使用去卷积显微镜对小鼠原代下丘脑神经元中GLUT4蛋白转运的活体成像

本实验的总体目标是观察原代神经元细胞中蛋白质的实时转运过程（如下丘脑神经元中的GLUT4），同时将损伤降至最低。该方法可用于解答与神经元调节胰岛素信号传导及代谢相关的关键科学问题，例如2型糖尿病的研究。该技术的主要优势在于，研究人员能够分离原代细胞培养物，并实时观察药物诱导的效应。

该技术的意义在于，由于我们现在了解了趋化因子CCL5如何在下丘脑神经元中改变胰岛素信号，因此可据此选择针对2型糖尿病或与脑部相关的胰岛素抵抗的治疗方法。开始此操作前，需在细胞培养前一天用聚-D-赖氨酸包被培养皿。对于六孔板，每孔加入1.5 mL浓度为0.05 mg/mL的聚-D-赖氨酸。

第二天，去除聚-D-赖氨酸，并用 2 mL 去离子水清洗培养皿两次。然后向 10 cm 培养皿中加入 20 mL 洗涤培养基，置于冰上。向 15 mL 离心管中加入洗涤培养基，同样置于冰上。

进行脑组织分离时，使用75%乙醇对操作平台、解剖显微镜和手术器械进行消毒，以避免污染。随后，剪开脐带周围区域，完整分离出仔鼠而不造成损伤。接着，取下每只仔鼠的头部，并用尖头直镊将其固定到位。

使用另一把细尖弯镊从两侧去除外层皮肤和颅骨，并从前向背侧方向剥离。然后将分离出的脑组织置于含有冰上冷洗液的干净培养皿中。将脑组织翻转，使腹面朝上。

随后，使用尖头弯镊分离下丘脑组织。用尖镊夹住嗅球，用弯镊剥离包裹整个大脑的薄层脑膜。翻转至大脑皮层腹面，将海马从皮层向外侧牵拉，从而将其与皮层分离。

当大脑所有区域均分离完毕后，将这些组织置于含有冰冷清洗液的15 ml离心管中进行剪碎。在此步骤中，通过将含有组织的离心管上下颠倒2至3次来冲洗组织。随后，将离心管保持直立，使组织自然沉降。

使用连接真空系统的玻璃巴斯德移液管吸除上层培养基。洗涤组织时，加入15 mL冰浴的洗涤液，将离心管颠倒2至3次。最后一次洗涤后，借助1 mL移液管吸除洗涤液。

将组织置于37摄氏度水浴中，用木瓜蛋白酶-胰蛋白酶消化缓冲液孵育7至14分钟。随后，加入一倍体积的胎牛血清以中和酶活性。将离心管置于管架上，静置1至2分钟，使组织沉淀。

随后，用1 mL移液器小心吸除上清液。向试管中加入6 mL铺板培养基，用5 mL移液器轻柔地将组织上下吹打50次。将试管置于试管架上，静置1至2分钟，使未充分解离的大块组织沉淀下来。

接下来，将含有解离细胞的上层相转移至新离心管中，并用铺板培养基进行稀释。然后，向六孔板的每个孔中加入 2 mL 完全培养基。为了进行活细胞成像，需用镊子小心取出带有神经元的盖玻片，并谨慎地将其放置于载玻片上。

然后，将擦拭纸对折两次，小心地将其放在盖玻片上而不移动盖玻片，以去除多余的培养基。必须彻底去除过量的培养基，以防止盖玻片发生不必要的移动。接着，用 10 ng/mL 的 CCL5 或 10 units/mL 的胰岛素处理选定的细胞样品，处理时间为一分钟。

随后，将 1.5 µL 稀释后的胰岛素加至盖玻片边缘。然后，在 60 倍放大、数值孔径为 1.52 的物镜上滴加镜油。接着，将盖玻片放置于去卷积显微镜载物台上，使盖玻片朝下并妥善固定。

使用明场或荧光照明识别目标细胞。随后调节焦距，直至目标细胞能够被清晰观察。切勿将物镜移出盖玻片区域，以避免产生不必要的划痕。

接下来，通过GFP信号鉴定GFP-GLUT4。然后确定用于图像采集的目标细胞。随后，为每个目标细胞设置适当的实验参数，包括像素数、激发波长、透射百分比、曝光时间、层厚、时间间隔和总成像时间。

将曝光参数调整至约 2000 到 3000 计数，以达到最大像素强度。为尽量减少荧光漂白，应在保持曝光时间小于一秒的前提下，尽可能降低激发光透射的百分比。通过移动显微镜载物台，将 Z 轴层扫的上下限设置在每个目标细胞的顶部和底部刚好略微失焦的位置。

在光成像后神经元死亡过程中，尽量减少荧光光漂白现象非常重要。该图显示，原代培养的下丘脑神经元用神经元标记物MAP2进行标记，同时显示下丘脑神经元标记物POMC及其与CCR5的共表达情况。

共定位图像显示，CCL5 在 POMC 阳性的下丘脑神经元中表达。这些图像展示了野生型下丘脑神经元和 CCR5 双阴性下丘脑神经元中 GFP-GLUT4 蛋白的表达。神经元经胰岛素或 CCL5 刺激。

箭头指向神经突起中在胰岛素或CCL5刺激前后出现的GFP-GLUT4点状结构，星号表示CCL5刺激前后位于细胞表面的GLUT4-GFP。一旦掌握，该原代细胞实验技术可在1至4小时内完成，具体时间取决于实验需求及操作的熟练程度。该技术为神经科学领域的研究人员探索药物在原代细胞培养中所诱导的即时效应提供了重要途径。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离原代下丘脑神经元、海马神经元以及皮层神经元。此外，您还将了解如何在不同刺激条件下对串联分子进行活体记录。请务必穿上实验服并佩戴手套，同时经常使用乙醇以避免来自动物的细菌和真菌污染。

在整个操作过程中，处理盖玻片和神经元时也需格外小心。