增殖和静止人成纤维细胞的全基因组转录衰变率的测定
2018年1月2日
我们描述了一种生成增殖和静止的主要人真皮成纤维细胞的协议, 监测转录衰变率, 并识别差异腐烂的基因。
该程序的总体目标是监测增殖和静止成纤维细胞的转录本衰变速率。这种方法可以帮助回答分子生物学领域的关键问题，例如基因表达的变化是否由转录本衰变率的变化引起。这种技术的主要优点是它提供有关转录本衰减率的信息，而不仅仅是转录本丰度。
要开始该方案，请建立成纤维细胞的增殖和静止培养物。增殖的成纤维细胞应定期进行胰蛋白酶消化。通过让平板与常规培养基更换达到汇合，可以建立静态培养物。
将 ActD 150 μL 添加到预热的 10 mL 培养基中，用于所有生物复制细胞培养板。添加浓度为 15 μg/mL 培养基的 ActD。将溶液充分混合。
吸出旧培养基，并向细胞中加入含有 ActD 的培养基。要收集零时间点样品，请轻轻吸出 ActD 培养基，并将 5 到 10 毫升预热的 PBS 移液到 100 毫米板上，5 毫升溶液移液到 100 毫米板上，2 毫升溶液移液到六孔板的孔中，1 毫升移液到 12 孔板的孔中。轻轻吸出 PBS。
然后将苯酚-异硫氰酸酯溶液直接加入到组织培养板中。将苯酚 - 异硫氰酸酯溶液细胞混合物上下移液数次，以制成均匀的混合物。使用前面描述的方法，在经过适当的时间后收集每个时间点。
将样品在室温下孵育 5 分钟，以确保 RNA 蛋白复合物完全溶解。接下来介绍可以使用所用方法检测的加标对照转录本。将这些对照品以已知的数量和浓度引入每个样品中。
使用移液管将异硫氰酸苯胍溶液混合物转移到 2.0 毫升微量离心管中。然后，每使用一毫升异硫氰酸苯胍溶液，向异硫氰酸苯胍溶液混合物中加入 0.2 毫升氯仿。用力摇晃微量离心管 15 秒，然后孵育氯仿苯胍异硫氰酸酯。
孵育后，将样品在 4 摄氏度下以 12， 000 倍 g 离心 20 分钟。样品应分为三层。使用微量移液器将水层转移到新的 2.0 毫升微量离心管中，并在此过程中注意不要干扰中间相。
丢弃中间级分和有机级分。然后向水性组分中加入等体积的 2-丙醇，并将试管倒置 10 次。每 20 μL 样品最多添加 1 μL 20 mg/mL 糖原水溶液，尤其是在预计产量较低的情况下。
将样品在室温下孵育 10 分钟。孵育后，离心样品。确保在离心结束时，RNA 已沉淀，在试管底部形成沉淀。
用移液管去除并丢弃上清液，特别注意不要干扰白色 RNA 沉淀。每 1 毫升苯胍异硫氰酸酯溶液试剂中加入 1 毫升 75% 乙醇洗涤沉淀。将样品以 12， 000 倍 g 离心 10 分钟。
去除大部分上清液后，使用移液管去除尽可能多的乙醇，但不要干扰沉淀。旋转样品以沉淀所有多余的乙醇。在此步骤中，RNA 沉淀不太紧凑，并且倾向于移动。
离心后，从试管中去除所有多余的乙醇，不要干扰沉淀。让 RNA 沉淀风干 5 分钟。向 RNA 沉淀中加入 50 μL 无核酸酶的水，并将沉淀重悬于无核酸酶的水中。
处理 1 微升 Deanase 的样品以去除 DNA，然后灭活 Deanase 和阳离子。将 RNA 样品储存在零下 80 摄氏度的 2.0 毫升微量离心管中。定量 RNA 并使用分光光度计检查 RNA 的纯度。
检查纯度后，用 1% 琼脂糖凝胶分析 RNA，以观察降解的延伸。代表 18S 和 28S rRNA 的两个清晰条带应该清晰可见。如果这些条带不可见，则 RNA 可能会降解。
接下来，使用 Real-Time qPCR 监测收集的 RNA 等分试样与加标内标相比的转录本丰度。也可以使用微阵列、RNA 测序或 Northern 印迹。随时间变化的荧光强度与基因表达相对应。
当成纤维细胞受到接触抑制时，编码胶原蛋白 3A1 的转录本（在伤口愈合过程中产生沉积的细胞外基质的非常重要的基因）变得更加稳定并且不会迅速衰减。不要忘记，使用苯酚可能非常危险，重要的是不要让它接触您的皮肤。观看此视频后，您应该对如何监测增殖和静止成纤维细胞的转录本衰变速率有很好的了解。
转录本衰变率的变化可能是基因三角测量的重要机制。
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概述
本文描述了一种用于生成增殖和静止的人类皮肤成纤维细胞的协议。它专注于监测转录本衰减速率和识别差异性衰减基因，为基因表达动态提供见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 分子生物学
- 细胞生物学
- 基因表达
背景
- 理解转录本衰减速率对于阐明基因表达调控至关重要。
- 成纤维细胞作为研究人类组织细胞过程的模型。
- 成纤维细胞的增殖和静止状态可能影响基因表达结果。
- 该协议旨在区分转录本衰减与单纯转录本丰度的影响。
研究目的
- 监测不同状态的成纤维细胞培养物中的转录本衰减速率。
- 调查基因表达变化如何与转录本衰减速率相关。
- 提供一种研究成纤维细胞基因表达动态的可靠方法。
使用的方法
- 建立增殖和静止的成纤维细胞培养物。
- 定期用胰蛋白酶处理增殖的成纤维细胞。
- 基于融合度建立静止培养物并更换培养基。
- 通过实验协议监测转录本衰减速率。
主要结果
- 识别增殖和静止状态之间差异性衰减的基因。
- 洞察转录本衰减与基因表达变化之间的关系。
- 展示测量转录本衰减速率的优势。
- 提供详细协议以供未来分子生物学研究使用。
结论
- 该协议有效地区分转录本丰度和衰减速率。
- 研究结果有助于深入理解基因表达调控。
- 该方法可应用于分子和细胞生物学的各种研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Genome-wide measurement of transcript decay rates in proliferating and quiescent human fibroblasts enables biopharma teams to distinguish regulatory mechanisms driving gene expression changes beyond transcriptional control. This approach supports mechanistic de-risking and enhances predictive confidence in target validation by clarifying whether observed gene expression differences are due to altered mRNA stability or transcriptional activity. Integrating transcript decay profiling at early discovery inflection points informs portfolio triage and prioritization of disease-relevant targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene expression regulation by separating transcriptional and post-transcriptional effects.
- Supports functional target validation by identifying genes with altered mRNA stability in disease-relevant states.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying the contribution of transcript decay to phenotype.
- Improves predictive confidence for advancing targets with robust regulatory profiles.
Screening & Assay Development
- Establishes validated biological systems for downstream transcriptomic and functional assays.
- Provides quantitative decay rate measurements for assay standardization and reproducibility.
- Enables screening of compounds or genetic perturbations affecting mRNA stability.
- Supports platform reuse for comparative studies across cell states or conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns transcript decay signatures with disease-relevant cellular states for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by tracking regulatory mechanisms.
- De-risks advancement decisions by confirming mechanistic relevance of candidate targets.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, providing a reusable capability for transcriptomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating transcript decay as a regulatory variable.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative decay rate outputs for assay development.
- Analytics: Enables statistical comparison of decay rates between proliferating and quiescent states.
- Translational Research: Connects decay rate changes to disease-relevant cellular phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized workflow adaptable to diverse cell models and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies.
- Operational Value: Provides standardized, reproducible, and scalable transcript decay measurements.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying regulatory mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with validated regulatory profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, RNA extraction, and quantitative transcript analysis.
- Needs access to instrumentation for qPCR, microarray, or RNA sequencing.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample handling and time-point collection.
- Adaptable to various cell types but may require optimization for different biological systems.
- Limited by Actinomycin D toxicity, restricting the time course for decay measurement.
