利用PACE对植物细胞壁甘露聚糖的结构表征

本实验的总体目标是表征植物细胞壁多糖。该方法有助于我们回答植物细胞壁生物学领域中的关键问题，包括葡甘露聚糖的结构与含量。该技术的主要优势在于无需特殊培训或昂贵设备。

通常，初次使用该方法的研究人员在凝胶结果的解读方面会遇到困难，因此包含并理解文中所述的所有对照至关重要。酒精不溶性残渣（AIR）需按照文本方案中的描述，从收获的植物材料中预先制备。取六毫克 AIR 置于 15 毫升离心管中，并加入水，使其最终浓度为每毫升含两毫克 AIR。

涡旋以获得均匀的悬浮液。将500微克分装至微量离心管中。在30°C下使用真空离心机干燥分装样品，过夜。

用一摩尔氢氧化钠在室温下处理 AIR，包括用于无酶对照的一份等分试样，处理一小时。一小时后，向每根试管中加入 200 微升水和 20 微升一摩尔盐酸，以中和氢氧化钠。取一微升溶液点在 pH 试纸指示条上，检测 pH 是否约为 6 至 7。

向每根试管中加入50微升1摩尔的乙酸铵缓冲液（pH 6.0），并加水至总体积为500微升。开始此操作时，向AIR等分试样和缓冲液中加入预定量的甘露聚糖酶。同时设置适当的阴性对照以及阳性对照。

涡旋混匀，然后短暂离心，使反应混合物聚集在管底。在37摄氏度下轻轻振荡孵育过夜。次日，于95摄氏度孵育20分钟以终止反应。

以最大速度离心10分钟。保留上清液，并将每个沉淀物重新悬浮于250 µL水中。再次离心，并保留上清液。

合并两份上清液，并在30摄氏度下用真空离心机干燥约三小时。在进行衍生化操作前，按照文本方案中的描述配制所需的试剂。将0.2摩尔的ANTS储备液加热至60摄氏度，以彻底溶解其中的固体。

向每个样品中加入5 µL ANTS、5 µL 2-吡啶硼烷和10 µL 衍生化缓冲液。短暂离心以收集至管底，充分涡旋混匀，然后再短暂离心一次。将样品在37 °C避光条件下孵育过夜。

次日，在30摄氏度下使用真空离心浓缩仪干燥样品，约两小时。将每个样品重悬于寡糖标准品和100微升3摩尔尿素中。避光保存于-20摄氏度，直至使用时取出。

凝胶灌注设备的组装取决于具体品牌。本演示中所用设备中，一块凝胶相当于50毫升。在50毫升离心管中，混合20.2毫升水、5毫升10x PACE缓冲液、24.6毫升40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺、200微升APS以及20微升TEMED。

轻轻倒置以混匀，注意避免引入气泡。使用血清学移液管或其他大容量移液管将分离胶倒入玻璃板中，至距离玻璃板顶部约四厘米处。小心地在凝胶上层覆盖异丙醇。

让凝胶聚合20至30分钟。倒去上层液体。用吸水纸吸干残留的多余液体。

接下来，制备浓缩胶。在15毫升离心管中，加入6.8毫升水、1毫升10× PACE缓冲液、2.8毫升丙烯酰胺/双丙烯酰胺、80微升APS和8微升TEMED，颠倒混匀后，覆盖于已聚合的分离胶上方。

轻轻插入梳子，避免梳齿下方滞留气泡。待凝胶聚合后，用湿润的纸巾包裹，再用塑料膜包好，于4°C保存备用。为便于追踪加样顺序，并在拔出梳子后识别加样孔位置，可使用永久性记号笔在玻璃板上标记加样孔的位置。

取下梳子。用一倍浓度的 PACE 缓冲液填充孔。使用 10 微升微量注射器，向孔中加入 2 微升的标准品和样品。

避免使用最外侧的泳道，因为这些泳道通常电泳效果较差，且样品之间应留出一个空泳道。组装好电泳装置的上层室，将凝胶放入含有1× PACE缓冲液的预冷电泳槽中，并用1× PACE缓冲液充满上层室。

接通电源，以 200 伏电压电泳 30 分钟。30 分钟后，将电压升至 1,000 伏，持续运行 1 小时 40 分钟。电泳过程中需避光保护凝胶。

首先用湿润的无尘布擦拭凝胶成像系统，确保其无灰尘。从 PACE 电泳槽中取出凝胶，在凝胶仍位于玻璃板之间时快速观察，以确定染料前沿是否仍在凝胶上。使用楔形工具打开凝胶，当凝胶仍附着在一块玻璃板上时，若染料前沿仍在凝胶上，则使用披萨切刀切除浓缩胶以及凝胶底部。

在透射仪表面加入约五毫升水，然后将凝胶直接转移至透射仪上。使用软件将滤光片设置为 UV 605，并打开长波紫外透射仪。在不同曝光时间下拍摄多张图像，每次拍摄之间务必关闭紫外光，以避免荧光降解。

确保至少有两张图像中没有饱和条带。将文件保存为高分辨率的 TIFF 图像。下图显示了一个典型的PACE细胞壁甘露聚糖含量测定的凝胶结果。

泳道一、二和三分别显示了浓度为5、10和50皮摩尔的市售寡糖分子量标记物。泳道四显示了魔芋葡甘露聚糖经甘露聚糖酶消化的结果，该泳道作为酶消化及在酶和缓冲盐存在下衍生化反应的阳性对照。泳道五显示了野生型拟南芥茎的PACE指纹图谱。

第6泳道显示了缺乏主要茎部甘露聚糖合酶的拟南芥植株茎部的PACE指纹图谱。与野生型相比，甘露聚糖含量极少，这由所有甘露聚糖酶衍生的寡糖条带强度降低可见。第10泳道显示了含有半乳葡甘露聚糖的松木的PACE指纹图谱，其释放的寡糖图谱明显不同于拟南芥。

第7、8、9和11泳道为不同的阴性对照，显示出由星号标记的非特异性条带，这些条带应在分析中排除。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用PACE技术分析甘露聚糖的结构。一旦掌握，该技术可应用于其他多糖的研究，只需更换不同的糖苷水解酶即可。

除了拟南芥外，我们还成功地将该技术应用于许多其他植物物种，以及其他非植物物种，如酵母甘露聚糖。