利用小鼠脑部连续药物输注系统研究下丘脑胰岛素信号对周围性葡萄糖耐受不良的影响

本实验的总体目标是通过使用微渗透泵经脑室内给药系统给予拮抗剂 Met-C-C-L-5，调控下丘脑 C-C-L-5 信号通路，从而研究该信号通路在周围系统胰岛素功能及葡萄糖代谢中的作用。该方法有助于解答生物化学生理学领域的关键问题，例如脑内趋化因子 C-C-L-5 在调控机体葡萄糖代谢和胰岛素敏感性中的作用。该方法的主要优势在于，实验者可在一段时间内便捷地操控脑内特定信号通路（如本实验中的 C-C-L-5），而不会引发代偿效应或功能紊乱——而这通常是通过遗传学手段操控啮齿类动物时常见的问题。

该操作的可视化演示非常重要，因为微型渗透泵的植入以及血液胰岛素和葡萄糖水平的准确测定需要熟练的技术和精确的操作。手术前一天，使用1毫升注射器和钝头针将微型渗透泵填充人工脑脊液（A-C-S-F）。随后，将泵浸入A-C-S-F中，并置于摇床上进行轻柔过夜振荡。

次日，将 A-C-S-F 从泵上取下，用预先配制的药物溶液（用 A-C-S-F 稀释）完全填充 A-C-S-F，直至多余液体渗出。然后，使用手术剪将导管剪至所需长度。使用钝端脑部灌注针，将导管连接至脑部灌注套件。

然后，用药物溶液填充输注套件中的导管。组装完成后，将套件连接至微型渗透泵。最后，为防止泵体干燥，将渗透泵脑部输注装置浸入无菌的50毫升离心管内的人工脑脊液（A-C-S-F）中。

开始手术时，将麻醉小鼠的头部固定在立体定位仪上。使用手术剪和镊子切开覆盖颅骨的外层皮肤。然后，用碘液清洁颅骨周围区域。

接下来，使用一把钝头剪刀在颈部区域附近将最外层皮肤与皮下组织分离，以便进行渗透泵脑融合装置的植入。利用立体定位仪参照脑图谱标记灌注位点。使用牙科钻在颅骨标记区域周围钻孔，注意避免损伤小鼠的脑膜和血管。

然后，将含有待研究药物的微型渗透泵脑融合套装，或作为对照的A-C-S-F，置于颈部后方的皮下。为了将药物输注到脑内，将脑部输注针插入钻好的孔中。使用表面去敏凝胶将输注针固定在颅骨上，并等待胶水完全干燥。

剪去针头上方突出的部分。在开始葡萄糖耐量试验之前，通过将3.75克葡萄糖溶解于15毫升蒸馏水中来配制葡萄糖溶液。制定一个时间表，在每次血液检测之间设置适当的时间间隔，以记录实验过程中的读数。

接着，在禁食后称量每只小鼠的体重，以计算注射所需适量的葡萄糖。然后在实验台处准备好计时器、葡萄糖试纸、血糖仪、胰岛素注射器和剃须刀片。为测量血糖水平，首先将新的葡萄糖试纸插入血糖仪中，并按下启动按钮进行归零设置。

然后，抓住小鼠颈部后方皮肤并轻抚其尾部，以确保血流充足。使用新的剃须刀片切下尾部一小段，挤出一滴血液至血糖试纸上。采用经口胃灌注技术，给予小鼠葡萄糖，并立即启动计时器。

在不同时间点测量葡萄糖水平。开始胰岛素耐受试验时，准备 0.25 单位的人胰岛素溶液。然后，在禁食后称量每只小鼠的体重，以计算注射所需的适当胰岛素剂量。

接下来，制定一个时间表，用于记录实验过程中的读数。最后，在注射胰岛素后，按照之前的方法测量血糖水平。术后通过口服葡萄糖耐量试验来评估葡萄糖代谢，即在小鼠口服葡萄糖后进行检测。

输注A-C-S-F或C-C-L-5拮抗剂的小鼠血糖水平变化被记录并展示于此。同时进行了胰岛素敏感性检测，结果显示，与对照组小鼠相比，输注C-C-L-5拮抗剂的小鼠血糖水平仅轻微降低，提示经C-C-L-5处理的小鼠在外周葡萄糖代谢中的胰岛素功能受损。为分析胰岛素信号通路的激活情况，检测了下丘脑中胰岛素受体底物蛋白（I-R-S-1）的磷酸化水平。

在正常喂养条件下，接受C-C-L-5拮抗剂处理的小鼠中，I-R-S-1的磷酸化水平较对照组升高。为了进一步分析胰岛素信号通路的激活情况，还检测了下游信号分子Akt（丝氨酸4-7-3位点磷酸化）的磷酸化水平。胰岛素刺激后，对照组经A-C-S-F处理的小鼠A-K-T信号增强，而C-C-L-5拮抗剂处理的小鼠则未出现该信号增强。

一旦熟练掌握微型渗透泵的植入操作，若操作得当，仅需半小时即可完成。在进行该操作时，重要的是确保小鼠头部在立体定位仪上略微抬高，且脊柱保持平直。该技术为内分泌学领域的研究人员提供了一种探索药物、趋化因子或特定蛋白质功能在啮齿类动物脑内作用的方法。

在完成此操作后，还可进行其他检测，例如通过脑内注射病毒或CRISPR-Cas9技术调控基因表达，以回答更多科学问题，比如C-C-L-5及其受体C-C-L-5如何参与食物消化与代谢的神经环路？