4.2: 细胞周期分析

细胞周期是指细胞内发生的导致其分裂的一组细胞和生化过程。一个细胞会经历周期的不同阶段，对于一种细胞类型来说，完成这个过程所需的时间几乎是恒定的。任何偏离此持续时间都表明细胞分裂异常。因此，对于有兴趣研究细胞分裂机制的生物学家来说，细胞周期分析成为非常有用的工具，这最终将有助于治疗患有癌症等细胞周期被破坏的疾病患者。

本视频将讨论细胞周期分析的原理和通用方案。最后，我们将展示这种常用方法的一些应用。

让我们了解什么是细胞周期分析，以及这种分析是如何工作的。

从本质上讲，混合群体的细胞周期分析告诉我们每个不同阶段有多少个细胞。这通常是通过评估细胞的 DNA 含量来完成的。您可能会想：为什么是 DNA 含量？为了理解这一点，让我们简要回顾一下细胞在周期中的进展过程中染色体 DNA 会发生什么。

在 G1 期，细胞内的 DNA 含量不会改变。在 S 期，DNA 复制发生，到该阶段结束时，DNA 含量增加一倍。在 G2 期，细胞检查 DNA 复制没有错误，最后在 M 期结束时，这些 DNA 被平均分成两个子细胞。因此，标记 DNA 可以帮助科学家确定细胞周期阶段。

这种标记的一个重要考虑因素是 DNA 结合染料的选择。溴脱氧尿嘧啶或 BrdU 是一种核酸类似物，在结构上模拟胸苷。这使得 BrdU 能够在 DNA 复制过程中掺入生长链中。因此，这种染料仅标记 S 期的细胞。BrdU 掺入后，DNA 链被分离，并在荧光标记抗体的帮助下检测 BrdU。

其他化合物，如碘化丙啶或 PI，本质上具有荧光，嵌入双链核酸之间，因此在所有阶段都会对细胞进行染色。然而，PI 染色的量与 DNA 量成正比。

虽然染色剂的选择取决于手头的实验，但研究人员经常使用双重染色程序。像 PI 这样按比例与所有细胞结合的分子可以很容易地区分 G1 细胞和 G2 或 M 期细胞。然而，S 期细胞仍处于过渡期。因此，添加像 BrdU 这样仅标记 S 期细胞的分子可以提高细胞周期期检测的特异性。最后，使用流式细胞术分析细胞，以计数不同细胞周期阶段的细胞。

现在您已经了解了细胞周期染色背后的原理，让我们讨论使用 BrdU 和 PI 的程序。

设置细胞培养皿：一个用于实验，另外三个作为对照。在汇合度约为 60% 时，将溶解在培养基中的 BrdU 添加到活细胞中，然后进行孵育。在这个阶段，BrdU 被掺入复制 DNA 中。

孵育后，将细胞离心并重悬于磷酸盐缓冲盐水或 PBS 中。接下来，通过将细胞悬液滴加到冰冷的 70% 乙醇中，同时轻轻涡旋来固定细胞。这可以停止细胞分裂并防止结块。

将固定的细胞再次离心并重悬于 PBS 中。然后，将含有去污剂（如 Triton-X）的浓酸溶液逐滴加入细胞中。去污剂可透化细胞以允许膜不渗透性化合物进入，而酸会降低 pH 值并使 DNA 变性，从而暴露 BrdU。然后离心细胞，弃去上清液，将沉淀重悬于碱性溶液中以恢复 pH 值。

最后，用 PBS 洗涤细胞，并在室温下与偶联荧光标签的 BrdU 抗体一起孵育。此步骤后，应避光保护样品以避免光漂白。

双重染色时，将细胞与 PI 和 RNase 一起孵育。RNase 是去除 RNA-RNA 或 RNA-DNA 双链所必需的，它们也与 PI 结合并可能产生假阳性结果。然后，细胞通过细胞过滤器制备单细胞悬液，这是流式细胞术分析所必需的。

现在您已经了解了染色方案，让我们回顾一下如何分析获得的数据。

简而言之，在流式细胞术中，激光束照射在狭窄的单细胞悬液流上，每个细胞中染料在特定波长下的发射在散点图上被检测为单个事件。

在这里，PI 染色细胞的散点图显示了两个不同的簇，一个簇的 PI 量几乎是另一个簇的两倍。优化 PI 检测器后，这些组在直方图分析中显示为两个峰。PI 强度较高的峰值代表 G2/M 细胞，强度较低的峰值代表 G1 细胞。这些峰值下的面积表示相应相中的单元格数。

同样，BrdU-FITC 事件可以以对数刻度显示在直方图分析中。该图显示 BrdU 阳性细胞明显比未染色的细胞亮，并且由于只有一小部分细胞群处于 S 期，因此可以看到 BrdU 未染色细胞的更大峰值。

用 BrdU 和 PI 染色的细胞的散点图可以显示，PI 在线性 X 轴上，BrdU 在对数 Y 轴上，这显示了从 G1、S 到 G2 的马蹄形图案。可以确定门控区域中像元的比例，并将其显示在条形图上。

现在我们已经了解了细胞周期分析的基本方案，让我们看看它如何用于各种实验设置。

A. 通过将遗传作与细胞周期分析相结合，科学家们研究了特定蛋白质在细胞周期进程中的作用。在这项研究中，科学家在小鼠胚胎成纤维细胞中过表达一种称为 p27 的蛋白质。结果表明，过表达导致 S 期细胞数量减少，表明该蛋白在细胞周期调节中起关键作用。

使用细胞周期分析，科学家可以比较进展动力学。在这里，比较了两种结直肠癌细胞系和一种乳腺癌细胞系之间的进展动力学。结果表明，鉴于随着时间的推移，G1 中乳腺癌细胞的百分比较高，因此与结直肠细胞系相比，乳腺癌细胞在细胞周期中的进展速度较慢。

最后，对于体内细胞周期分析，可以将 BrdU 注射到啮齿动物中，并且可以分离目标细胞群进行细胞周期分析。在本研究中，分离了 BrdU 注射小鼠的造血干细胞或 HSC 用于流式细胞术分析。收集的数据揭示了 HSCs 在不同细胞周期阶段的分布，其中 G1 期和 S 期占主导地位。

您刚刚观看了 JoVE 关于细胞周期分析的视频。我们回顾了这个过程背后的原则，详细介绍了一个分步方案，并回顾了如何在各种实验环境中使用这种类型的分析。一如既往，感谢您的观看！