评估对照组与实验组之间的统计学显著性 t测试16. 
	注意：p &#60;0.05 表示差异具有统计学意义。*p &#60;0.05，**p &#60;0.01，***p &#60;0.001.</li>
</ol>

<ol><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li>
<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo-derived+stem+cells%3A+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).</li>
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<li>Habibi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+bisulfite+sequencing+of+two+distinct+interconvertible+DNA+methylomes+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).</li>
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<li>Hackett, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+mechanisms+of+DNA+demethylation+during+transition+to+ground-state+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency.</a> Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).</li>
<li>Nakaki, F., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM14%3A+a+unique+regulator+for+pluripotency+and+epigenetic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming.</a> Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何潜在的利益冲突。

在本研究中，我们展示了一种联合使用Vc和PD0325901维持小鼠胚胎干细胞处于未分化且低甲基化状态的新方法，该效果通过Vc促进DNA去甲基化与PD0325901抑制作用的协同实现 从头合成 PD0325901诱导的DNA甲基化。此外，小鼠胚胎干细胞在Vc/PD0325901培养体系下表现出良好的形态。
为了更好地在Vc/PD0325901培养体系中维持小鼠胚胎干细胞的状态，需注意以下几个关键步骤。首先，必须预先筛选胎牛血清（FBS）批次，以挑选并储备最佳批次；频繁更换血清会不利于细胞增殖及多能性的维持。其次，在传代过程中将细胞集落消化为单细胞悬液时，应避免过度吹打细胞。第三，在细胞传代时，为减轻胰蛋白酶对细胞培养的不利影响，应在胰酶覆盖培养皿中的细胞后立即去除胰酶。此外，由于Vc不稳定，Vc/PD0325901培养基需每日更换。
与经典的血清培养相比，在Vc/PD0325901条件下培养的小鼠胚胎干细胞表现出更均一的细胞群体（图3B、<strong...

ES细胞来源于囊胚的内细胞团1细胞处于多能性状态，能够分化为所有体细胞系和生殖系细胞2建立ES细胞为研究发育过程提供了机会 体外 并能基于其多能性生成具有医学意义的细胞，用于再生医学3.
1981年，两个研究团队首次建立了小鼠胚胎干细胞（ES细胞）系，当时从小鼠早期胚胎中分离的细胞在含有胎牛血清（FBS）的培养基中，以小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）作为饲养层进行培养1,4。MEFs在使用前经过有丝分裂失活处理，并预先在培养皿中生长。MEFs为小鼠ES细胞的贴附提供支持，并分泌促进增殖和抑制分化的生长因子5，而FBS则提供细胞增殖所必需的营养因子和激素。后续研究表明，饲养层细胞产生的白血病抑制因子（LIF）是维持小鼠ES细胞自我更新和多能性的关键细胞因子，向培养基中添加LIF可替代饲养层细胞的作用6。目前，将小鼠ES细胞培养在含FBS/LIF的培养基并辅以饲养层的方法仍是许多研究人员采用的标准方案。然而，这种经典培养方法存在一些问题。首先，饲养层细胞会分泌过量且不可控的因子，可能引起病原体污染7。为避免此类干扰，可在培养皿表面包被明胶，并在含血清的培养基中添加LIF，以此作为无需饲养层细胞维持小鼠ES细胞的替代方法。此外，在血清/LIF条件下培养的小鼠ES细胞在细胞群体中表现出形态上的异质性，甚至在多能性相关因子的表达水平上也存在差异8。最近的研究表明，在血清/LIF条件下，多能性相关的核心转录因子（包括SOX2、Nanog和OCT4）可通过LIF和WNT信号通路维持多能性；但值得注意的是，它们同时也会激活成纤维细胞生长因子（FGF）信号通路，从而触发分化8。由于这些核心转录因子具有双重作用，导致在血清中培养的小鼠ES细胞呈现异质性，包含两种可相互转换的细胞群体：一种类似于囊胚内细胞团（ICM），另一种则接近启动态的上胚层状态8。此外，在血清中培养的小鼠ES细胞通常表现出全基因组范围的高甲基化9，而ICM和原始生殖细胞（PGCs）则处于全基因组低甲基化状态，这种低甲基化状态与其多能性密切相关9,10。
目前迫切需要开发新的小鼠胚胎干细胞（ES细胞）培养方法。自2003年以来，已建立多种改进的培养方案11，但仍存在一些局限性和不足之处7。自2008年起，在N2B27培养基中联合使用两种小分子激酶抑制剂——PD0325901（丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/细胞外信号调节激酶（ERK）（MEK）抑制剂）和CHIR99021（糖原合成酶激酶3（GSK3）抑制剂），同时添加白血病抑制因子（LIF）且不加血清，为小鼠ES细胞的培养开辟了新的前景12。这种新的确定性培养基以使用两种抑制剂为特征，被称为“2i”培养基。在2i/LIF培养基中培养的小鼠ES细胞在细胞群体和多能性因子表达方面更加均一。此外，2i/LIF培养的小鼠ES细胞表现出全基因组范围的DNA低甲基化状态，更接近内细胞团（ICM）样细胞9,13。尽管如此，2i培养体系也存在缺点。PD0325901和CHIR99021不溶于水，通常需溶解于二甲基亚砜（DMSO）配制成储备液后加入培养基中。研究表明，细胞长期暴露于低剂量DMSO可导致细胞毒性14。
本研究中，我们利用两种小分子化合物，建立了一种新的小鼠胚胎干细胞（ES细胞）培养方法。该新型培养方法联合使用维生素C（Vc）和MEK抑制剂PD0325901，可快速有效地促进DNA低甲基化，达到与原始生殖细胞（PGC）相当的水平，因此命名为Vc/PD0325901培养体系。在添加Vc/PD0325901的含血清培养基中，小鼠ES细胞在形态上表现出高度均一性，并能维持在初始态（ground state）。与2i培养体系相比，采用Vc/PD0325901条件培养的小鼠ES细胞具有更快的DNA去甲基化动力学，能够达到与PGC相当的低甲基化水平。此外，该体系仅使用单一抑制剂（PD0325901），相较于2i体系（PD0325901/CHIR99021）可减少培养基中DMSO的加入量，从而降低对细胞的损伤。

<table><tbody><tr><td>胎牛血清，澳大利亚来源</td><td>Corning</td><td>35-076-CV</td><td>小鼠胚胎干细胞培养基组分</td></tr><tr><td>DMEM/高糖</td><td>Hyclone</td><td>SH30022</td><td>小鼠胚胎干细胞培养基组分</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td>小鼠胚胎干细胞培养基组分</td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA）</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>小鼠胚胎干细胞培养基组分</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>小鼠胚胎干细胞培养基组分</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>小鼠胚胎干细胞培养基组分</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>小鼠胚胎干细胞培养基组分</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td>细胞清洗</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Hyclone</td><td>SH30042</td><td>细胞解离</td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma</td><td>48722</td><td>培养皿包被</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemolecule</td><td>04-0006-10</td><td>用于细胞培养的小分子化合物</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemolecule</td><td>04-0004</td><td>用于细胞培养的小分子化合物</td></tr><tr><td>维生素C</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd&amp;nbsp;</td><td>XW00508171</td><td>用于细胞培养的小分子化合物</td></tr><tr><td>Ultra Bioscience 水纯化系统</td><td>Purelab</td><td>Ultra</td><td>超纯水制备</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>细胞冻存液组分</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td>DNA和蛋白质提取</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>RIPA缓冲液组分</td></tr><tr><td>PMSF蛋白酶抑制剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>36978</td><td>RIPA缓冲液组分</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>RIPA缓冲液组分</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td>RIPA缓冲液组分</td></tr><tr><td>基因组DNA纯化试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A1125</td><td>基因组DNA提取</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>DNA浓度测定</td></tr><tr><td>小牛肠磷酸酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290</td><td>DNA消化</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303</td><td>DNA消化</td></tr><tr><td>蛇毒磷酸二酯酶I</td><td>Sigma</td><td>P4506</td><td>DNA消化</td></tr><tr><td>Nanosep 3K Omega</td><td>Pall</td><td>OD003C35</td><td>消化后DNA的过滤</td></tr><tr><td>1290 UHPLC系统</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>1290</td><td>UHPLC分离</td></tr><tr><td>G6410B三重四极杆质谱仪</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>G6410B</td><td>MS/MS分析</td></tr><tr><td>Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>Zorbax Eclipse Plus</td><td>UHPLC分离用色谱柱</td></tr><tr><td>5-甲基胞嘧啶</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>SM8900&amp;nbsp;</td><td>5mC标准品</td></tr><tr><td>5-羟甲基胞嘧啶（标准品）</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>M295900</td><td>5hmC标准品</td></tr><tr><td>Prdm14抗体</td><td>bioworld</td><td>BS7634</td><td>Western blot分析-一抗</td></tr><tr><td>Dnmt3a抗体</td><td>bioworld</td><td>BS6587</td><td>Western blot分析-一抗</td></tr><tr><td>Dnmt3b抗体</td><td>abcam</td><td>ab13604</td><td>Western blot分析-一抗</td></tr><tr><td>Dnmt3l抗体</td><td>abcam</td><td>ab3493</td><td>Western blot分析-一抗</td></tr><tr><td>Dnmt1抗体</td><td>abcam</td><td>ab13537</td><td>Western blot分析-一抗</td></tr><tr><td>&amp;beta;-微管蛋白抗体</td><td>bioworld</td><td>BS1482MH</td><td>Western blot分析-一抗</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG</td><td>abcam</td><td>ab6721</td><td>Western blot分析-二抗</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG</td><td>abcam</td><td>ab6789</td><td>Western blot分析-二抗</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>RNA提取</td></tr><tr><td>逆转录系统</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td>RNA逆转录</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td>RT-PCR</td></tr><tr><td>StemTAG碱性磷酸酶染色与活性检测试剂盒</td><td>Cells Biolabs, Inc.</td><td>CBA-302</td><td>&amp;nbsp;碱性磷酸酶染色分析</td></tr><tr><td>小鼠胚胎干细胞：WT, 129 SvEv</td><td>由中国科学院上海生命科学研究院徐国良教授提供（中国上海市）</td><td></td><td>小鼠胚胎干细胞株</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>细胞观察</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5.0</td><td>GraphPad Prism Software Inc.</td><td>5.0</td><td>统计分析</td></tr></tbody></table>

使用mek抑制剂pd0325901和维生素c维持小鼠胚胎干细胞基因组低甲基化的一种替代性培养方法

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

胚胎干细胞（ES 细胞）具有分化为三个胚层（内胚层、中胚层或外胚层）的潜能，并可产生多种细胞谱系，用于再生医学。ES 细胞培养 体外 长期以来备受广泛关注。传统上，小鼠胚胎干细胞（ES细胞）在含有血清和白血病抑制因子（LIF）的培养基中维持。然而，在血清/LIF条件下，细胞在形态和多能性相关基因表达谱方面表现出异质性，且大多处于一种亚稳定状态。此外，培养的ES细胞呈现全基因组范围的高甲基化，而囊胚内细胞团（ICM）和原始生殖细胞（PGCs）中的 naïve ES细胞则处于全基因组低甲基化状态。ICM和PGCs的低甲基化状态与其多能性密切相关。为了改进小鼠ES细胞的培养方法，我们近期开发了一种新方法，通过选择性联合使用两种小分子化合物，以维持DNA低甲基化和多能性状态。本文报道，维生素C（Vc）与PD0325901共处理可在5天内消除小鼠ES细胞中约90%的5-甲基胞嘧啶（5mC）。所获得的5mC含量与PGCs中的水平相当。机制研究表明，PD0325901通过上调Prdm14表达来抑制Dnmt3b从头合成 DNA甲基转移酶）和Dnmt3l（Dnmt3b的辅助因子），通过降低 从头合成 5mC的合成。维生素C（Vc）促进主要由Tet1和Tet2催化的5mC向5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的转化，表明该过程涉及被动和主动的DNA去甲基化。此外，在Vc/PD0325901条件下，小鼠胚胎干细胞（ES细胞）呈现出均一的形态和多能状态。综上，我们提出一种新型的化学协同培养方法，可实现小鼠ES细胞中DNA低甲基化状态的同时维持其多能性。这种依赖小分子化合物的方法克服了血清培养的主要缺陷，有望生成均一的ES细胞，用于进一步的临床应用与研究。

Vc/PD0325901 协同诱导小鼠 ES 细胞的全基因组 DNA 甲基化擦除。在血清培养条件下，小鼠 ES 细胞呈现 DNA 高甲基化状态，而多能性的囊胚内细胞团（ICM）细胞和原始生殖细胞（PGCs）则表现出全基因组 DNA 甲基化的广泛擦除，这种低甲基化状态与其多能性密切相关9,10。
此前，我们及其他研究者发现，维生素C（Vc）可能增强Tet介导的5mC去甲基化15,17与此同时，还发现2i能够抑制 从头合成 5mC的合成。基于这些发现，我们进一步提出在小鼠胚胎干细胞中联合使用Vc与2i进行协同调控。通过UHPLC-MS/MS分析发现，在含血清培养基中添加Vc和2i后，小鼠胚胎干细胞中的5mC...

我们详细描述了两种基于化学方法培养小鼠胚胎干细胞的方案。这种新方法利用了促进Tet介导的氧化（通过维生素C）和抑制的协同机制 从头合成 通过PD0325901抑制5-甲基胞嘧啶的合成以维持小鼠胚胎干细胞的DNA低甲基化状态和多能性

使用MEK抑制剂PD0325901和维生素C维持小鼠胚胎干细胞基因组低甲基化的一种替代性培养方法

胚胎干细胞（ES 细胞）具有分化为三个胚层（内胚层、中胚层或外胚层）中任意一种的潜能，并可由此产生多种……

本实验方案的总体目标是利用小分子化合物 PD0325901 和维生素 C 来维持小鼠胚胎干细胞的低甲基化状态和多能性。该方法有助于解答 FBS 培养的小鼠胚胎干细胞领域中的关键问题，例如形态学异质性和去高甲基化现象。因此，该技术的主要优势在于小鼠胚胎干细胞能够保持优良的形态，并维持低甲基化和未分化状态。根据文本方案，在准备培养板和缓冲液后，将小鼠胚胎干细胞、培养基、胰蛋白酶和 PBS 置于 37 摄氏度水浴中预热。传代细胞时，吸去培养皿中的培养基，用 2 毫升 PBS 洗涤细胞两次。随后移除 PBS，向细胞中加入 0.3 毫升胰蛋白酶-EDTA 溶液，并迅速倾斜培养皿使溶液覆盖细胞。立即去除胰蛋白酶，并将培养板在37摄氏度下孵育1分钟，以解离细胞。加入2毫升预热的含血清培养基以灭活胰蛋白酶，并使用5毫升移液管将细胞团重悬10次，形成单细胞悬液。取150微升细胞悬液接种至新的6厘米、明胶包被的培养皿中，并补充3毫升 freshly made VCPD0325901 培养基。在37摄氏度、5% CO2条件下培养细胞。由于Vc不稳定，在孵育期间每24小时更换一次培养基，弃去旧的培养基，加入3毫升新鲜的Vcpd0325901培养基。当细胞融合度达到70%至80%时，传代细胞，并按照上述方法继续培养。进行DNA提取时，使用胰蛋白酶收集细胞（方法如前所述），并按照制造商的说明使用基因组DNA纯化试剂盒。向含有DNA的离心管中加入100微升超纯水，通过移液约15次使DNA充分溶解。随后，使用分光光度计测定OD260与OD280的比值，以确定DNA的浓度和质量。DNA 浓度应约为每微升 500 纳克。接下来，将 5 微克 DNA 与 5 微升 100 毫摩尔的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（pH 7.6）、2 单位的小牛肠磷酸酶、1 单位的 DNase I 以及 0.005 单位的蛇毒磷酸二酯酶 I 混合，进行消化反应。然后，用超纯水将反应体系补至 50 微升。将反应物在37摄氏度下孵育过夜。次日早晨，于室温下以1,000×g离心1分钟收集样品。然后将溶液转移至超滤管中，在4摄氏度下以13,000×g离心30分钟，以去除消化酶。为进行5HMC分析，将36微升滤液转移至新的1毫升离心管中，并加入4微升D35HMC，使其终浓度为3纳摩尔。为进行5MC分析，将196微升超纯水加入新的离心管中，再加入4微升滤液，这是由于基因组DNA中5MC含量较高。将36微升稀释后的5MC溶液转移至新的离心管中，并加入4微升D35MC，使其终浓度为50纳摩尔。使用 D35HMC 和 D35MC 作为内标物，分别对 5HMC 和 5MC 进行校准。在 UHPLCMS 软件中根据文本方案设置好 5MC 和 5HMC 的分析参数后，通过点击 MS QQQ 建立 QQQMSMS 的参数。对于停止时间，选择“无限制

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用酮抑制剂 PD0325901 和维生素 C 维持小鼠胚胎干细胞基因组低甲基化的一种替代培养方法

小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的质量取决于合适的小鼠品系，例如 CF-1。来源于这些细胞的具有多能性支持能力的 MEFs 及其条件培养基（CM）应含有适量浓度的 Activin A、Gremlin 和 Tgfβ1，以协同维持 Activin/Nodal 和 FGF...

适用于培养人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的小鼠胚胎成纤维细胞的制备

本文介绍了基于解离的单细胞非克隆型单层（NCM）生长的人多能干细胞（hPSC）培养方案。这一新方法利用Rho相关激酶抑制剂或层粘连蛋白异构体521（LN-521），适用于大量生产均一的hPSCs，以及进行基因操作和药物筛选。...

人类多能干细胞培养、维持与遗传分析的替代培养体系

本文所述方案详细介绍了通过过表达少量转录因子，在小鼠胚胎成纤维细胞中诱导造血程序的方法。该技术可被拓展至人类体系，为未来研究造血过程、血液系统疾病以及造血干细胞移植提供平台。...

利用转录因子重编程小鼠胚胎成纤维细胞以诱导造血程序

本方案提供了一种在无血清（胎牛血清，FBS）和无饲养层（小鼠胚胎成纤维细胞，MEFs）条件下，收集小鼠胚胎干细胞（mESC）条件培养基（mESC-CM）的方法，可用于无细胞治疗策略。该方法可能适用于衰老及与衰老相关疾病的治疗。...

无血清无饲养层小鼠胚胎干细胞条件培养基的收集：一种无细胞方法

蛋白质通常包含多个可发挥不同细胞功能的结构域。基因敲除（KO）无法考虑这种功能多样性。本文中，我们报道了一种基于重组介导的盒式交换（RMCE）的结构-功能研究方法，该方法应用于基因敲除的胚胎干细胞，可实现对蛋白质不同功能结构域或变异体的分子解析。...

利用重组酶介导的盒式交换在小鼠胚胎干细胞中进行结构-功能研究

本文介绍了一种从囊胚阶段小鼠胚胎中高效建立和培养多能干细胞系的实验方案。...

从小鼠植入前胚胎中建立干细胞系

我们介绍了一种利用曲古抑菌素A、维生素C和去离子牛血清白蛋白显著改进的小鼠克隆方法。我们展示了一种简化且可重复的方案，能够有效支持克隆胚胎的发育。因此，该方法有望成为小鼠克隆的标准化操作流程。...

联合使用曲古抑菌素A与维生素C可提高体细胞核移植克隆小鼠的效率

染色质环境的调控是实现基因正常表达所必需的重要过程。本文中，我们描述了一种通过在特定基因位点可逆性地招募染色质修饰机器来控制基因表达的方法。...

利用化学表观遗传修饰剂重定向细胞机制以抑制基因转录

本文介绍了一种建立具有非随机X染色体失活的可存活雌性小鼠模型的方案，即在100%的细胞中母源遗传的X染色体处于失活状态。我们还介绍了一种在体内检测药物诱导失活X染色体重新激活的可行性、耐受性和安全性的实验方案。...

一种用于药物再激活X染色体上沉默Mecp2基因的非随机小鼠模型

本文介绍一种结合化学表观遗传擦除与力学感应相关信号的方法，可高效生成哺乳动物多能细胞，且无需基因转染或逆转录病毒载体。因此，该策略在转化医学领域具有广阔前景，并代表了干细胞类器官技术的重要进展。...

一种结合表观遗传修饰与生物力学信号的两步法策略以生成哺乳动物多能细胞

了解使用PD0325901和维生素C培养小鼠胚胎干细胞的替代方法，该方法可维持基因组低甲基化和多能性状态，改善细胞形态并解决传统培养中的异质性问题。

使用MEK抑制剂PD0325901和维生素C维持小鼠胚胎干细胞基因组低甲基化的一种替代性培养方法

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