细胞周期分析

细胞周期是指细胞内发生的一系列细胞和生化过程，最终导致细胞分裂。细胞会经历周期中的不同阶段，完成这一过程所需的时间对于特定类型的细胞而言几乎是恒定的。任何偏离该时长的情况都提示存在异常的细胞分裂。因此，细胞周期分析成为研究细胞分裂机制的生物学家非常有用的工具，这将最终有助于治疗细胞周期发生紊乱的疾病（如癌症）的患者。

本视频将讨论细胞周期分析的原理及通用实验方案。最后，我们将展示这一常用方法的一些应用。

让我们来了解什么是细胞周期分析，以及该检测方法的工作原理。

本质上，对混合细胞群体进行细胞周期分析可以告诉我们有多少细胞处于各个不同的周期阶段。这通常是通过评估细胞的DNA含量来实现的。你可能会问：为什么是DNA含量？为了理解这一点，我们先简要回顾一下细胞在周期进程中染色体DNA的变化情况。

在G1期，细胞内的DNA含量保持不变。进入S期后，DNA开始复制，到该阶段结束时，DNA含量增加一倍。在G2期，细胞会检查DNA复制过程中是否存在错误，最终在M期结束时，DNA被均等地分配到两个子细胞中。因此，通过标记DNA，科学家可以判断细胞所处的周期阶段。

进行这种标记时，一个重要的考虑因素是DNA结合染料的选择。溴脱氧尿苷（BrdU）是一种核苷酸类似物，结构上模拟胸腺嘧啶，可在DNA复制过程中掺入正在合成的DNA链中。因此，该染料仅标记处于S期的细胞。在BrdU掺入后，DNA双链被解离，并利用荧光标记的抗体检测BrdU的存在。

其他化合物，例如本身具有荧光特性的碘化丙啶（PI），能够插入双链核酸之间，从而对所有周期阶段的细胞进行染色。然而，PI的染色强度与DNA含量成正比。

尽管染料的选择取决于具体的实验需求，研究人员通常采用双重染色方法。像PI这类能与所有细胞按比例结合的分子，可有效区分G1期细胞与G2/M期细胞。但S期细胞仍处于过渡状态，因此加入仅标记S期细胞的分子（如BrdU），可提高细胞周期阶段识别的特异性。最后，通过流式细胞术对细胞进行分析，以统计处于不同细胞周期阶段的细胞数量。

现在您已经了解了细胞周期染色的基本原理，接下来我们讨论一种使用 BrdU 和 PI 的实验操作流程。

准备细胞培养皿：一组用于实验，另外三组作为对照。当细胞融合度达到约 60% 时，将溶解在培养基中的 BrdU 加入活细胞中，随后进行孵育。在此阶段，BrdU 会被整合到正在复制的 DNA 中。

孵育结束后，将细胞离心并重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中。接着，在持续轻柔涡旋的条件下，将细胞悬液逐滴加入预冷的 70% 乙醇中以固定细胞。该步骤可终止细胞分裂并防止细胞聚集。

固定后的细胞再次离心并重悬于 PBS 中。然后逐滴加入含有去垢剂（如 Triton-X）的浓酸溶液。去垢剂可使细胞膜通透，允许原本不能穿透膜的化合物进入细胞；酸处理则降低 pH 值并使 DNA 变性，从而暴露 BrdU。随后将细胞离心，弃去上清液，并将沉淀重悬于碱性溶液中以恢复 pH 值。

最后，用 PBS 洗涤细胞，并在室温下与偶联荧光标记的 BrdU 抗体共同孵育。此步骤之后，样品应避光保存，以防止荧光淬灭。

进行双染色时，细胞需与 PI 和 RNase 一起孵育。RNase 的作用是去除 RNA-RNA 或 RNA-DNA 双链结构，这些结构也能与 PI 结合，可能导致假阳性结果。最后将细胞通过细胞滤网处理，制成单细胞悬液，这是进行流式细胞术分析所必需的步骤。

现在您已经学习了染色的实验步骤，接下来让我们回顾如何分析所获得的数据。

简而言之，在流式细胞术中，激光束照射单细胞悬液的狭窄液流，每个细胞中染料在特定波长下的发射光被检测为散点图中的单个事件。

此处，经PI染色的细胞散点图显示出两个明显不同的细胞群，其中一个群体的PI信号强度几乎是另一个群体的两倍。在优化PI检测器后，这两组细胞在直方图分析中表现为两个峰。PI荧光强度较高的峰代表处于G2/M期的细胞，而强度较低的峰代表处于G1期的细胞。这两个峰下的面积分别代表相应细胞周期阶段的细胞数量。

同样，BrdU-FITC信号事件可在对数坐标直方图中进行分析。该图显示，BrdU阳性细胞的荧光强度明显高于未染色细胞；由于仅有部分细胞处于S期，因此可观察到一个更大的BrdU阴性细胞峰。

经BrdU和PI双染的细胞散点图可将PI信号置于线性X轴，BrdU信号置于对数Y轴，呈现出从G1期经S期到G2/M期的马蹄形分布模式。可通过设门分析确定各区域中细胞的比例，并以柱状图形式展示结果。

在了解了细胞周期分析的基本实验流程后，让我们来看看它在不同实验设计中的应用。

A. 通过将基因操作与细胞周期分析相结合，科研人员可以研究特定蛋白质在细胞周期进程中的作用。在本项研究中，科学家在小鼠胚胎成纤维细胞中过表达了名为p27的蛋白质。结果显示，过表达导致处于S期的细胞数量减少，表明该蛋白质在细胞周期调控中发挥关键作用。

利用细胞周期分析，科研人员可以比较不同细胞系的周期进程动力学。在此例中，研究人员比较了两种结直肠癌细胞系与一种乳腺癌细胞系的进程动力学。结果表明，随着时间推移，乳腺癌细胞中处于G1期的细胞比例更高，说明其细胞周期进程速度较结直肠癌细胞系更慢。

最后，在活体（in vivo）细胞周期分析中，可将BrdU注射至啮齿类动物体内，并分离目标细胞群体进行细胞周期分析。在本研究中，研究人员分离了注射BrdU的小鼠的造血干细胞（HSCs），并进行流式细胞术分析。所获数据揭示了HSCs在不同细胞周期阶段的分布情况，其中以G1期和S期为主。

您刚刚观看了 JoVE 关于细胞周期分析的视频。我们回顾了该技术的原理，详细介绍了实验操作步骤，并探讨了此类分析在不同实验环境中的应用。一如既往，感谢您的观看！