Name: 用反褶积显微镜观察小鼠原发性下丘脑神经元 GLUT4 蛋白的动态图像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 了解反褶积显微镜技术用于观察小鼠原代下丘脑神经元中GLUT4蛋白的实时动态转运过程。该方法结合胰岛素刺激，揭示CCR5在胰岛素信号通路中的作用，为2型糖尿病治疗提供新思路。

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我们感谢中国台湾科技部提供的资助——MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) 以及烟草制品健康福利附加税——MOHW106-TDU-B-212-144001 对 S-Y C. 的支持。

所有在动物实验中使用的方案和方法均已获得中国台湾台北医学大学机构动物照护及使用委员会（IACUC）的批准（方案编号：LAC-2013-0278；LAC-2015-0397）
1. 原代神经元培养
<ol>
	<li>培养前的准备
	<ol>
		<li>用多聚-D-赖氨酸包被培养皿（表1) 培养前一天进行。对于6孔板，每孔加入1.5 mL聚-D-赖氨酸（0.05 mg/mL）。若进行活细胞成像，将细胞培养于标准包被的6孔板中的12 mm × 12 mm盖玻片上。</li>
		<li>去除/回收聚-D-赖氨酸，并用 2 mL ddH₂O 将培养皿清洗两次2O.</li>
		<li>准备手术器械：一对显微解剖剪、弯头镊子和标准直头镊子。对手术器械进行灭菌，并在手术过程中将其保存在75%乙醇中。</li>
		<li>用20 mL洗涤培养基填充10 cm的培养皿（表1）并置于冰上保存。</li>
		<li>将15 mL洗涤液加入一支15 mL离心管中，并将离心管置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从不同脑区分离脑组织
	<ol>
		<li>使用标准安乐死程序处死16至19天孕龄的雌性小鼠，即将小鼠置于无通风的笼中，随后用CO中毒致死2建议使用 E15.5~E16.5 胚胎进行下丘脑神经元培养，而 E16.5~E17.5 胚胎更适合海马和皮层神经元培养。</li>
		<li>用75%乙醇对平台、解剖显微镜和手术器械进行消毒，以避免污染。</li>
		<li>在脐带区域周围进行切割（深红色区域， 图1A，1B 虚线）以便在不损伤幼崽的情况下轻松分离幼崽（图1C，1D).</li>
		<li>用剪刀移除每只幼鼠的头部组织（图1E，F），然后使用尖头直镊子固定眼部区域的头部位置（图1G）。使用另一把细尖弯镊从两侧去除外层皮肤和颅骨，并从前方向背侧剥离。图1H，黑色箭头指示方向）。应完整无损地分离脑组织（图1I). 
		注意：在分离脑部不同区域时，必须保持脑组织的完整性，以确保操作的准确性。</li>
		<li>将分离的脑组织置于含有冰冻清洗液的洁净培养皿中，用于后续步骤。</li>
		<li>将大脑翻转并保持腹面朝上。下丘脑是位于脑中部的一个圆形结构（图1J，箭头指向下丘脑区域）。使用尖头弯镊分离下丘脑组织。小心去除呈黄红色的脑膜。 
		注意：彻底去除脑膜是避免成纤维细胞污染的关键步骤。</li>
		<li>用尖头镊子夹住嗅球，用弯头镊子剥离覆盖整个大脑的薄层脑膜（图1K，L).</li>
		<li>海马体呈香蕉状，嵌于皮层下部。翻转皮层至其腹面，用弯头镊将海马体从皮层中向一侧轻轻拉离图1M，N， 和 O). 务必清除脑组织周围残留的所有脑膜。</li>
		<li>当大脑所有区域均分离完毕后，借助镊子将这些组织在含有预冷洗涤液的15 mL离心管中剪碎（步骤1.1.5）。 
		注意：脑组织可在冰冻的洗涤液中保存 2-3 h。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织消化、接种与培养
	<ol>
		<li>将含有组织的15 mL离心管倒置2–3次以清洗组织，然后将离心管垂直放置，静置1–3分钟使组织沉淀。</li>
		<li>使用连接真空系统的玻璃巴斯德吸管移除上层培养基。为清洗组织，加入15 mL冰浴预冷的洗涤培养基，倒置离心管2–3次。在进行下一步之前，重复洗涤步骤3次。 
		注意：使用真空系统移除上层培养基时，需小心避免触碰底部的组织。</li>
		<li>最后一次洗涤后，用1 mL移液器吸出洗涤液。</li>
		<li>将组织与木瓜蛋白酶-胰蛋白酶消化缓冲液共同孵育（表1在37 °C水浴中孵育7-14分钟。每2分钟振荡试管一次，以确保所有组织充分接触消化缓冲液。 
		注意：孵育时间与消化缓冲液体积可根据组织大小进行调整。对于从6-8只幼鼠收集的下丘脑组织，建议使用300 µL木瓜蛋白酶-胰蛋白酶消化缓冲液，孵育时间为7分钟。组织量较多时需增加消化缓冲液的用量。</li>
		<li>通过加入1体积的胎牛血清中和酶的活性。在室温下轻轻振荡试管3-5次。</li>
		<li>将离心管置于管架上，静置1-2分钟，使组织沉淀；用1 mL移液器小心吸除上清液。</li>
		<li>加入6 mL铺板培养基（表1将组织用5 mL移液器在试管中轻柔地上下吹打50次（对于6孔板，建议每孔接种1.5 mL培养基）。经过多次吹打后，大多数细胞将解离为单细胞。 
		注意：进行此步骤时，应尽量避免产生气泡。大多数实验室使用经火焰处理的玻璃巴斯德移液管来解离组织。也可使用尖端较细的5 mL移液管作为此步骤的良好替代方案。</li>
		<li>将离心管置于管架上，静置1-2分钟，使未解离的组织块沉降。取上清液（含解离的细胞）转移至新管中，用铺板培养基稀释（解离细胞体积与铺板培养基体积比为1:5。例如，1 mL解离细胞加入5 mL铺板培养基）。</li>
		<li>使用血细胞计数板计算细胞密度，并将所需数量的细胞接种到步骤 1.1.1 中涂有聚-D-赖氨酸的培养板中。我们建议接种密度为 2–4 × 105 6 孔板/35 mm 培养皿每孔推荐接种细胞数用于神经元成像研究。若需进行蛋白质收集与分析，则需要更高的细胞密度。 
		注意：铺板时不要加入过多培养基，每个6孔板中加入1-1.5 mL铺板培养基即可满足细胞贴壁需要。培养基过量会延长细胞正常贴壁所需时间。</li>
		<li>等待2-3小时，在显微镜下观察接种的神经元。当神经元正确贴壁后，将开始长出神经突。</li>
		<li>吸除铺板培养基，加入2 mL预热的洗涤培养基（37 °C）以清洗残留的铺板培养基。重复此步骤两次。</li>
		<li>加入2 mL完全培养基（表1将)加入6孔板的每个孔中。</li>
		<li>每3-4天更换一半培养基，每次均需新鲜配制完全培养基。从不同小鼠脑区培养的神经元具有不同的形态和特性。图2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用脂质体系统将质粒DNA转染至原代神经元
注意：进行神经元转染时，建议使用无内毒素质粒DNA纯化试剂盒（材料表）制备DNA。额外的乙醇沉淀步骤可去除过量溶剂，并提高DNA浓度。
<ol>
	<li>基于脂质体的原代神经元DNA转染。 
	注意：转染时间取决于实验所需的成熟状态。下丘脑神经元在体外培养第7-10天（DIV，days in vitro）进行转染。
	<ol>
		<li>DNA-脂质体混合物的制备：在含有300 µL低血清培养基的微量离心管中稀释GFP-GLUT4质粒DNA16（2 µg）。另取一支微量离心管，加入2 µL脂质体和300 µL低血清培养基，室温孵育5分钟。</li>
		<li>将两管内容物混合，室温孵育20-30分钟。</li>
		<li>从培养皿中移除神经元培养基。每孔加入600 µL DNA-脂质体混合物，37 °C孵育4-6小时。</li>
		<li>4-6小时后，移除DNA-脂质体混合物，每孔加入2 mL培养基。</li>
		<li>转染后18-72小时可观察到荧光信号，例如单独的GFP以及与GFP标签偶联的GLUT4蛋白（图3 和 图4）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 活细胞图像采集
<ol>
	<li>活体成像前的细胞准备
	<ol>
		<li>在6孔板中，将表达绿色荧光蛋白标记的葡萄糖转运蛋白4（GFP-GLUT4）的野生型（WT）和CCR5-/-下丘脑神经元细胞接种于已预先用聚-D-赖氨酸包被的#1.5（或厚度为0.17 mm）玻璃盖玻片上，该盖玻片的处理见步骤1.1.1。</li>
		<li>使用镊子小心取出带有神经元的盖玻片，并谨慎地将其放置在载玻片上。</li>
		<li>用精细擦拭纸去除多余的培养基/液体。将擦拭纸对折两次后，轻轻覆盖在盖玻片表面，轻压擦拭纸以吸除液体，过程中避免移动盖玻片。 
		注意：切勿用力按压盖玻片与载玻片之间的接触。此步骤的目的是防止在图像采集过程中因浮力导致盖玻片发生移动或漂移。</li>
		<li>将盖玻片和载玻片放置于去卷积显微镜载物台上，使盖玻片朝下，并确保固定稳妥。此步骤可保证载玻片位置恒定，便于后续追踪同一组目标细胞。</li>
		<li>使用60倍、数值孔径1.42的油浸物镜观察野生型（WT）和CCR5-/-下丘脑神经元细胞。</li>
		<li>对选定的细胞样本施加CCL5（10 ng/mL）或胰岛素（10 U/mL）处理1分钟。在盖玻片边缘加入1.5 µL稀释后的胰岛素溶液。</li>
		<li>立即对选定的细胞样本进行可视化观察并开始记录。设置视频录制软件，持续记录30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去卷积显微镜成像与分析 
	注意：本部分实验方案需使用去卷积显微镜及专用分析软件。
	<ol>
		<li>开启成像系统的电源，等待显微镜载物台完成初始化后，再打开LED光源。</li>
		<li>在60倍、数值孔径1.42的物镜上滴加浸油（37 °C活体样本适用的折射率为1.520）。将样本载玻片放置于显微镜上，确保盖玻片面向物镜，并妥善固定载玻片。</li>
		<li>使用明场或荧光照明方式定位目标细胞。调节焦距直至目标细胞清晰可见。操作过程中避免将物镜移出盖玻片区域，以防产生不必要的划痕。</li>
		<li>通过GFP信号识别与绿色荧光蛋白偶联的葡萄糖转运蛋白4（GFP-GLUT4），选择适合成像的目标细胞。可记录所选目标细胞的位置以便后续参考（图4）。</li>
		<li>为每个目标细胞设置合适的实验参数（包括像素数、激发波长、透光率、曝光时间、Z轴层厚、时间间隔及总成像时间）。本实验中，GFP信号的图像像素数设定为512 × 512（如需更高分辨率，可设为1,024 × 1,024），每5分钟曝光时间为0.025至0.05秒。微小的横向x、y及z轴调整可通过推荐软件实现（材料 表）。</li>
		<li>将曝光参数设置为约2,000至3,000计数，以达到最大像素强度。为最小化荧光漂白，应在保持曝光时间小于1秒的前提下，尽可能降低激发光的透光率。对每个额外的荧光通道及每个独立的兴趣区域重复上述步骤。</li>
		<li>为每个目标细胞设定Z轴堆栈的上下限。可通过移动显微镜载物台，使目标细胞的顶部和底部均略微失焦来确定范围。用户可通过设定上下限之间图像的数量（或设定每幅图像间的距离）来调节Z轴分辨率。</li>
		<li>图像堆栈随后利用相应软件进行去卷积处理和分析，本实验中使用PerkinElmer公司的Velocity软件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Levin, B. E., Sherwin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+glucose+homeostasis%3A+does+brain+insulin+matter%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Peripheral glucose homeostasis: does brain insulin matter?</a> J Clin Invest. 121 (9), 3392-3395 (2011).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

监测活细胞在CCL5或胰岛素刺激下的反应，对于研究CCL5或胰岛素对GLUT4转运的快速作用至关重要。事实上，这种方法使我们能够直观地观察到在胰岛素刺激下，野生型（WT）与CCR5-/-下丘脑神经元之间的显著差异。我们已在胰岛素刺激后的不同时间点，对野生型和CCR5-/-下丘脑神经元中的内源性GLUT4蛋白进行了细胞表面标记17。细胞表面蛋白的标记需要高特异性抗体并具备低背景信号。此外，表面荧光的定量分析也可能具有挑战性且耗时较长。因此，延时成像使我们能够确信所观察到的CCL5或胰岛素效应是基于实验条件的真实生理变化，而非统计学上的随机变异。结合内源性GLUT4的表面标记实验，我们提供了有力的证据和实验数据，阐明了CCL5与CCR5在GLUT4转位及胰岛素信号通路中的参与机制。
在现代细胞生物学和分子生物学研究中，许多实验需要使用荧光显微镜技术。该技术使科学家能够观察蛋白质和/或细胞器之间的空间关系，以及运动方向与速度、刺激效应、形态变化和蛋白质转运过程。然而，该技术仍存在局限性：当荧光基团被激发时，目标蛋白（或区域）发出的信号可能被背景荧光所掩盖。因此，荧光图像可能显得模糊，预期信号深埋于背景信号之中。这一现象在观察膜结合蛋白时尤为明显。
全内反射荧光显微镜（TIRFM）的开发旨在克服这一难题。该技术使科学家能够选择性地激发特定表面结合的荧光分子，而不影响背景中的其他荧光分子，从而对细胞质膜等极薄表面区域的结构和事件进行特异性表征。去卷积显微技术是一种计算密集型的图像处理方法，得益于近年来的技术进步而得以实现，已被广泛用于提高数字荧光图像的分辨率。如前所述，当荧光分子受到任何类型的照明（如激光或LED）激发时，无论其是否处于焦平面内，所有荧光分子都会发射光信号，导致图像始终存在模糊现象。这种模糊由一种称为&#34;点扩散函数&#34;（PSF）的现象引起：来自微小荧光源（亮点）的光会向外扩散，变得失焦（模糊）。理论上，这一过程会产生沙漏形状的荧光信号，而一幅荧光图像则由大量此类光信号叠加而成。通过去卷积处理，可将所有荧光信号重新分配至其原始的亮点位置，并消除大部分离焦光线，从而提升图像对比度。
近年来，去卷积算法生成的图像分辨率已可与共聚焦显微镜相媲美。此外，与通过有限的激发区域来防止检测到离焦模糊信号的全内反射荧光显微镜（TIRFM）不同，宽场显微镜能够检测所有光信号，并通过去卷积过程将这些信号重新分配回其原始来源。因此，在实际应用中，去卷积显微镜不仅比TIRF显微镜具有更高的图像采集效率，而且成本效益也更高。

2型糖尿病（T2DM）是一场全球性的健康危机。T2DM的特征是外周组织中胰岛素信号传导受损以及慢性炎症。下丘脑是调节机体能量稳态、食欲和昼夜节律的控制中心。更重要的是，下丘脑还介导胰岛素信号反应性，以调节全身代谢1,2,3,4,5。破坏下丘脑中的胰岛素信号通路可能引发胰岛素抵抗6,7。下丘脑协调细胞能量状态以及外周组织分泌的激素（如胰岛素和脂肪因子，例如瘦素），从而调节全身葡萄糖代谢、胰岛素反应性和摄食行为。胰岛素与胰岛素受体结合后，激活胰岛素受体底物（IRS）蛋白，进而激活下游胰岛素信号分子，如PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶）和AKT（蛋白激酶B（PKB/AKT）），诱导GLUT4向细胞膜转位。神经元并非胰岛素介导葡萄糖摄取的主要靶标；然而，在下丘脑弓状核（ARC）区域已检测到显著水平的GLUT4表达。因此，下丘脑神经元中GLUT4的调控可能在脑-外周轴的胰岛素信号传导中发挥重要作用。
许多研究表明，下丘脑中的慢性炎症及炎性趋化因子在糖尿病和肥胖的发生发展中也起着重要作用，抑制下丘脑炎症可逆转饮食诱导的胰岛素抵抗8,9,10。此外，趋化因子CCL5（C-C基序配体5，又称RANTES，活化后正常T细胞表达和分泌蛋白）及其受体CCR5的水平也与2型糖尿病（T2DM）的发展相关11,12。然而，CCL5和CCR5在胰岛素功能和葡萄糖代谢中的作用仍不明确。一项研究报道，CCR5缺失可保护小鼠免受肥胖引起的炎症、巨噬细胞募集及胰岛素抵抗的影响11；相反，另一项研究则报道，CCR5缺失会损害全身性葡萄糖耐量以及脂肪细胞和肌肉组织的胰岛素信号传导12。研究发现，CCL5可通过作用于下丘脑增加T细胞的葡萄糖摄取，并减少摄食行为13,14，但其作用机制及所涉及的受体仍有待明确。
研究外周组织炎症对下丘脑神经元胰岛素功能影响的细胞机制十分困难，这主要由于细胞类型的异质性以及神经回路中的反馈调节作用。因此，一种 体外 细胞培养模型为研究趋化因子对下丘脑胰岛素信号调控的影响提供了一个纯净的体系。尽管目前已有多种成熟的永生化下丘脑神经元细胞系可供研究使用，但这些细胞系表达不同的标志物，因而代表了不同类型的下丘脑神经元。15尽管原代下丘脑培养较难维持，但其可在胰岛素刺激下提供下丘脑神经元最接近生理状态的反应，同时也能避免在含人工生长因子的培养基中长期培养细胞时可能出现的潜在未知影响。
本研究采用来自C57BL/6野生型（WT）小鼠和CCR5基因敲除（CCR5-/-）小鼠的原代下丘脑神经元，并将两种细胞均转染GFP-GLUT4质粒。为探讨CCR5在胰岛素介导的GLUT4膜转运过程中的作用，对转染GFP-GLUT4的神经元分别给予胰岛素或重组CCL5处理。随后，我们利用去卷积显微镜对原代下丘脑神经元中GFP-GLUT4在质膜上的移动进行表征分析。

<table><tbody><tr><td>DeltaVision 去卷积显微镜</td><td>Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science)&amp;nbsp;</td><td></td><td>配备 60x/1.42 NA 油浸物镜；用于拍摄活细胞图像</td></tr><tr><td>SoftWorX 应用软件</td><td>Applied Precision Inc.</td><td></td><td>用于控制显微镜和相机</td></tr><tr><td>VoloCITY 软件</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>用于图像分析</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Actrapid，丹麦</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脂质体</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Lipofectamine&amp;reg; 2000，用于质粒 DNA 转染</td></tr><tr><td>GFP 对照质粒 DNA</td><td></td><td></td><td>由 Samuel Cushman 教授提供</td></tr><tr><td>GFP-GLUT4 质粒 DNA</td><td></td><td></td><td>由 Samuel Cushman 教授提供</td></tr><tr><td>抗小鼠 Alex-488</td><td>Invitrogen</td><td>#A-11001</td><td>二抗</td></tr><tr><td>抗兔 IgG -Alex-568</td><td>Invitrogen</td><td>#A-11036</td><td>二抗</td></tr><tr><td>CCL5/RANTES</td><td>R&amp;D Systems</td><td>478-MR-025</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Kimwipes 擦镜纸</td><td>Kimberly-Clark</td><td>#FL42572A</td><td>厚度 0.17 mm</td></tr><tr><td>12 mm 显微镜盖玻片</td><td>Deckglaser</td><td>#41001112</td><td>用于免疫染色研究</td></tr><tr><td>显微解剖剪刀</td><td>Klappenecker</td><td></td><td>手术工具</td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Ideal-tek</td><td></td><td>手术工具</td></tr><tr><td>标准直头镊子</td><td>Ideal-tek</td><td></td><td>手术工具</td></tr><tr><td>EndoFree 质粒大提试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td>纯化无内毒素质粒 DNA</td></tr><tr><td>5 ml 移液管</td><td>Corning costar&amp;nbsp;</td><td>4487</td><td>用于解离脑组织</td></tr></tbody></table>

使用去卷积显微镜对小鼠原代下丘脑神经元中glut4蛋白转运的活体成像

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

2型糖尿病（T2DM）是一种全球性健康危机，其特征是外周组织中胰岛素信号传导受损以及慢性炎症。中枢神经系统（CNS）中的下丘脑是调控能量平衡和胰岛素信号反应的控制中心。外周组织的慢性炎症以及某些趋化因子（如CCL5、TNFα和IL-6）的失衡与糖尿病和肥胖的发生密切相关。然而，趋化因子与下丘脑胰岛素信号调控之间关联的功能机制仍不明确。
体外 原代神经元培养模型是一种便捷且简单的模型，可用于研究下丘脑神经元中胰岛素信号的调控。在本研究中，我们将外源性与绿色荧光蛋白（GFP）偶联的GLUT4蛋白（GFP-GLUT4）导入原代下丘脑神经元，以追踪胰岛素刺激下GLUT4的膜转位过程。通过去卷积显微镜记录GFP-GLUT4蛋白转运的时间序列图像，该技术可在不显著损伤神经元的情况下，实现高速、高分辨率的成像。我们通过分离并培养CCR5基因敲除小鼠的下丘脑神经元，观察了CCR5在胰岛素调控GLUT4转位中的作用。结果显示，在胰岛素刺激后，CCR5缺陷的下丘脑神经元中GLUT4膜转位效率降低。

从小鼠分离培养的下丘脑神经元通过免疫染色进一步鉴定，所用抗体包括下丘脑特异性蛋白——前阿黑皮素原（pro-opiomelanocortin, POMC）抗体以及神经元标记物——微管相关蛋白2（microtubule-associated protein 2, MAP2）（图2A）。我们证实原代培养的下丘脑神经元表达下丘脑蛋白POMC。使用特异性抗体鉴定下丘脑神经元中CCR5受体和CCL5的表达，并与POMC抗体进行共标记（图2A、2B）。
培养3天后，神经元被转染了GFP DNA（图3）或GFP标记的GLUT4（图4）。GFP的表达通常遍布整个细胞，无特定模式（图3），而GLUT4-GFP则在细胞质中呈现点状结构表达（图4）。本研究使用的转染试剂并非神经元转染效率最高的方法；然而，该方法对细胞的损伤较小，有助于转染后细胞的存活，从而有利于后续的活细胞成像或记录。在胰岛素刺激或CCL5刺激前，采集了表达GFP-GLUT4的神经元图像（图4A-B，补充视频1、2）；刺激后的图像见图4C（补充视频3）。神经元中GFP及GFP-GLUT4的信号清晰且强。
经GLUT4-GFP转染的下丘脑神经元进一步用胰岛素（40 U）处理，以表征GFP-GLUT4的转运情况。分别在野生型（WT）和CCR5-/-下丘脑神经元中，胰岛素刺激下GLUT4-GFP运动的代表性视频显示为视频1和视频2。
<img alt="胚胎解剖与发育阶段；科学实验设置中的显微镜图像" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：从小鼠胚胎期（第16.5天）脑部不同区域分离组织。 （A-D）将仔鼠从胎盘中分离的步骤。（E, F）将仔鼠头部从身体上解剖下来。（G-I）从颅骨中分离完整脑组织的步骤。黑色箭头指示使用镊子去除颅骨时应牵拉的方向。（J）下丘脑的分离。黑色箭头指向镊子之间的下丘脑区域。（K-L）小鼠脑皮层的分离。黑色星号标记小鼠脑的皮层区域，白色箭头指示皮层与全脑的分离位置。（M-O）海马组织与皮层的分离。上方白色箭头标记海马组织，下方白色箭头标记皮层组织。比例尺 = 1 cm（A-F），200 µm（G-O）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜，神经元标记物MAP2，CCR5，POMC，CCL5，合并图像。免疫荧光研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：下丘脑神经元标志物POMC以及CCL5与CCR5共表达的表征。 (A原代培养的下丘脑神经元用下丘脑神经元标志物 POMC（红色）、CCR5（绿色）的共表达以及神经元标志物 MAP2（灰色）进行标记。B) 下丘脑 POMC（红色）阳性神经元中 CCL5（绿色）的表达（改编自参考文献的补充数据）17）。此处DAPI将细胞核标记为蓝色。比例尺 = 50 µm 在 （A）和（B）。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="GFP和DAPI染色神经元培养物的荧光显微镜图像；细胞活力分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：小鼠原代神经元中的GFP蛋白表达。 将GFP质粒DNA转染至原代培养的神经元中，在培养第4天（DIV4）通过脂质体导入，并继续表达3天（DIV7）。(A-B) GFP在神经突和胞体中均有表达。(C-D) 空载转染的神经元；DAPI在(B, D)中标记细胞核。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="免疫荧光显微镜显示野生型和 CCR5^- 细胞中的 INS、CCL5；蛋白质表达分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：下丘脑神经元中GFP-GLUT4的荧光图像快照。 (A，C野生型（WT）下丘脑神经元中表达的GFP-GLUT4蛋白以及（BCCR5-/- 下丘脑神经元。神经元用胰岛素刺激（A，B）或 CCL5（C）。箭头指向神经突中胰岛素或CCL5刺激前（-）和刺激后（+）的GFP-GLUT4点状结构，星号指向CCL5刺激前（-）和刺激后（+）的膜表面GLUT4-GFP（C). （图改编自参考文献）17). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x 硼酸缓冲液</td>
			<td>公司</td>
			<td>货号</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>硼酸</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td>1.55 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>硼砂</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71997</td>
			<td>2.375 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>过滤，4 °C 保存</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x 多聚赖氨酸储备液</td>
			<td>公司</td>
			<td>货号</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>多聚赖氨酸</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>过滤，-20 °C 保存</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x 多聚赖氨酸</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x 多聚赖氨酸</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x 硼酸缓冲液</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总量</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 °C 保存</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>洗涤培养基</td>
			<td>公司</td>
			<td>货号</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-高糖</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-017</td>
			<td>495 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗生素-抗真菌剂</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总量</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 °C 保存</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>木瓜蛋白酶-胰蛋白酶消化缓冲液：</td>
			<td>公司</td>
			<td>货号</td>
			<td>体积/终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>木瓜蛋白酶（10 mg/mL）</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4762</td>
			<td>200 µL (2 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td>200 µL (0.05%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>洗涤培养基</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>600 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总量</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1,000 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>-20 °C 保存</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>铺板培养基：</td>
			<td>公司</td>
			<td>货号</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal 培养基</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>176 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胎牛血清</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-谷氨酸（200 mM）</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗生素-抗真菌剂</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总量</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 °C 保存</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>完全培养基</td>
			<td>公司</td>
			<td>货号</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal 培养基</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>95 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 补充剂（100x）</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 补充剂（50x）</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-04</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-谷氨酸（200 mM）</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗生素-抗真菌剂</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总量</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>现配现用</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本研究中使用的消化缓冲液和培养基成分。
补充视频 1： 胰岛素刺激野生型下丘脑神经元中 GFP-GLUT4 的转运。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/JoVE-Video-1.mov">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频 2： CCL5-/- 下丘脑神经元中胰岛素刺激的 GFP-GLUT4 转位。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/JoVE-Video-2.mov">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频 3： CCL5 刺激野生型下丘脑神经元中 GFP-GLUT4 的转运（视频改编自参考文献17）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/JoVE-Video-3.mov">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了一种利用去卷积显微镜观察胰岛素刺激下实时绿色荧光蛋白（GFP）标记的葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）转运过程，并鉴定CCR5在胰岛素-GLUT4信号通路中生物学作用的技术。

使用去卷积显微镜对小鼠原代下丘脑神经元中GLUT4蛋白转运的活体成像

2型糖尿病（T2DM）是一种全球性健康危机，其特征是外周组织中胰岛素信号传导受损和慢性炎症……

本实验的总体目标是观察原代神经元细胞中蛋白质的实时转运过程（如下丘脑神经元中的GLUT4），同时将损伤降至最低。该方法可用于解答与神经元调节胰岛素信号传导及代谢相关的关键科学问题，例如2型糖尿病的研究。该技术的主要优势在于，研究人员能够分离原代细胞培养物，并实时观察药物诱导的效应。该技术的意义在于，由于我们现在了解了趋化因子CCL5如何在下丘脑神经元中改变胰岛素信号，因此可据此选择针对2型糖尿病或与脑部相关的胰岛素抵抗的治疗方法。开始此操作前，需在细胞培养前一天用聚-D-赖氨酸包被培养皿。对于六孔板，每孔加入1.5 mL浓度为0.05 mg/mL的聚-D-赖氨酸。第二天，去除聚-D-赖氨酸，并用 2 mL 去离子水清洗培养皿两次。然后向 10 cm 培养皿中加入 20 mL 洗涤培养基，置于冰上。向 15 mL 离心管中加入洗涤培养基，同样置于冰上。进行脑组织分离时，使用75%乙醇对操作平台、解剖显微镜和手术器械进行消毒，以避免污染。随后，剪开脐带周围区域，完整分离出仔鼠而不造成损伤。接着，取下每只仔鼠的头部，并用尖头直镊将其固定到位。使用另一把细尖弯镊从两侧去除外层皮肤和颅骨，并从前向背侧方向剥离。然后将分离出的脑组织置于含有冰上冷洗液的干净培养皿中。将脑组织翻转，使腹面朝上。 随后，使用尖头弯镊分离下丘脑组织。用尖镊夹住嗅球，用弯镊剥离包裹整个大脑的薄层脑膜。翻转至大脑皮层腹面，将海马从皮层向外侧牵拉，从而将其与皮层分离。当大脑所有区域均分离完毕后，将这些组织置于含有冰冷清洗液的15 ml离心管中进行剪碎。在此步骤中，通过将含有组织的离心管上下颠倒2至3次来冲洗组织。随后，将离心管保持直立，使组织自然沉降。使用连接真空系统的玻璃巴斯德移液管吸除上层培养基。洗涤组织时，加入15 mL冰浴的洗涤液，将离心管颠倒2至3次。最后一次洗涤后，借助1 mL移液管吸除洗涤液。将组织置于37摄氏度水浴中，用木瓜蛋白酶-胰蛋白酶消化缓冲液孵育7至14分钟。随后，加入一倍体积的胎牛血清以中和酶活性。将离心管置于管架上，静置1至2分钟，使组织沉淀。随后，用1 mL移液器小心吸除上清液。向试管中加入6 mL铺板培养基，用5 mL移液器轻柔地将组织上下吹打50次。将试管置于试管架上，静置1至2分钟，使未充分解离的大块组织沉淀下来。接下来，将含有解离细胞的上层相转移至新离心管中，并用铺板培养基进行稀释。然后，向六孔板的每个孔中加入 2 mL 完全培养基。为了进行活细胞成像，需用镊子小心取出带有神经元的盖玻片，并谨慎地将其放置于载玻片上。然后，将擦拭纸对折两次，小心地将其放在盖玻片上而不移动盖玻片，以去除多余的培养基。必须彻底去除过量的培养基，以防止盖玻片发生不必要的移动。接着，用 10 ng/mL 的 CCL5 或 10 units/mL 的胰岛素处理选定的细胞样品，处理时间为一分钟。随后，将 1.5 µL 稀释后的胰岛素加至盖玻片边缘。然后，在 60 倍放大、数值孔径为 1.52 的物镜上滴加镜油。接着，将盖玻片放置于去卷积显微镜载物台上，使盖玻片朝下并妥善固定。使用明场或荧光照明识别目标细胞。随后调节焦距，直至目标细胞能够被清晰观察。切勿将物镜移出盖玻片区域，以避免产生不必要的划痕。接下来，通过GFP信号鉴定GFP-GLUT4。然后确定用于图像采集的目标细胞。随后，为每个目标细胞设置适当的实验参数，包括像素数、激发波长、透射百分比、曝光时间、层厚、时间间隔和总成像时间。将曝光参数调整至约 2000 到 3000 计数，以达到最大像素强度。为尽量减少荧光漂白，应在保持曝光时间小于一秒的前提下，尽可能降低激发光透射的百分比。通过移动显微镜载物台，将 Z 轴层扫的上下限设置在每个目标细胞的顶部和底部刚好略微失焦的位置。在光成像后神经元死亡过程中，尽量减少荧光光漂白现象非常重要。该图显示，原代培养的下丘脑神经元用神经元标记物MAP2进行标记，同时显示下丘脑神经元标记物POMC及其与CCR5的共表达情况。共定位图像显示，CCL5 在 POMC 阳性的下丘脑神经元中表达。这些图像展示了野生型下丘脑神经元和 CCR5 双阴性下丘脑神经元中 GFP-GLUT4 蛋白的表达。神经元经胰岛素或 CCL5 刺激。箭头指向神经突起中在胰岛素或CCL5刺激前后出现的GFP-GLUT4点状结构，星号表示CCL5刺激前后位于细胞表面的GLUT4-GFP。一旦掌握，该原代细胞实验技术可在1至4小时内完成，具体时间取决于实验需求及操作的熟练程度。该技术为神经科学领域的研究人员探索药物在原代细胞培养中所诱导的即时效应提供了重要途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离原代下丘脑神经元、海马神经元以及皮层神经元。此外，您还将了解如何在不同刺激条件下对串联分子进行活体记录。请务必穿上实验服并佩戴手套，同时经常使用乙醇以避免来自动物的细菌和真菌污染。在整个操作过程中，处理盖玻片和神经元时也需格外小心。

live-images-glut4-protein-trafficking-mouse-primary-hypothalamic

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

用反褶积显微镜观察小鼠原发性下丘脑神经元 GLUT4 蛋白的动态图像

活细胞成像在研究细胞器运输动态时具有特别重要的应用价值。本文描述了一种利用宽场荧光显微镜对培养神经元中致密核心囊泡进行活体成像的实验方案。该方案具有良好的灵活性，可经适当调整用于成像其他细胞器，如线粒体、内体和过氧化物酶体。...

活体成像原代培养的海马神经元中的致密核心囊泡

通过将膜受体的胞外结构域与超 ecliptic pHluorin...

成像小鼠原代培养神经元中pHluorin标记受体插入质膜的过程

本视频展示了一种通过抗体喂养的方法来研究原代海马神经元培养中谷氨酸受体的转运过程。该方法可同时观察细胞质膜和内膜系统上的受体群体。通过在细胞膜透化前后分别进行标记，使用相同的初级抗体但结合不同荧光染料的次级抗体，从而实现对这两类受体亚群的区分。...

一种用于研究海马神经元中谷氨酸受体转运的体外技术

本视频展示了在小鼠脑切片中评估单个皮质-纹状体突触的谷氨酸释放与清除过程。通过电刺激促进突触处谷氨酸的释放。释放的谷氨酸会改变传感器蛋白的荧光信号，该荧光随时间逐渐衰减，从而反映谷氨酸的释放效率与清除能力。...

分析小鼠脑片中单个神经元突触的谷氨酸释放与清除

来源：Changou, C. A., 等 使用去卷积显微镜观察小鼠原代下丘脑神经元中GLUT4蛋白转运的活体成像 视频实验杂志...

使用去卷积显微镜成像小鼠原代下丘脑神经元中GLUT4蛋白的转运

通过从成年小鼠特定脑区分离神经元，并利用荧光膜电位染料成像技术，可研究成年小鼠单个神经元的活动。通过检测神经元对葡萄糖浓度变化的反应，该技术可用于研究成年小鼠腹内侧下丘脑神经元对葡萄糖的敏感性。...

成年小鼠腹内侧下丘脑神经元膜电位染料成像用于研究葡萄糖感应

本文介绍了一种在分离的原代海马神经元培养物中研究谷氨酸受体（GluR）转运的方法。该方法结合使用抗体标记技术对内源性或过表达的受体进行标记，并联合药理学手段，通过调控受体的内吞或再循环过程，从而鉴定调节GluR表面表达的分子机制。...

一种通过抗体饲喂法研究分离原代海马神经元培养中谷氨酸受体转运的方法

我们介绍一种用于评估成年小鼠急性脑片中单个皮质-纹状体谷氨酸能突触处谷氨酸释放与清除之间平衡的实验方案。该方案采用谷氨酸荧光探针 iGluu 进行谷氨酸检测，利用 sCMOS...

正常与亨廷顿病小鼠急性脑切片中谷氨酸释放与摄取的单突触指示剂

本文介绍了一种利用原代小鼠中脑神经元培养物，在体外检测中脑神经元内Ca2+流及其对caspase-3下游效应的方法。该模型可用于研究与中脑神经元Ca2+活动异常相关的病理生理变化，并用于筛选具有抗凋亡特性的新型治疗药物。...

量化原代小鼠中脑神经元中自发性 Ca2+ 流及其下游效应

活体成像是研究健康与疾病状态下生物学的有力工具。本方案描述了使用标准双光子显微镜对小鼠视网膜进行经瞳孔成像的方法。同时展示了多种活体成像技术，用于对视网膜中多个细胞群体进行荧光标记。...

经瞳孔双光子活体小鼠视网膜成像

在此，我们演示如何将原代海马神经元的转染与活细胞共聚焦成像相结合，以分析病理蛋白诱导的轴突运输变化，并鉴定介导这些效应的分子机制通路。...

利用活细胞成像技术测定病理性蛋白对原代海马神经元轴突运输的影响

了解反褶积显微镜技术用于观察小鼠原代下丘脑神经元中GLUT4蛋白的实时动态转运过程。该方法结合胰岛素刺激，揭示CCR5在胰岛素信号通路中的作用，为2型糖尿病治疗提供新思路。

使用去卷积显微镜对小鼠原代下丘脑神经元中GLUT4蛋白转运的活体成像

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