在失活X染色体上筛选重新激活MeCP2的shRNA文库

按照文本方案所述，首先准备小鼠肌腱成纤维细胞。从10厘米培养皿中收集细胞，先吸除培养基，然后加入1毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA，于37°C孵育2至5分钟。

孵育结束后，加入9毫升DMEM-10终止胰蛋白酶反应，并将重悬的细胞收集至15毫升锥形管中。用DMEM-10将细胞稀释至最终浓度为每100微升含1个细胞。然后用移液器将100微升细胞悬液转移至96孔板的每个孔中。

将细胞在37摄氏度下孵育，直至孔板中的细胞达到融合状态，此过程可能需要两到三周。每三至五天用新鲜的DMEM-10培养基更换一次培养液。当细胞融合后，每孔加入20 µL 0.05%胰蛋白酶EDTA进行消化，将细胞传代至两组相同的96孔板中。

对一组培养板进行荧光素酶活性检测。采用无需去除培养基的均一型萤火虫荧光素酶检测试剂盒，按照试剂盒提供的操作说明进行检测。根据检测结果，从剩余的培养板中筛选出无明显荧光素酶活性的克隆。

首先将这些克隆扩增至24孔板，然后转移至6孔板。对具有最高荧光素酶活性的克隆进行同样的操作。该克隆将作为阳性对照用于验证目的。

在六孔板中培养扩增后，从每个孔中收取一部分细胞用于蛋白质印迹实验。加入200微升0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞，在37摄氏度孵育2至5分钟。

用两毫升 DMEM-10 终止细胞反应，并将一半细胞转移至另一六孔板中。待细胞贴壁后，用 PBS 洗涤一次，随后进行裂解以用于 Western blot 分析。

在六孔板中每孔接种约20万个阴性克隆细胞。用10 µM 5-氮杂胞苷处理细胞一次，随后在不更换培养基的情况下孵育72小时，然后检测荧光素酶活性，方法同前。

接下来，选择一个在筛选中因5-azacytidine处理而获得荧光素酶活性的阴性克隆，并将其扩增至多个10厘米培养皿中。将剩余的阴性克隆用液氮冷冻保存作为备份。阳性克隆可继续在组织培养中维持，或冻存以备后续使用。

在早晨，将一百万个无活性的X细胞接种到10厘米的组织培养皿中。在下午，通过将培养基更换为含有预定量病毒上清液和每毫升5至10微克多聚素（polybrene）的新鲜DMEM-10培养基来感染培养皿。18至24小时后，吸去培养基，并向每个培养皿中加入10毫升新鲜DMEM-10培养基。

将培养板继续培养48小时。次日早晨，每块培养板加入1毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA消化细胞，每块培养板加入9毫升DMEM-10终止消化。将细胞悬液通过100微米孔径的滤网过滤。

将过滤后的悬浮液合并，每皿接种一百万个细胞，接种至两组10厘米培养皿中。下午时，将其中一组培养皿中的培养基更换为含有15微克/毫升潮霉素B的DMEM-10培养基；另一组仅更换为新鲜的DMEM-10培养基。48小时后，使用1毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA消化未用潮霉素B处理的培养皿中的细胞，使其脱离培养皿表面。

在37摄氏度下孵育2至5分钟。接着，用9毫升DMEM-10终止反应。收集各个样品，并立即进行DNA提取。

继续培养潮霉素B筛选组六天，每隔一天用含有潮霉素B的新鲜DMEM-10培养基更换筛选培养基。第六天时，仅使用新鲜DMEM-10培养基替换筛选培养基。恢复培养四天后，按之前方法收集筛选后样本的DNA。

按照文本方案所述，继续鉴定在筛选后样品中富集的发夹结构。为验证筛选结果，首先在10厘米培养皿中每皿接种八百万个293-FT细胞。次日，在转染前30分钟，将每皿培养基更换为九毫升无抗生素的DMEM-10培养基。

接下来，将0.5毫升的转染混合液一加入到每份转染混合液二中，用移液器轻轻吹打混匀。然后在室温下孵育20分钟。将混合液逐滴加入每块培养板中，并轻轻摇晃培养板以混匀。

次日，将培养基更换为5 mL新鲜的DMEM-10。在初次转染后48小时，收集慢病毒上清液，并通过已用DMEM-10预润湿的0.22微米滤器过滤，以最大化回收率。次日早晨，将10万个失活X细胞接种至6孔板的每个孔中。下午时，通过将培养基更换为含有慢病毒上清液和5至10微克/毫升聚凝胺的2 mL新鲜DMEM-10，对细胞进行感染。

使用空载慢病毒载体产生的病毒上清液感染一个对照孔。次日，将培养基更换为含有 1 毫克/毫升嘌呤霉素的 2 毫升 DMEM-10 培养基。持续筛选四天。

四天后，更换为 2 毫升新鲜的 DMEM-10 培养基，静置 48 至 72 小时以恢复细胞状态。加入 150 微升 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 消化细胞，于 37 摄氏度孵育 2 至 5 分钟。用 1.5 毫升 DMEM-10 终止消化反应，随后将细胞转移至锥形管中，在室温下以 500 × g 离心 10 分钟。

吸去培养基，将细胞重悬于荧光素酶检测试剂盒提供的 100 微升裂解缓冲液中。室温孵育 5 分钟。5 分钟后，将悬液转移至白色 96 孔板中。

在暗室中按照试剂盒提供的方案进行检测。使用活性X染色体细胞作为阳性对照，使用感染空载慢病毒载体的非活性X染色体细胞作为阴性对照。永生化的小鼠跟腱成纤维细胞克隆表现出萤光素酶活性的阳性或阴性结果，分别与报告基因位于活性或非活性X染色体上的位置一致。

通过Western印迹检测到的MeCP2表达呈现相反的模式。需要注意的是，萤光素酶活性在阴性克隆中可通过给予5-氮杂胞苷而被诱导。当潮霉素抗性基因位于活性X染色体上时，在潮霉素筛选条件下，细胞相较于基因位于失活X染色体上的细胞具有生存优势。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用选择性插入失活X染色体的报告基因，设计并开展针对X染色体失活调控因子的筛选实验。我实验室此前已在酵母中开展过基于报告基因的染色质调控因子筛选，该方法的成功应用启发我设计了本项针对哺乳动物细胞中X染色体失活调控因子的筛选实验。在遵循本实验流程的基础上，还可采用其他方法，如小干扰RNA（siRNA）、CRISPR、小分子化合物等，进一步探究哺乳动物细胞中X染色体失活的相关问题。