Name: 非遗传表面修饰的素-生物素系统在牛分枝杆菌卡介苗中的外源抗原表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 了解利用链霉亲和素-生物素系统对牛分枝杆菌卡介苗进行非遗传表面修饰以表达外源抗原的方法。该技术为传统基因方法提供了快速替代方案，有助于分枝杆菌学和疫苗开发研究。

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我们感谢 R. Stokes 博士提供 BCG Pasteur 菌株，感谢 A. Talal 提供技术支持。我们还感谢 GenScript 在基因合成方面的帮助。

所有动物的饲养均遵循不列颠哥伦比亚大学动物护理与使用委员会批准的方案。实验经动物护理与使用委员会批准，并按照加拿大动物护理委员会指南进行。动物福利保证编号为 A11-0247。
1. 单体亲和素融合蛋白表达质粒的构建
<ol>
	<li>亚克隆单体亲和素序列12 pDEST17 质粒的 &#34;循环肿瘤细胞&#34; 和 &#34;GAA&#34; 对应于133-134bp的位点。即，位于6-His标签与pDEST17之间 Attr1 重组位点）以获得 p17-Avi。 
	注意：以下显示的是单体亲和素的DNA序列。为获得单体亲和素，在野生型亲和素中引入的三个突变以加粗字符标出。 
	gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc 
	agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac 
	acaaGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct 
	tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac 
	attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga</li>
	<li>设计两端带有侧翼的引物 AttB1 和 Att对应于OVA多肽的B2位点757-1035 (I-Ab- 和 H-2Kb-受限制的表位）DNA序列。引物序列如下： Attb1-OVA 
	GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT 和 Attb2-OVA 
	GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGCAttb1 和 Attb2 序列以粗体显示。
	<ol>
		<li>PCR扩增OVA多肽757-1035 使用pUC57-OVA质粒作为模板，以上述引物进行DNA测序。</li>
		<li>将PCR产物通过位点特异性克隆至pDONR-221中 体外 重组反应（例如，BP Clonase）以获得 pDONR-OVA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将目的基因通过LR Clonase反应转入p17-Avi载体，获得p17-Avi-OVA。 
	注意：有关BP和LR重组克隆的详细信息，请参见生产商手册。</li>
</ol>
2. 单体亲和素融合蛋白的表达、纯化与复性
<ol>
	<li>将p17-Avi-OVA质粒转化至 E. coli BL21 并诱导 250 mL 的 E. coli BL21 培养物在 37 °C 下用 IPTG（0.1 M）诱导 3 小时。</li>
	<li>细菌裂解与包涵体溶解
	<ol>
		<li>将250 mL诱导表达的BL21菌液在4 °C、4,000 × g条件下离心30 min，收集菌体。</li>
		<li>将沉淀重悬于10 mL裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，6 M Guanidine-HCl，pH 1.5–2.5）中，95 °C孵育15分钟。随后在旋转摇床上室温孵育过夜。</li>
		<li>在 15,000 × g 和 4 °C 条件下离心 30 分钟，收集上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 Ni-NTA 柱从上清液（溶解的包涵体组分）中纯化 Avi-OVA。
	<ol>
		<li>用裂解缓冲液将包涵体按1:2比例稀释。</li>
		<li>每250 mL培养物来源的包涵体使用4 mL Ni-NTA树脂。</li>
		<li>用10 mL裂解缓冲液（pH 7.0）洗涤3次。</li>
		<li>用10 mL洗脱缓冲液（含250 mM咪唑的裂解缓冲液，pH 7.0）进行洗脱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过逐步稀释（1:10）并在含有1 mM DTT、200 mM NDSB256（3-(苄基二甲基铵)丙磺酸盐）、0.5 mM Tween 80、500 mM 精氨酸和200 mM NaCl的Tris缓冲液（pH 7.5）中快速涡旋，于室温下复性30分钟。</li>
	<li>使用蛋白浓缩装置，按照生产商说明书将复性后的蛋白从Tris缓冲液脱盐并置换至PBS缓冲液中。</li>
	<li>通过离心去除聚集体，3,500 × g 离心 30 分钟 x g 并在4°C下保存，将可溶性蛋白分装后于-20°C储存。</li>
</ol>
3. BCG 细胞表面生物素标记
<ol>
	<li>在含有10% OADC（油酸、白蛋白和葡萄糖溶液）和0.05% Tween 80的Middlebrook 7H9液体培养基中，于37 °C、50 rpm振荡培养箱中培养BCG，直至OD值达到0.5–1。 
	注意：BCG属于生物安全二级病原体，所有涉及BCG的实验均应在生物安全柜内进行，并佩戴适当的个人防护装备。</li>
	<li>用500 µL冰浴的无内毒素PBS（pH 8.0）加0.1% Tween80（PBST）洗涤109个BCG细胞3次。将BCG菌体沉淀重悬于无菌、无内毒素的PBS中。</li>
	<li>使用前立即配制1 mL 10 mM Sulfo-NHS SS生物素溶于无菌过滤水中。
	<ol>
		<li>将细菌与1 mL 0.5 mM Sulfo-NHS SS生物素在室温下孵育30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用500 µL冰浴的PBST洗涤标记后的细菌3次，以去除未反应的生物素化试剂。
	<ol>
		<li>将菌体沉淀重悬于1 mL PBST中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为评估生物素化效率，取108个生物素化的BCG，加入链霉亲和素-FITC（1:100，25 µL），室温避光染色20分钟。
	<ol>
		<li>将染色后的细菌在1 mL 2%多聚甲醛（PFA）中室温固定20分钟，随后通过流式细胞术分析生物素化水平。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 生物素标记分枝杆菌的表型：生长与存活
<ol>
	<li>在含有10% OADC（油酸、白蛋白和葡萄糖溶液）和0.05% Tween 80的Middlebrook 7H9液体培养基中，于37 °C、50 rpm振荡培养BCG菌株。
	<ol>
		<li>记录细菌培养物在8天内的光密度（OD600）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用BCG-Luc（先前已有描述9）检测细菌在巨噬细胞中的存活情况。
	<ol>
		<li>用生物素标记的BCG-Luc（感染复数MOI 10:1）或未处理的BCG-Luc（对照）感染RAW264.7细胞，并在37 °C孵育48小时。</li>
		<li>洗涤细胞单层，然后用0.025% SDS裂解以释放被吞噬的细菌。</li>
		<li>使用荧光素酶检测试剂盒和发光仪测定生物发光信号。 
		注意：发光信号反映细菌的活力。有关荧光素酶检测的详细步骤，请参阅试剂盒制造商的操作手册。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 单体亲和素融合蛋白与生物素化BCG表面的结合
<ol>
	<li>在摇床平台上，将 5 × 108 个生物素标记的 BCG 与 Avi-蛋白（在 PBS-T 中终浓度为 10 μg/mL）于室温下混合孵育 1 小时。</li>
	<li>用 500 µL 冰冷的 PBST 洗涤细菌 3 次，然后在室温下用兔抗亲和素抗体（Ab）（1:100 稀释，先前已描述10）孵育 20 分钟，随后在相同条件下用 FITC 标记的羊抗兔 IgG 抗体孵育。</li>
	<li>用 500 µL PBST 洗涤细菌 3 次，通过流式细胞术分析以评估表面修饰程度。</li>
</ol>
6. 分枝杆菌的冻干
<ol>
	<li>根据步骤 3.1–3.4 对细菌进行生物素标记，并根据步骤 5.1 用 Avi-OVA 包被生物素标记的细菌。</li>
	<li>取等份生物素标记并包被的细菌（108），用 PBS 洗涤后重悬于 0.5 mL 冻干保护液中（25% Sauton 培养基，75% H2O 和 1.5% Na-谷氨酸）。</li>
	<li>将细菌转移至玻璃小瓶中，在 -80 °C 冰箱中冷冻过夜。</li>
	<li>使用冷冻干燥机对已填充并冷冻的玻璃小瓶进行 24 小时冻干。</li>
	<li>将干燥样品在室温下保存，使用时用 PBS 重悬。</li>
	<li>重复步骤 3.5 以评估生物素标记及表面包被的稳定性。</li>
</ol>
7. 吞噬作用检测
<ol>
	<li>在含有5%胎牛血清（FCS）、1% L-谷氨酰胺、1% HEPES、1%非必需氨基酸以及1%青霉素和链霉素的DMEM培养基中，将RAW 264.7巨噬细胞培养于直径10 cm的培养皿中，直至细胞融合度达到70–80%。</li>
	<li>将2 × 106个RAW 264.7巨噬细胞接种至6孔板中，在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜，使细胞充分贴壁。</li>
	<li>根据步骤3.1–3.4和5.1制备携带Avi-OVA的DsRed BCG（DsRed BCG-Avi-OVA）（方法先前已有描述9）。</li>
	<li>以感染复数（MOI）20:1的条件，在37 °C下用DsRed BCG-Avi-OVA或未经处理的DsRed BCG感染RAW细胞，持续24小时。</li>
	<li>用1 mL浓度为0.25%的胰蛋白酶在37 °C孵育10分钟，洗涤细胞三次并进行消化，以去除部分松散附着的细菌。</li>
	<li>在室温下用PBS配制的2.5%多聚甲醛固定20分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤三次后，通过流式细胞术进行分析。</li>
</ol>
8. 巨噬细胞中OVA修饰的生物素化BCG的细胞内转运
<ol>
	<li>荧光显微镜技术
	<ol>
		<li>接种 3 × 105 24孔板中盖玻片上的RAW 264.7巨噬细胞。于37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜，使细胞贴壁。2.</li>
		<li>在37 °C、5% CO₂条件下，用分枝杆菌（感染复数为10:1）在不含抗生素的维持培养基中感染巨噬细胞2 4 至 24 小时。</li>
		<li>洗涤细胞并进行胰蛋白酶消化，以去除表面附着的未被吞噬的细菌，步骤同7.5。</li>
		<li>在室温下用含2.5%多聚甲醛的PBS固定感染细胞20分钟，随后用PBS洗涤3次。</li>
		<li>在室温下用封闭/通透缓冲液（PBS 中含 0.1% Triton X-100 和 3% BSA）孵育细胞 20 分钟以进行细胞通透处理。
		<ol>
			<li>使用感兴趣的特异性抗体（例如，兔抗avidin一抗）以10 μg/mL溶于通透缓冲液，室温孵育20分钟，随后加入二抗（例如，FITC-山羊抗兔IgG）孵育20分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用 PBS 洗涤细胞 3 次，再用水洗涤 1 次，然后将细胞置于载玻片上，加入 10 μL 水溶性封片剂封片，以尽量减少荧光淬灭。</li>
		<li>使用配备63x/1.4 Plan-Apochromat物镜的落射荧光显微镜，通过数字共聚焦显微镜技术观察载玻片。利用与显微镜软件连接的数字相机采集图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫金染色与电子显微镜技术
	<ol>
		<li>接种 2 × 106 6 孔板中的 RAW 264.7 巨噬细胞</li>
		<li>在室温下用4%多聚甲醛固定感染BCG的巨噬细胞4小时。</li>
		<li>用 PBS 清洗样品两次。</li>
		<li>将样品包埋于4%低熔点琼脂糖中，并用70%乙醇脱水。</li>
		<li>将样品转移至丙烯酸树脂中，并在 50 °C 下聚合。</li>
		<li>使用切片机切取60 nm的切片，并将切片收集于镍网上。</li>
		<li>在孵育液（PBS 和 0.1% BSA）中，室温下加入 10 μg/mL 亲和素抗体标记样品 1 小时，或 4 °C 过夜，随后用孵育液洗涤，再加入胶体金标记的 F(ab')2 在孵育液中，室温下用超小型山羊抗兔IgG（1/20）孵育1小时。</li>
		<li>用蒸馏水冲洗切片，用2%戊二醛染色，再次冲洗，风干后用电子显微镜观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 动物免疫与器官处理
注意：所有步骤均应在生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>将生物素化且包被蛋白的细菌通过271/2G针头10次，以制备单细胞悬液。</li>
	<li>取1 × 106个细菌溶于100 μL无内毒素的PBS中，皮下注射至雌性C57BL/6小鼠（I-Ab，H-2Kb，5–6周龄）颈背部进行免疫。
	<ol>
		<li>对照组小鼠仅注射100 μL PBS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫后第20天，通过CO2吸入法处死免疫小鼠，随后行颈椎脱位确认死亡。
	<ol>
		<li>取出脾脏并转移至RPMI培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用5 mL注射器活塞将脾脏组织研磨通过70 µm细胞筛网。
	<ol>
		<li>用5 mL RPMI洗涤。离心（800 × g，3分钟）以获得单细胞悬液。</li>
		<li>使用小鼠生物素阳性选择试剂盒（含生物素标记的Ter119/红系细胞抗体）去除红细胞。</li>
		<li>离心后将细胞重悬于10 mL完全RPMI培养基（含10% FCS、1% L-谷氨酰胺、1%青霉素、1%链霉素和50 μM 2-ME）中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. 使用 I-Ab 四聚体染色法检测免疫动物中抗原特异性CD4+ T细胞频率及通过胞内细胞因子染色法检测抗原特异性T细胞释放细胞因子的频率
<ol>
	<li>四聚体染色
	<ol>
		<li>用PE标记的I-Ab-OVA323-339四聚体（1/12.5稀释度）在37 °C下于结合缓冲液（含2% FCS和0.1% NaN3的PBS）中孵育对照组和免疫小鼠的脾细胞（约20 × 106个细胞）1小时。</li>
		<li>加入AF647标记的CD4抗体（1:25）和7-AAD（用于检测死亡细胞），室温避光孵育20分钟。</li>
		<li>通过流式细胞术分析样品。</li>
		<li>在CD4阳性区域采集500,000个事件，以确定四聚体阳性事件的频率。 
		注：总脾细胞通过SSC/FSC点图定义，活细胞通过排除7-AAD阳性事件确定，CD4亚群通过圈选AF647阳性事件获得。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗原特异性胞内细胞因子释放T细胞频率检测
	<ol>
		<li>将约1 × 107个脾细胞转移至六孔板中，加入4 mL完全RPMI培养基，分别加入或不加入重组OVA蛋白（10 µg/mL），37 °C孵育16小时。</li>
		<li>加入布雷菲德菌素A（Brefeldin A，1:1,000）继续孵育5小时。</li>
		<li>用PBS洗涤细胞，随后进行胞内细胞因子染色，步骤如下：
		<ol>
			<li>在室温下用PE-CD8或PE-Cy7-CD4抗体（1:50，溶于结合缓冲液）染色细胞样本30分钟。</li>
			<li>用4%多聚甲醛（PFA）室温固定20分钟。</li>
			<li>根据试剂说明书使用通透液对细胞进行通透处理。</li>
			<li>洗涤细胞后，在室温下用AF647标记的IFN-γ抗体（1:50）孵育20分钟。</li>
			<li>再次洗涤细胞，并按上述方法进行流式细胞术分析。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究报道了一种非遗传学方法，可快速有效地将外源蛋白展示于卡介苗（BCG）表面，从而赋予该菌株特定抗原或特定功能特性，有望显著增强其免疫原性。我们证明，卡介苗细胞表面可轻松实现生物素化，进而实现与亲和素融合蛋白的即时表面修饰。整个操作过程可在2小时内完成，而遗传转化及阳性克隆筛选则需2至3个月的时间。表面修饰不影响细菌的生长与存活。携带替代抗原卵清蛋白（OVA）的修饰细菌能够将抗原递送至抗原呈递通路，并诱导特异性免疫应答。 体内 通过流式细胞术检测，包括MHC四聚体染色和细胞内细胞因子染色（ICS）进行评估。更重要的是， 体内 研究结果明确显示，表面修饰的细菌能够诱导与表达相似抗原的基因工程卡介苗（BCG）相当的免疫反应水平。
亲和素-生物素相互作用是自然界中已知最强的非共价相互作用，其解离常数（Kd）为 10−15 M13。它不仅是生物研究中常用的有用工具14，而且最近也被证明可用于癌...

已提出多种策略以取代当前的结核病疫苗BCG，包括蛋白质佐剂系统、病毒载体技术、减毒活M.tb菌株以及基因改造的BCG菌株，其目的或是引入在感染期间表达不足的BCG抗原的过表达基因1，或是引入BCG中不存在的Mtb特异性抗原2。然而，基因工程面临诸多障碍，包括安全性水平不确定、操作过程耗时以及表达载体效率低下4,5。在改进BCG方面，亟需一种无需依赖不确定性基因改造即可增强免疫原性的替代方法。
本研究介绍了一种基于亲和素与生物素之间高亲和力相互作用的新型策略，用于在卡介苗（BCG）细胞表面展示目标重组蛋白。该方法可实现重组亲和素融合蛋白在生物素化BCG表面的快速、可重复性结合，从而便于对BCG进行广泛改造，以最大程度地提高其有效性，同时保持其数十年应用中所证实的良好安全性记录。
Avidin 对生物素的亲和力极高（Kd = 10−15 M），一旦形成，生物素-亲和素复合物非常稳定，只能在变性条件下被破坏6然而，若要将此类相互作用作为基因转移方法的替代方案，需要实现重组蛋白的长期但可逆的展示。因此，本文引入了一种低亲和力的单体亲和素（Kd = 10−7 M），从而在抗原呈递细胞内吞后实现蛋白质从表面修饰的卡介苗（BCG）上可逆释放。为验证该概念，我们采用一种单体亲和素嵌合蛋白进行了方法测试，该蛋白对应于源自卵清蛋白（OVA）的替代抗原。7,8结果显示，BCG 细胞表面可快速、简便地修饰单体亲和素融合蛋白，且该结合在细菌生长和存活未见明显改变的情况下，仍具有稳定性和可重复性。此外，我们发现，用单体亲和素与卵清蛋白融合蛋白（AviOVA）修饰的 BCG 所诱导的免疫反应，与通过基因表达相同抗原的 BCG 所诱导的免疫反应相似 体外 和 体内因此，这种可逆地在细菌表面展示目标蛋白的技术可有效替代传统的基因转移方法，并为卡介苗（BCG）的广泛改造及其在疫苗开发中的进一步应用提供了一个平台。

<table><tbody><tr><td>无内毒素 RPMI 1640</td><td>StemCell Technologies&amp;nbsp;</td><td>36750</td><td></td></tr><tr><td>磺基-NHS SS 生物素</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>21328</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记的链霉亲和素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3762</td><td></td></tr><tr><td>藻红蛋白（PE）标记的 I-A&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt;-OVA&lt;sub&gt;323-339&lt;/sub&gt; 四聚体&amp;nbsp;</td><td>MBL International&amp;nbsp;</td><td>TS-M710-1</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>TALON 聚组氨酸标签纯化树脂&amp;nbsp;</td><td>Clontech</td><td>635501</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor (AF) 647 标记的大鼠抗小鼠 CD4 抗体</td><td>BD Bioscience&amp;nbsp;</td><td>557681</td><td></td></tr><tr><td>AF647 标记的大鼠抗小鼠 IFN-γ 抗体</td><td>BD Bioscience&amp;nbsp;</td><td>557735</td><td></td></tr><tr><td>AF647 标记的大鼠抗小鼠 I-A/I-E 抗体</td><td>BD Bioscience&amp;nbsp;</td><td>562367</td><td></td></tr><tr><td>PeCy7 标记的大鼠抗小鼠 CD4 抗体</td><td>BD Bioscience&amp;nbsp;</td><td>552775</td><td></td></tr><tr><td>PE 标记的大鼠抗小鼠 CD8 抗体</td><td>BD Bioscience&amp;nbsp;</td><td>561095</td><td></td></tr><tr><td>AF 647 标记的大鼠抗小鼠 H-2k&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt;</td><td>BD Bioscience</td><td>562832</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记的山羊抗兔抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>31635</td><td></td></tr><tr><td>AF 647 标记的大鼠抗小鼠 CD4 抗体</td><td>BD Bioscience&amp;nbsp;</td><td>557681</td><td></td></tr><tr><td>超小金标山羊抗兔 IgG</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>25100</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 肉汤</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>B11886</td><td></td></tr><tr><td>吐温 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 小鼠巨噬细胞系</td><td>美国模式培养物集存库</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pDEST17 质粒&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11803012</td><td></td></tr><tr><td>pUC57-OVA 质粒&amp;nbsp;</td><td>GenScript</td><td>SD1176</td><td></td></tr><tr><td>BP Clonase&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791043</td><td></td></tr><tr><td>pDONR221 质粒</td><td>Invitrogen</td><td>12536017</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 柱&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 蛋白浓缩器&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>88527</td><td></td></tr><tr><td>Flurosave</td><td>Calbiochem-Novabiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan II 正置荧光显微镜</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD 数码相机&amp;nbsp;</td><td>Retiga EX, QImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai G2 200kV 透射电子显微镜&amp;nbsp;</td><td>FEI Company</td><td>G2 200Kv&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>70&amp;mu;m Falcon 细胞筛&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>87712</td><td></td></tr><tr><td>EasyStep 小鼠生物素阳性选择试剂盒&amp;nbsp;</td><td>StemCell</td><td>18556</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的 Ter119/红系细胞抗体</td><td>BioLegend</td><td>116203</td><td></td></tr><tr><td>布雷菲德菌素 A</td><td>BD Pharmingen</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Glo 荧光素酶检测试剂系统</td><td>Promega</td><td>e2620</td><td></td></tr><tr><td>Turner Biosystem 发光仪&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>TD-20/20</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM UC6 超薄切片机</td><td>&amp;nbsp;Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Novalyphe NL 500 冷冻干燥机</td><td>Savant Instruments</td><td>&amp;nbsp;NL 50</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton 硼硅酸盐玻璃小瓶</td><td>Wheaton</td><td>&amp;nbsp;VWR 66011-675</td><td></td></tr></tbody></table>

利用亲和素-生物素系统通过非遗传性表面修饰在卡介苗（mycobacterium bovis bcg）疫苗中表达外源性抗原

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

结核病（TB）是一种严重的传染病，目前唯一可用的疫苗——牛分枝杆菌卡介苗（M. bovis bacillus Calmette-Guérin, BCG）——在预防儿童重症结核性脑膜炎和某些类型的播散性结核病方面安全且有效，但无法预防肺结核，而肺结核是该病最常见的一种形式。当前改善卡介苗的有前景策略主要依赖于将编码免疫优势结核分枝杆菌（M. tuberculosis, Mtb）特异性抗原的基因导入卡介苗，和/或补充编码可激活抗原呈递细胞的辅助因子的基因。然而，这些方法的主要局限性包括转化效率低、稳定性差，以及表达载体安全性水平不确定。在本研究中，我们提出了一种改进疫苗的替代策略，即通过在细菌表面直接修饰外源目的蛋白来实现卡介苗的功能增强，而非使用编码相应基因的质粒进行遗传转化。首先，在标准的大肠杆菌（E. coli）表达系统中表达与单体亲和素融合的目的蛋白，然后将其用于修饰经生物素化处理的卡介苗表面。利用表面修饰了替代抗原卵清蛋白的卡介苗进行动物实验的结果表明，这种修饰后的细菌具有完全的免疫原性，并能够诱导特异性的T细胞免疫应答。综上所述，本文提供的数据有力支持了一种重塑现有卡介苗疫苗的全新且高效的方法，该方法取代了传统上依赖外源核酸补体化的繁琐技术路径。

采用上述通用实验步骤，检测了BCG表面生物素化及偶联替代抗原OVA的可行性，随后评估了修饰后BCG的免疫原性。 体内细菌表面可轻松用生物素标记，从而快速展示亲和素嵌合抗原，且未检测到细菌表型发生任何改变。所获得的修饰型BCG可被抗原呈递细胞高效摄取，并能在小鼠中诱导产生OVA特异性免疫反应。
单体亲和素融合质粒及蛋白的制备 
表达质粒p17-Avi经构建后可兼容Gateway技术，用于制备单体亲和素融合蛋白。将OVA克隆至p17-Avi中并进行表达 E. coli，然后纯化并复性 如上所述（图1).
生物素可高效结合至细菌表面，且不影响细菌的生长或存活</stron...

介绍了一种在细菌表面快速展示抗原的新技术，该技术涉及表面生物素化，随后使目标蛋白与单体亲和素融合后与细菌结合。通过在卡介苗（BCG）表面加载选定的抗原，可有效增强其免疫原性，表明表面修饰有望替代传统的基因工程方法。

利用亲和素-生物素系统通过非遗传性表面修饰在卡介苗（Mycobacterium bovis BCG）疫苗中表达外源性抗原

结核病（TB）是一种严重的传染病，目前唯一可用的疫苗是牛分枝杆菌卡介苗（BCG），该疫苗对……安全且有效

本实验的总体目标是利用重组蛋白对分枝杆菌进行表面修饰，从而在其表面表达外源蛋白，以此作为传统基于遗传学方法的替代策略。这些方法有助于回答分枝杆菌学领域的重要研究问题，特别是在医院相关感染机制和疫苗开发方面。该技术可用于筛选潜在的干扰因子或抗原候选分子。与繁琐且耗时的传统基因检测方法相比，该方法具有快速、简便的优点。本实验操作将由本实验室研究助理 Amina Talal 进行演示。本方案的这一部分首先将 P17 Aviden OVA 质粒转化至大肠杆菌 BL21 中。为此，用IPTG诱导250毫升BL21大肠杆菌培养物，在37°C下孵育3小时。3小时后，通过离心收集诱导后的BL21菌体并弃去上清液，裂解细菌以溶解包涵体。随后将菌体沉淀重悬于10毫升裂解缓冲液中，室温裂解15分钟。然后将样品置于室温下，使用旋转仪进行振荡孵育，并过夜静置。次日早晨，将混合物离心半小时。随后收集含有可溶性包涵体的上清液。接下来使用镍柱NTA纯化Aviden OVA蛋白。首先，用裂解缓冲液将上清液按1:2比例稀释，并估算体积。然后，每250毫升稀释后的上清液准备含有4毫升镍NTA树脂的层析柱，将稀释后的样品上样至柱中。接下来，每次使用 10 毫升 pH 为 7 的裂解缓冲液，重复洗涤柱子三次。为收集重组蛋白，用含有咪唑的裂解缓冲液洗涤柱子，并收集洗脱液。如果您的重组蛋白不含包涵体，则以下步骤适用于我们实验室中的许多蛋白。首先，将复性溶液的 pH 值调节至比目标蛋白的等电点高或低一个单位。然后，缓慢涡旋并将蛋白在复性溶液中稀释 1 至 10 倍。随后将蛋白在室温下置于磁力搅拌器上孵育 30 分钟，以完成复性过程。接下来，使用蛋白质浓缩器将复性后的蛋白质脱盐并置换缓冲液至 PBS 中。离心浓缩柱后，将可溶性蛋白质分装并储存在 20 摄氏度条件下。由于 BCG 属于二级病原体，操作时须在生物安全柜中进行，并穿戴个人防护装备。为了对BCG细胞表面进行生物素标记，首先需在摇床平台上将细胞培养至适当的密度。收集约十亿个细胞，并使用500微升冰浴、无内毒素的PBST缓冲液洗涤三次。然后离心沉淀细胞，并将其重悬于无菌、无内毒素的PBS缓冲液中。接下来，用无菌过滤水配制新鲜的10毫摩尔磺基-NHSSS生物素溶液。然后将细菌与含有0.5毫摩尔磺基-NHSSS生物素的1毫升培养液混合，于室温孵育30分钟。随后，用500微升预冷的PBST将已标记的细菌洗涤三次，方法同前，以去除未反应的试剂。然后，将菌体沉淀重悬于1毫升PBST中。为评估生物素化效率，取1亿个生物素化的BCG菌体，加入25微升链霉亲和素-FITC进行染色。然后，将染色的细菌在甲醛中短暂孵育，再通过流式细胞术检测生物素化水平。在评估生物素化的分枝杆菌的生长和存活情况后，继续进行链霉亲和素融合蛋白与细菌的结合。首先，将5亿个生物素化的卡介苗（BCG）与链霉亲和素融合蛋白混合，使蛋白终浓度为每毫升10微克。在摇床上室温孵育反应1小时。随后，用500 µL冰冻PBST洗涤细菌3次。然后在室温下用兔抗Aviden抗体孵育细菌20分钟。孵育20分钟后，用500 µL预冷的PBST洗涤一次。随后，用FITC标记的羊抗兔IgG抗体对细菌进行染色。接着，使用500 µL预冷的PBST洗涤细菌，然后通过流式细胞术分析细菌，以评估其表面修饰情况。按照所述方案操作后，细胞学结果显示，OVA 与非生物素化细菌的结合水平极低，而与生物素化细菌的结合水平显著。重要的是，在冻干并于室温下储存一个月后，细菌表面的亲和素-OVA 仍保持稳定且可检测。接下来，使用 RAW 细胞和表达 dsRed 的细菌进行吞噬实验。令人欣慰的是，巨噬细胞表型未受到抑制。为了检测载有Aviden OVA的BCG在巨噬细胞内的命运，对贴壁的RAW细胞进行感染，并通过荧光显微镜观察。Aviden OVA不仅存在于细菌表面，还发生脱落并转位至远离细菌的细胞质中。免疫金标记实验显示，Aviden OVA 抗原可从 BCG 表面脱离，穿过吞噬体膜并向胞质溶胶迁移。感染了 Aviden OVA BCG 的巨噬细胞中，Avi OVA 与 IA 分子表现出共定位。这表明 Aviden 融合蛋白能够脱离并转位至抗原呈递区室，进而被加载到 MHC II 分子上。如H2K染色所示，Aviden OVA多肽也与BCG吞噬体内的I类分子共定位。因此，巨噬细胞存在将Avi OVA抗原呈递给CD8阳性T细胞的潜力。观看本视频后，您应能充分理解如何在分枝杆菌中表达蛋白质，以及该生物体在当前遗传操作方法下的难处理性。在该技术之后，我们成功地将含有分枝杆菌抗原的疫苗在六周龄时进行接种。随后我们证明，经修饰的疫苗有望在小鼠模型中引发特异性免疫应答。目前，我们正合作开展研究，以探索该方法在豚鼠模型中的应用。我们提出，可将卡介苗（BCG）与选定的抗原或免疫调节剂联合使用以进行优化。

expression-exogenous-antigens-mycobacterium-bovis-bcg-vaccine-via-non

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

非遗传表面修饰的素-生物素系统在牛分枝杆菌卡介苗中的外源抗原表达

我们介绍一种结核分枝杆菌计数的替代方法...

一种功能性全血检测法，用于测定分枝杆菌的存活能力，使用报告基因标记的卡介苗或结核分枝杆菌（BCG lux/M.Tb lux）

本视频展示了在麻醉小鼠中诱导全身性炎症的过程。注射分枝杆菌抗原-佐剂储库可触发细胞因子释放并引发局部炎症。淋巴管开放，使免疫细胞进入淋巴结并激活T细胞，T细胞释放促炎性细胞因子，导致广泛的炎症反应。...

皮下注射细菌抗原以在小鼠模型中诱导全身性炎症

本视频演示了利用生物发光检测法和菌落形成单位计数法，制备和定量Mycobacterium...

结核分枝杆菌 BCG lux 感染接种物的制备与定量

本视频展示了一种制备可展示多种抗原的外膜囊泡（OMV）疫苗的方法。首先，转染哺乳动物细胞，使其表达并分泌与SpyTag及多聚组氨酸标签融合的病毒抗原。随后，利用镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）亲和层析柱纯化这些抗原。将纯化后的抗原与表面表达SpyCatcher（SC）蛋白的外膜囊泡混合。多个抗原通过其SpyTag（ST）与SpyCatcher发生共价结合，从而在OMV表面展示抗原，形成多价疫苗。...

生成多价展示外膜囊泡疫苗

该视频展示了一种在牛分枝杆菌卡介苗（Mycobacterium bovis...

一种用于在Mycobacterium bovis BCG上呈递目标抗原的亲和素-生物素偶联技术

长期培养的γ干扰素酶联免疫斑点试验用于评估中枢记忆反应，并与保护性抗分枝杆菌疫苗反应相关。在该试验中，外周血单个核细胞经分枝杆菌抗原和白细胞介素-2刺激培养14天，以促进中枢记忆T细胞的分化与扩增。...

应用长期培养的干扰素-γ酶联免疫斑点试验评估牛效应与记忆T细胞应答

本文详细阐述了在小鼠模型中通过鼻内和皮下接种卡介苗（BCG）来比较其保护效果及肺部免疫反应的方法学。我们的结果表明肺部疫苗接种具有优势，并提示IL-17介导的免疫反应在疫苗诱导的保护作用中发挥一定作用。...

小鼠皮下与鼻内接种卡介苗后的保护效力及肺部免疫应答

本方案描述了外膜囊泡的生物工程化，以构建“即插即用”型疫苗平台，包括其制备、纯化、生物偶联及表征。...

基于展示SARS-CoV-2受体结合域的外膜囊泡的“即插即用”纳米颗粒疫苗平台

本方案详细描述了从无菌培养的分枝杆菌中富集天然的分枝杆菌胞外囊泡（mEVs）的方法 Mycobacterium smegmatis （耻垢分枝杆菌，Msm）以及如何设计并富集含有mCherry（一种红色荧光报告蛋白）的重组MsmEVs。最后，通过富集含有EsxA蛋白的MsmEVs验证了这一新方法。...

分枝杆菌天然及重组细胞外囊泡的富集

本文介绍一种替代方案，通过使用免疫原性表位髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）35-55 悬浮于含灭活的副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp.

Mycobacterium paratuberculosis 在实验性自身免疫性脑脊髓炎中增强自身抗原免疫原性的佐剂活性

菌落形成单位（CFU）的测定是定量细菌（包括需要数周时间才能形成可见菌落的Mycobacterium...

用于评估结核病疫苗效力的微菌落形成单位检测法

了解利用链霉亲和素-生物素系统对牛分枝杆菌卡介苗进行非遗传表面修饰以表达外源抗原的方法。该技术为传统基因方法提供了快速替代方案，有助于分枝杆菌学和疫苗开发研究。

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