Name: 血脑屏障的高分辨率共聚焦成像: 成像、3D 重建和 Transcytosis 的量化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学习小鼠血脑屏障的高分辨率共聚焦成像方法，利用免疫荧光和三维重建技术定量分析脑内皮细胞中的亚细胞器结构，为神经血管单元研究提供可靠的显微成像方案。

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R.V. 的工作得到了罗氏博士后奖学金（2014-2017）的支持。

本研究的伦理批准由瑞士联邦食品安全和兽医办公室提供。所有动物实验均严格遵守瑞士联邦动物保护与福利条例，以及国际实验动物护理评估与认证协会（AAALAC）的相关规定。
1. 脑组织游离切片的制备
<ol>
	<li>为确保最佳样品质量，应在灌注当天新鲜配制磷酸盐缓冲液（PBS）中的2%多聚甲醛（PFA）溶液。 
	注意：PFA经皮肤接触具有中等毒性，且可能为致癌物。操作PFA时应佩戴腈类手套，并在化学通风橱中配制溶液。
	<ol>
		<li>每只动物准备60 mL PFA溶液。</li>
		<li>通过向每100 mL PBS中加入180–200 µL的5 M KOH溶液以提高pH，并将溶液加热至60 °C，使PFA充分溶解。 
		注：不应使用NaOH，因其会对固定后的组织保存产生不利影响。</li>
		<li>将溶液冷却至室温，并用HCl调节pH至7.4。使用滤纸过滤溶液（见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照先前所述方法15进行小鼠经心脏灌注整体固定，稍作修改。首先用20 mL PBS冲洗血管中的血液，随后灌注40 mL 2% PFA。</li>
	<li>按照先前所述方法15从颅骨中取出脑组织。</li>
	<li>将经新鲜2% PFA灌注的&#160;脑组织浸入20 mL 2% PFA中，在4 °C下后固定7小时。 
	注：不建议延长PFA孵育时间，因其可能阻碍细胞内结构的检测。</li>
	<li>用冰冷的PBS对脑组织进行充分洗涤。</li>
	<li>将固定后的脑组织包埋于琼脂糖中。
	<ol>
		<li>使用微波炉加热配制3%琼脂糖PBS溶液。轻轻摇动溶液使其冷却，但避免凝固。</li>
		<li>在将脑组织浸入塑料容器中的琼脂糖溶液前，吸去其周围多余的PBS。在琼脂糖中旋转脑组织以去除气泡。将容器置于冰上冷却，使琼脂糖凝固。</li>
		<li>小心将琼脂糖块从塑料容器中取出，用刀片在脑组织周围切割成方块。使用氰基丙烯酸酯胶水（见材料表）将脑组织固定于振动切片机样品台（见材料表）上。在进行切片前，留出足够时间使胶水完全固化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将装有脑组织的样品台转移至充满PBS的振动切片机缓冲槽中。使用振动切片机切割厚度为100 µm的脑切片（矢状面或冠状面）。将脑切片收集至预先加入PBS的6孔板中。</li>
	<li>完成脑切片后，小心吸除PBS，并替换为1:1的PBS/甘油溶液。</li>
	<li>将切片储存在-20 °C的PBS/甘油溶液中。</li>
</ol>
2. 通过免疫荧光染色对细胞或细胞器进行标记
<ol>
	<li>将脑切片小心转移至24孔板的一个孔中，该孔预先加入500 µL PBS。切片将保留在同一孔中直至实验结束。</li>
	<li>用500 µL PBS在温和振荡条件下清洗切片两次，每次5分钟。</li>
	<li>移除PBS，对脑切片进行同时封闭和通透处理。
	<ol>
		<li>在PBS中配制含0.3% Triton-X和10%驴血清的封闭与通透溶液。 
		注：驴血清可根据所用特异性二抗的宿主物种替换为山羊血清。</li>
		<li>在室温下，以250 µL封闭与通透溶液孵育切片1小时，并保持温和振荡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除溶液，加入含有5%驴血清及适当稀释倍数（例如，1:100至1:1,000）的一抗PBS溶液。在4 °C下避光孵育过夜，并保持温和振荡。 
	注：参见材料表，获取本方案中成功标记NVU各类细胞的一抗列表。一抗的最佳稀释比例需通过实验确定。若需同时标记不同抗原，应将所有一抗混合于同一溶液中孵育。所有一抗必须来自不同物种。为提高抗体渗透性，样本可在4 °C孵育长达72小时。</li>
	<li>移除一抗溶液，在室温下用PBS在温和振荡条件下清洗切片三次，每次10分钟。移除PBS后，加入250 µL含5%驴血清及相应种属特异性荧光标记二抗的PBS溶液。在室温下孵育切片1小时，并保持温和振荡。
	<ol>
		<li>参见材料表，获取本方案所用二抗的列表。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除二抗溶液，在室温下用PBS在温和振荡条件下清洗切片三次，每次10分钟。</li>
	<li>移除PBS，加入250 µL终浓度为1 µg/mL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液&#160;，在室温下温和振荡孵育10分钟。移除DAPI溶液后，用PBS清洗切片三次，每次5分钟。</li>
	<li>将脑切片置于粘附性显微镜载玻片（例如，histo-bond玻璃载片）上。小心吸除载片上切片周围的多余PBS。在脑切片上滴加一滴封片介质（见材料表），然后小心覆盖一张0.17 mm（No. 1.5）硼硅酸盐玻璃盖玻片。
	<ol>
		<li>将样本置于4 °C避光保存，直至进行图像采集。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 血脑屏障的高分辨率共聚焦成像
<ol>
	<li>使用合适的激光扫描共聚焦显微镜进行图像采集（参见 材料表使用405、488、561和633 nm激光线激发光谱中蓝色、绿色、橙色和红色区域的荧光染料。图像采集采用63倍油镜，数值孔径为1.4。</li>
	<li>在显微镜控制软件的采集菜单中设置图像采集参数。在“图像尺寸”的下拉菜单中，选择1024 x 1024像素的数值。通过调整“缩放”菜单的数值，将像素大小修改为200至300 nm之间的值。 
	注意：在分析细胞内结构时，将像素大小减小至75 nm。此图像尺寸设置会显著增加采集时间；可通过将成像视野缩小至512 × 512像素，以减少采集时间。</li>
	<li>在“采集速度”下拉菜单中，选择 400 Hz 的值， 即 每秒400行。在“系统设置”菜单中，选择“像素深度”下拉菜单，并将数值更改为12位。</li>
	<li>在显微镜软件的“采集”选项卡中，启用逐帧采集选项。通过修改“针孔”菜单中的数值，将每个通道的光学切片厚度设置为0.75至1 µm之间的值。</li>
	<li>在荧光激发面板中，启动用于最优激发样品中荧光染料的激光，例如对发射绿色荧光的荧光染料使用488 nm激光线。 
	注意：使用荧光团光谱查看器（参见 材料表选择合适的激发激光器。</li>
	<li>在荧光检测面板中，移动滑块以选择每个通道将要测量的波长范围，例如对于发射绿光的荧光染料，可选择510至550 nm之间的波长。 
	注意：使用荧光团光谱查看器（参见 材料表）以选择合适的检测波长。</li>
	<li>在盖玻片上的脑切片上滴加一滴折射率为1.52的浸油，以匹配玻璃盖玻片和物镜的折射率。将样品置于显微镜下，打开落射荧光灯，通过显微镜双目镜观察样品。</li>
	<li>使用显微镜底座上的按钮，切换滤光片轮以选择适合观察DAPI染色细胞核的滤光片。使用粗调焦旋钮将DAPI染色细胞核的信号调至清晰对焦。</li>
	<li>使用显微镜载物台上的按钮切换滤光片，以观察血管标志物（例如 CollagenIV 或 CD31）的信号，并将视野中心对准单个毛细血管节段。</li>
	<li>按下按钮以启动实时扫描模式。扫描过程中，调节每个通道的增益和激光强度，以最大化图像的动态范围并避免像素饱和。 
	注意：使用标注饱和像素的查找表来直观评估过饱和情况。为避免信号过饱和，应使用预计荧光信号最强的样本调整成像参数。</li>
	<li>将线平均值设为2。 
	注意：使用较高速度采集时，增加此值以减少噪声。</li>
	<li>为获取覆盖毛细血管完整体积的光学z轴层扫图像，设定起始与终止范围，步长为0.45 µm。 
	注意：如果图像将用于后续定量分析，请对整个数据集保持相同的采集设置。</li>
	<li>为进行定量分析，需从至少三只不同的小鼠中，每只小鼠的每个切片采集10至20个z轴层扫图像，用于统计学比较。 
	注意：应在同一次实验中获取完整的数据集，以减少因样本漂白和激光强度波动引起的变异。</li>
</ol>
4. 神经血管单元的图像处理与三维重建
<ol>
	<li>（可选）为了提高所获取的 z 轴层析图像的轴向分辨率，可使用适当的软件对图像数据集进行去卷积处理（参见 材料表).
	<ol>
		<li>在反卷积软件中，更改设置以执行 &#34;盲法&#34; 去卷积，(即，使用自适应点扩散函数）。</li>
		<li>在反卷积软件设置中，启用背景去除选项；该选项将确定图像堆栈中的最小强度值，并从图像中所有像素的强度值中减去该值。</li>
		<li>在反卷积软件设置中，关闭强度重缩放和调整为16位深度的选项；这些设置将保留图像的原始强度值和动态范围。</li>
		<li>在“折射率”菜单中，将数值设置为1.52。在“设置波长”菜单中，为每个图像通道选择相应的发射波长值。例如，对于绿色发射的荧光染料，选择520。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用适用于三维数据集可视化和分析的软件打开图像数据集（参见 材料表）。在图像分析软件中，按下 &#34;超越&#34; 按钮以渲染毛细血管的三维容积。</li>
	<li>在图像分析软件中按下 &#34;添加新表面&#34; 使用按钮分割毛细血管表面。利用底部箭头在表面生成向导的各个步骤之间切换。
	<ol>
		<li>在“创建”选项卡中，将源通道设置为含有毛细血管标记物的通道，例如 CollagenIV，并将表面细节大小设置为 0.5 µm。 
		注意：后一种选项会对图像应用高斯滤波器，并确定表面的平滑程度。</li>
		<li>在“创建”选项卡中，启用绝对强度阈值选项。 
		注意：此选项将基于图像中选定通道的绝对强度生成掩膜，从而创建一个表面。</li>
		<li>在表面创建向导的下一步中，通过移动强度直方图上的滑动窗口来调整表面的下限强度阈值，直到渲染的掩膜覆盖图像中的整个毛细血管。针对每组数据集，通过实验方法确定该参数的数值范围。</li>
		<li>在表面创建向导的最后一步，单击下拉菜单下方的 &#34;滤器类型&#34; 并选择“体素数量”选项。将体素的最小数量设置为介于 1.0e5 至 2.0e5 之间的值。 
		注意：此选项将排除包含少量体素的表面，例如位于图像边缘的小段毛细血管。</li>
		<li>完成表面创建向导，并通过点击保存创建参数 &#34;记住参数&#34; 在表面菜单的重建选项卡中。</li>
		<li>使用首张图像所用的参数集，对整个成像数据集重复该操作。针对每幅图像的背景强度和毛细血管形态差异，相应调整强度、阈值和最小体素数的参数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于分割细胞内囊泡结构（例如，充满免疫球蛋白的内体），首先创建一个新通道，该通道仅包含毛细血管内的荧光信号。 
	注意：此步骤将通过使用4.3步中生成的毛细血管表面创建掩膜，从而定义感兴趣区域。
	<ol>
		<li>在“毛细管表面”面板中选择“编辑”菜单。在“掩膜属性”下，点击 &#34;遮罩全部&#34;选择包含细胞内囊泡信号的通道作为“源通道”，并启用该选项 &#34;应用遮罩前复制通道&#34;.</li>
		<li>在“掩膜设置”列中，选择 &#34;恒定的内外环境&#34; 和 &#34;将表面外部的体素设置为：&#34; 并将其值设为 0.00。 
		注意：此过程将在图像中创建一个额外的通道，其中毛细血管掩膜以外的所有体素的强度值均为 0。用于量化毛细血管外事件即，位于脑实质内），选择 &#34;将表面内部的体素设置为：&#34; 并将其值设为 0.00。</li>
		<li>为分割囊泡结构，请按下按钮以开始 &#34;添加新斑点&#34; 向导。使用底部箭头在曲面创建向导的各个步骤之间切换。</li>
		<li>在创建选项卡中，使用下方的下拉菜单 &#34;源通道&#34; 选择在步骤 4.4.4 中创建的细胞内屏蔽通道。</li>
		<li>在创建选项卡中，位于 &#34;斑点检测&#34; 切片时，根据实验中观察到的囊泡平均大小，将估计的XY直径设置在0.5至1 µm之间。该选项决定分割算法可检测的最小尺寸。</li>
		<li>在创建选项卡中，位于 &#34;斑点检测&#34; 部分，开启该选项 &#34;背景扣除&#34;. 
		注意：此选项将使用0.75斑点半径（来自步骤4.4.7中选择的值）的高斯滤波器对图像进行平滑处理，然后减去经0.88斑点半径高斯滤波器处理后的原始图像强度。</li>
		<li>在“创建”选项卡中，点击“筛选类型”下方的下拉菜单并选择 &#34;质量&#34;注意，此步骤将根据斑点中心的强度应用阈值来分割图像。通过在“质量”直方图上移动滑动窗口，调整较低强度阈值，直至大多数可识别的囊泡被标记。 
		注意：该参数的取值范围需针对每套数据集通过实验确定。</li>
		<li>完成点阵创建向导，并通过按下按钮保存创建参数 &#34;记住参数&#34; 在表面菜单的重建选项卡中。</li>
		<li>使用首张图像所用的参数集，对整个成像数据集重复该操作。针对每幅图像的背景强度差异，调整“质量强度阈值”参数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 血脑屏障内细胞运输的定量分析
<ol>
	<li>量化毛细血管节段的体积（单位：µm3）和面积（单位：µm2）。在分析软件中，打开步骤 4.3 中创建的血管表面的统计面板。选择“详细”选项卡，使用下拉菜单选择&#34;所有值&#34;，以获取体积和面积的数值。</li>
	<li>量化毛细血管节段内的囊泡数量。在分析软件中，打开步骤 4.4 中创建的点状结构的统计面板。选择“总体”选项卡，以获取图像中点状结构总数的数值。</li>
	<li>为计算单位毛细血管体积内的囊泡数量，对每幅图像将点状结构数量除以步骤 5.1 中计算得到的体积进行归一化处理。将该数值乘以 1,000，得到每 1,000 µm3 毛细血管体积内的囊泡数量。</li>
	<li>为量化毛细血管内的总荧光强度，按照步骤 4.3 所述方法创建一个覆盖整幅图像的新表面，并作如下修改：选择包含目标信号（e.g.，mIgG）的通道作为源通道，并将表面细节水平的面积值设为 5 µm。为创建覆盖整个图像的表面，将低强度阈值设为 0。</li>
	<li>在分析软件中，打开步骤 5.4 中创建的表面的统计面板。选择&#34;详细&#34;选项卡，使用下拉菜单选择&#34;所有值&#34;。记录目标通道的“总强度”（Intensity Sum）数值；该参数表示所有像素强度值的总和。 
	注：对于细胞内信号，该值对应于已复制的通道，其中表面外的体素被设为 0.0；对于脑实质中的信号，该值对应于已复制的通道，其中表面内的体素被设为 0.0。</li>
	<li>为计算单位毛细血管体积的荧光强度，对每幅图像将总强度除以步骤 5.1 中计算得到的体积进行归一化处理。将该数值乘以 1,000，得到每 1,000 µm3 毛细血管体积的荧光强度值。 
	注：对于脑实质中的荧光信号，应将数值归一化为整幅图像体积减去毛细血管体积后的剩余体积，再乘以 1,000，以获得每 1,000 µm3 脑实质的总强度值。</li>
	<li>对整个数据集重复上述操作，并使用适当的软件对数据进行统计分析。</li>
</ol>

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作者受雇于罗氏公司，领取薪酬。

上述方案描述了用于血脑屏障（BBB）高分辨率显微镜观察的脑组织游离切片制备、免疫荧光染色、图像采集及分析参数。该方法最近已被用于研究抗体递送平台的定位3、内源性IgG跨血脑屏障的转运17，以及周细胞丢失后血脑屏障的异质性18。方案中的不同步骤可根据实验的具体目标进行调整。首先，使用较厚（100 µm）的切片有助于在免疫染色和封片过程中对组织的操控；同时，它还支持毛细血管网络、神经血管单元（NVU）的三维重建，并可用于生成毛细血管和NVU的横截面图像。然而，抗体在组织切片中的穿透程度可能有所不同，某些抗体染色可能仅局限于靠近盖玻片的组织表层。可通过在通透步骤中提高去垢剂浓度和/或延长通透时间来修改方案，以改善抗体在组织中的渗透。其次，由于光散射以及折射率不匹配引起的光学像差，当尝试获取组织更深层（通常为表面下20至30 µm）的图像时，图像质量可能下降。为解决此问题，可将本方案与新的组织透明化方法和主动抗体渗透技术20相结合，以实现更大体积组织的成像。第三，图像采集后需进行去卷积处理，以提高图像的轴向分辨率。本方案所采用的盲去卷积算法的选择依据如下：（i）操作简便，无需预先计算点扩散函数；（ii）在提升图像质量方面具有良好的稳健性21；（iii）实施后对mIgG细胞内结构不产生伪影。根据样本中所观察的细胞内结构，其他去卷积算法可能获得更高的图像质量。以下参考文献21,22对其他图像去卷积算法的优势与局限性进行了详尽讨论。最后，使用图像分析软件包可实现毛细血管和细胞内结构的三维分割。显然，图像分析不仅限于本方案中描述的软件，也可采用其他软件包，例如参考文献23中讨论的工具，来进行图像分割。不同软件程序在跨血脑屏障细胞内结构分析中的适用性，应通过评估图像分割的准确性进行实证验证。
由于该方法基于固定样本，因此无法直接提供关于跨血脑屏障转胞吞作用动态过程的信息。然而，该方法可与时间进程实验相结合24，例如通过静脉注射目标分子，并在注射后不同时间点检测其在脑内皮细胞（BECs）中的积累情况，从而重建细胞内运输的动力学过程。该方法的优势在于能够分析深部脑区，如文献18所示，而这些区域目前尚无法通过活体实时成像技术进行观察。实验过程中一个关键步骤是对组织固定的严密监控。使用4% PFA固定会显著降低细胞内细胞器以及内源性或外周给予的免疫球蛋白的免疫反应性17（图1B）。本方案的一个局限性在于其依赖高质量的抗体（即 非特异性染色低、交叉反应性低），且适用于免疫荧光染色。只要具备此类试剂，该方法即可用于研究任何目标蛋白的细胞内定位。例如，该方案曾被用于鉴定脑内皮细胞中的溶酶体17。还应注意，由于本方案基于共聚焦显微镜，其横向分辨率受衍射极限限制，无法分辨小于约175至250 nm的结构（图2）。
既往研究已利用共聚焦显微镜对神经血管单元的细胞组成进行了详细分析25,26。然而，对血脑屏障（BBB）内细胞内运输的研究在很大程度上依赖于透射电子显微镜技术19,27,28。尽管该方法可提供细胞内结构最高的横向分辨率，但电子显微镜仍是一项通量较低且操作困难的技术。此外，可通过电镜可视化的不同分子靶标的数量极为有限。本实验方案为研究血脑屏障处的细胞内运输提供了一种易于实施的替代方法。从脑组织采集到图像分析的完整流程可在5至6天内完成。若存在合适的抗体，免疫荧光技术可在同一样本中同时检测多种细胞类型或分子。此外，本方案还可与超分辨率显微成像技术相结合，以克服空间分辨率的局限性29。总体而言，上述方案能够实现对神经血管单元内目标蛋白细胞内定位变化的定量分析。该方法应用于不同的遗传或药理学干预条件，将有助于在活体（in vivo）水平上研究血脑屏障的细胞内结构及其运输功能。

血脑屏障（BBB）是由星形胶质细胞、周细胞、神经元和内皮细胞构成的连续性细胞屏障，将中枢神经系统（CNS）与血液循环分隔开来1。跨血脑屏障的转运调控在维持大脑稳态中起着关键作用，主要由脑微血管内皮细胞（BECs）的特殊特性介导。BECs之间紧密的细胞间连接以及较低的基础转胞吞速率分别限制了血液来源分子的旁细胞和跨细胞转运2。近年来，研究人员已利用BECs中的转胞吞途径来增强大分子治疗药物向脑内的递送3,4。然而，跨血脑屏障的转胞吞机制尚未被完全阐明5,6。
已有大量体外（in vitro）研究致力于解析调控脑内皮细胞（BECs）内物质转运的细胞与分子机制7,8,9,10,11，但这些系统难以重现神经血管单元（NVU）复杂的结构与生理特性。另一方面，体内（in vivo）研究12,13 能够提供关于血脑屏障（BBB）转运速率的详细定量信息，却无法揭示其细胞内转运机制。因此，在体内（in vivo）和离体（ex vivo）条件下研究NVU的细胞及亚细胞组分仍极具挑战性14。目前仅有少数技术可用于分析NVU细胞内的亚细胞结构。多数研究采用电子显微镜，但该技术受限于组织制备和样品处理所需的复杂操作流程。因此，我们建立了一种基于高分辨率共聚焦显微镜的方法，以促进脑组织样本的处理，并实现对NVU细胞内亚细胞区室的分析与定量。
本文介绍了一种利用小鼠脑组织游离切片在细胞和亚细胞水平上对血脑屏障（BBB）和神经血管单元（NVU）进行定量成像的实验方案。我们测试并验证了多种抗体，用于对NVU进行三维成像与重建。此外，该方案能够在光学衍射极限的最大分辨率下对脑毛细血管内细胞器进行成像。结合图像分析，该方案可用于研究在不同实验条件下大分子物质穿越血脑屏障的细胞内转运过程，例如在神经退行性疾病的小鼠模型中开展相关研究。

<table><tbody><tr><td>抗 CD31/PECAM 的大鼠单克隆抗体克隆 ER-MP12</td><td>Novus Biologicals</td><td>MCA2388</td><td>标记脑内皮细胞&lt;br/&gt; 使用稀释比例为 1:100&lt;br/&gt; 使用合适 AlexaFluor 荧光染料偶联的驴抗大鼠 IgG (H+L) 多克隆抗体进行检测，稀释比例为 1:400</td></tr><tr><td>抗 Podocalyxin 的大鼠单克隆抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB1556</td><td>标记毛细血管管腔&lt;br/&gt; 使用稀释比例为 1:100&lt;br/&gt; 使用合适 AlexaFluor 荧光染料偶联的驴抗大鼠 IgG (H+L) 多克隆抗体进行检测，稀释比例为 1:400</td></tr><tr><td>抗 CollagenIV 的兔多克隆抗体</td><td>Biotrend</td><td>BT21-5014-70</td><td>标记毛细血管基底膜&lt;br/&gt; 使用稀释比例为 1:100&lt;br/&gt; 使用合适 AlexaFluor 荧光染料偶联的驴抗兔 IgG (H+L) 多克隆抗体进行检测，稀释比例为 1:400</td></tr><tr><td>抗 CD13 的山羊多克隆抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF2335</td><td>标记周细胞&lt;br/&gt; 使用稀释比例为 1:100&lt;br/&gt; 使用合适 AlexaFluor 荧光染料偶联的驴抗山羊 IgG (H+L) 多克隆抗体进行检测，稀释比例为 1:400</td></tr><tr><td>与 Cy3 偶联的抗 GFAP 的小鼠单克隆抗体克隆 G-A-5</td><td>Abcam</td><td>ab49874</td><td>标记星形胶质细胞&lt;br/&gt; 使用稀释比例为 1:100</td></tr><tr><td>抗 Iba-1 的兔多克隆抗体</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>标记小胶质细胞&lt;br/&gt; 使用稀释比例为 1:100&lt;br/&gt; 使用合适 AlexaFluor 荧光染料偶联的驴抗大鼠 IgG (H+L) 多克隆抗体进行检测，稀释比例为 1:400</td></tr><tr><td>抗 LAMP2 的大鼠单克隆抗体 ABL93</td><td>Fitzgerald</td><td>10R-CD107BBMSP</td><td>标记溶酶体&lt;br/&gt; 使用稀释比例为 1:100&lt;br/&gt; 使用合适 AlexaFluor 荧光染料偶联的驴抗大鼠 IgG (H+L) 多克隆抗体进行检测，稀释比例为 1:400</td></tr><tr><td>与 AlexaFluor594 偶联的驴抗小鼠 IgG (H+L) 多克隆抗体</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21203</td><td>使用稀释比例为 1:400</td></tr><tr><td>与 AlexaFluor488 偶联的驴抗小鼠 IgG (H+L) 多克隆抗体</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21202</td><td>使用稀释比例为 1:400</td></tr><tr><td>与 AlexaFluor555 偶联的山羊抗小鼠 IgG (H+L) 多克隆抗体</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21422</td><td>使用稀释比例为 1:400</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10334347</td><td>Whatman 预折叠定性滤纸&lt;br/&gt; 等级 0858 1/2，带纹理</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶水</td><td>Roth Carl</td><td>258.1</td><td>Roti Coll 1</td></tr><tr><td>荧光封片介质</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>Dako 荧光封片介质</td></tr><tr><td>成年小鼠</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>C57BL/6J 雄性或雌性小鼠&lt;br/&gt; 年龄介于 9 至 19 个月之间</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235612</td><td>Leica VT100S 振动刀片式切片机</td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Leica TCS SP8 X，配备 HyD 检测器&lt;br/&gt; 和白光激光器</td></tr><tr><td>图像处理软件</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Leica Application Suite AF 版本 3.1.0 build 8587</td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td>Bitplane scientific software</td><td>NA</td><td>Imaris 版本 7.6.5 build 31770 for x64</td></tr><tr><td>荧光光谱查看器</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NA</td><td>https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science&lt;br/&gt; /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td></tr></tbody></table>

高分辨率共聚焦成像观察血脑屏障：成像、三维重建与转胞吞作用的定量分析

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

血脑屏障（BBB）是一种动态的多细胞界面，可调控循环系统与大脑之间分子的转运。跨血脑屏障的转胞吞作用调控激素、代谢物及治疗性抗体向脑实质的递送。本文介绍一种结合游离漂浮切片免疫荧光染色、激光扫描共聚焦显微镜与图像分析的方法，用于可视化血脑屏障内皮细胞中的亚细胞器。将该数据集与三维图像分析软件结合，可实现对毛细血管体积和表面积的半自动分割与定量，以及对血脑屏障处内皮细胞内细胞器数量和荧光强度的定量分析。文中以小鼠内源性免疫球蛋白（IgG）在细胞内囊泡中的检测及其在血脑屏障处的定量为例，展示该方法的应用。该方案有望用于研究调控不同分子跨血脑屏障转胞吞作用的机制。

关键词：血脑屏障，转胞吞作用，内皮细胞，免疫荧光，共聚焦显微镜，三维图像分析，内源性IgG，亚细胞器定位 体内.

作为本方案所获图像的代表性示例，小鼠脑组织切片经抗体染色，以识别神经血管单元（NVU）的不同组分，包括基底膜、星形胶质细胞、周细胞和内皮细胞（所用特异性抗体详见材料表）（图 1A、D 和 E）。在此分辨率下，可清晰分辨出与毛细血管直接接触的单个星形胶质细胞突起及其终足结构。
为了突出本方案在检测细胞内结构方面的适用性，选取了外周注射人源抗 Tau 单克隆抗体 mAb86 的动物的脑切片16 用荧光标记的抗人抗体进行染色（图1B）。mAb86 已知可特异性靶向表达病理性 Tau 蛋白的神经元16. 采用本文所述方案，可在神经元内的单个囊泡结构中以衍射极限分辨率检测到 mAb86图1B-C）。此外，在内皮细胞内的细胞内结构中检测到内源性小鼠IgG，但在周细胞中未检测到（图1D-E 和 图2).
获取脑血管系统的高分辨率共聚焦z轴层扫图像，可实现对血脑屏障处毛细血管及细胞内囊泡的三维分割。 图2 展示了对用CollagenIV标记的毛细血管及小鼠IgG阳性胞内囊泡进行三维重建与分割的示例过程。通过对分割图像的完整数据集进行定量分析（例如测量单位毛细血管体积内的囊泡数量），可研究不同条件下胞内运输过程的变化。 图3B-C 显示周细胞耗竭后脑实质中 mIgG 囊泡数量及对应 mIgG 荧光强度的差异 pdgf-bret/ret  小鼠模型，如先前报道的那样17. 这一方法最近也被用于分析不同脑区之间血脑屏障（BBB）上细胞内运输的变化18.
<img alt="荧光显微镜图像及分析蛋白质分布的图表；囊泡大小=175 nm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1： 神经血管单元中多种细胞类型及亚细胞结构的标记。 本实验方案获得的神经血管单元（A 和 D）以及神经元（B）或内皮细胞（E）内含有的细胞内囊泡的代表性图像。A 中的最大强度投影图像（顶部）显示了围绕胶原蛋白IV标记的毛细血管（绿色）分布的GFAP阳性星形胶质细胞（红色）。箭头指示单个星形胶质细胞突起。比例尺 = 20 µm。在此分辨率下，单个星形胶质细胞突起及其终足清晰可见，如方框区域的放大图像（底部）所示。箭头指示星形胶质细胞终足。比例尺 = 10 µm。B 中的图像显示在外周注射的抗体mAb86（绿色）在海马神经元内的聚集。箭头指示单个mAb86阳性囊泡。比例尺 = 10 µm。C 中的图表显示单个囊泡的线轮廓强度。囊泡大小通过强度曲线（绿色线条和圆点）的高斯拟合（黑色实线）的半高全宽估算。D 中的图像显示了基底膜内（胶原蛋白IV，灰色）一个内皮细胞（绿色）被周细胞（红色）包绕的三维重建图像。下排图像显示各个荧光通道。比例尺 = 10 µm。E 中的图像显示mIgG（红色）定位于内皮细胞内的细胞内囊泡中（左图，CD31为绿色），但不在周细胞中（右图，CD13为绿色）。所有图像中，DAPI染色的细胞核以蓝色显示。比例尺 = 5 µm。图D和E已根据参考文献17 修改。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="共聚焦显微镜分析，IV型胶原，小鼠IgG，DAPI染色；单层切片，三维z轴堆叠，囊泡分割。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：血脑屏障毛细血管及细胞内囊泡的三维重建。 根据所述实验方案，获得了CollagenIV阳性毛细血管（绿色）和小鼠IgG细胞内囊泡（红色）的高分辨率共聚焦图像（A）。左侧面板显示单个光学切片及其横截面，箭头指向脑内皮细胞内的单个mIgG阳性囊泡。右侧面板显示使用图像处理软件（见材料表）对完整z轴堆叠图像进行的三维重建。毛细血管体积（B）和单个囊泡（C）通过图像处理软件（见材料表）进行三维渲染并定量分析。所有图像中，DAPI染色的细胞核显示为蓝色。比例尺 = 5 µm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜，膜结合型IgG分析，IV型胶原，脑组织示意图，C57BL/6 与 pdgf-b&lt;sup&gt;ret/ret&lt;/sup&gt; 对比" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：mIgG在血脑屏障处的细胞内定位定量分析。 代表性图像显示（A) 毛细血管（以胶原蛋白IV标记，绿色）和mIgG（红色）在C57BL/6小鼠中的三维重建及其分布情况 pdgf-bret/ret 此前报道的周细胞缺失小鼠19. 比例尺 = 10 µm. 图像在 B 显示在 CollagenIV 掩模内细胞内囊泡的分割结果。图中 B 显示毛细血管单位体积内mIgG囊泡数量的定量与比较。每个数据点代表单个毛细血管节段的测量值。实线表示均值，误差线表示数据的标准差。图中所示图像 C 显示 mIgG 荧光信号位于 CollagenIV 掩模之外。类似地，下图中的 C 显示了C57BL/6小鼠与实验组之间脑实质中mIgG荧光强度的定量与比较 pdgf-bret/ret 周细胞缺失小鼠。荧光强度单位通过所有 C57BL/6 小鼠脑实质中测得的平均 mIgG 强度进行归一化处理。本图已根据参考文献修改17. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种基于显微镜的实验方案，用于利用小鼠脑自由漂浮切片对神经血管单元和血脑屏障进行高分辨率成像及三维重建。该方法可实现对血脑屏障处细胞内细胞器的可视化、分析与定量。

血脑屏障（BBB）是一种动态的多细胞界面，可调控分子在血液循环与大脑之间的转运。

本方法的总体目标是提供一种基于显微镜的高分辨率成像及小鼠血脑屏障三维重建技术方案。该方法结合游离脑切片的免疫荧光染色与共聚焦显微镜技术，用于分析脑血管内皮细胞内的亚细胞器结构。本方法新增了脑组织游离切片制备、免疫荧光染色、图像采集以及血脑屏障高分辨率显微成像分析参数等操作步骤。该技术的主要优势在于能够对神经血管单元中细胞内的亚细胞器进行定量分析。演示本实验操作的将是 Roberto Villase

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