Name: 植物甘露聚糖细胞壁多糖的结构表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 学习使用PACE凝胶电泳技术对植物细胞壁甘露聚糖多糖进行结构表征和定量分析。该方法无需昂贵设备，适用于研究拟南芥、松木等多种植物材料的葡甘露聚糖组成。

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PACE 方法由英国剑桥大学 Dupree 课题组的多位成员经过多年发展和优化，我们感谢他们所有的贡献。本工作由美国能源部科学办公室、生物与环境研究办公室资助，作为能源部联合生物能源研究所（http://www.jbei.org）项目的一部分，资助合同号为 Lawrence Berkeley 国家实验室与美国能源部之间的 DE-AC02-05CH11231。我们还感谢 Thea Pick 和 Vy Ngo 在准备 csla9 样品过程中提供的帮助。

1. 植物材料的采集
<ol>
	<li>采集新鲜植物材料（约 20 mg），立即浸入 96% (v/v) 乙醇中，并在 70 °C 下孵育 30 分钟；此步骤可使存在的任何细胞壁降解酶失活。对于干燥材料，从步骤 2 开始操作。 
	警告：乙醇易燃。 
	注：单根茎或莲座叶即可提供足够的分析材料。然而，若将较大量的组织混合后进行分析，可减少操作误差，因为此类样本更易于准确称量和操作。</li>
	<li>仔细记录组织类型和发育阶段，因为多糖结构随这两者而变化。例如，对于本实验所用的拟南芥（Arabidopsis thaliana），应根据 Boyes et al.15 的方法确定其发育阶段。 
	注：在本方案中，我们使用了花序茎的下半部分，即第一个角果已完全伸长但尚未变黄的部位。</li>
</ol>
2. 醇不溶残渣（AIR）的制备
<ol>
	<li>按照 Mortimer et al.9 或其他类似方法制备 AIR，以获得不含可溶性糖（如蔗糖和淀粉）的粉末。</li>
</ol>
3. AIR 的分装与预处理
注意：每个样品所需的 AIR 精确用量取决于（a）材料中目标多糖的丰度，以及（b）GH 水解后释放的寡糖的平均大小。该方法会在每条寡糖的还原端添加一个荧光分子，因此寡糖的数量决定了实验的灵敏度。作为参考，对于经 GH5/GH26 酶消化的拟南芥茎中的葡甘露聚糖，建议使用 500 µg 样品。11，而对于经GH11消化的拟南芥茎中的木聚糖，建议使用100 µg，如Mortimer的研究所示3.
<ol>
	<li>称取 AIR（10–15 mg）至 15 mL 离心管中，加入 H2O 至终浓度为 2 mg/mL。涡旋振荡以形成均匀悬浮液。若难以混匀，可使用玻璃匀浆器辅助此过程。</li>
	<li>将样品分装 500 µg 至微量离心管中，使用真空离心浓缩仪（见材料表）在 30 °C 下干燥过夜。</li>
	<li>用 1 M NaOH（20 µL）在室温下预处理 AIR 1 小时；此步骤可使多糖去乙酰化并使纤维素微纤丝溶胀，破坏生物质结构，从而允许糖苷水解酶（GH）进入。 
	注意：若使用纯化的多糖，则可省略此步骤。注意——强酸/强碱操作需谨慎。
	<ol>
		<li>设置一份不加酶的 AIR 对照样品（除省略步骤 4.1 外，其余处理与其他样品相同）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入 200 µL H2O 和 20 µL 1 M HCl 进行中和。取 1 µL 液滴于 pH 试纸，检测 pH 是否约为 6–7。</li>
	<li>加入 50 µL 1 M 醋酸铵缓冲液（pH 6.0，或根据研究所用 GH 的适宜 pH 选择相应缓冲液）以及 H2O，使总体积达到 500 µL。 
	注意：选用醋酸铵是因为其在干燥过程中可升华，不会向样品中引入额外盐分。过量盐分可能导致 PACE 凝胶电泳条带形态不佳和分辨率下降。</li>
</ol>
4. 使用糖基水解酶（GHs）对 AIR 进行水解
注意：如讨论部分所述，糖苷水解酶（GHs）的纯度至关重要。必须使用异源表达并经亲和纯化的酶。每批从生产商处收到的酶，均需用已知量的底物进行水解反应，以验证其活性。例如， 500 µg AIR) 与不同浓度的GH孵育过夜（例如， 0.5、1、2、5、10、15、20 µL）（3 单位/µL）。当GH过量时，PACE指纹图谱将完全相同。为获得可重复的结果，需使用过量的酶，以确保水解反应接近终点。
<ol>
	<li>将预定量的甘露聚糖酶（GH5 和 GH2611，见上文）加入步骤 3.5 所得缓冲液中的 AIR 等分试样中，同时设置一个阳性对照（30 µg 魔芋葡甘露聚糖）和一个无 AIR 的阴性对照（将酶混合物加入空管中）。涡旋混匀，然后短暂离心，使反应混合物收集至管底。</li>
	<li>在 37 °C（或所选 GH 酶的适宜温度）下孵育过夜，同时轻柔振荡（约 100 rpm）。</li>
	<li>在 95 °C 下孵育 20 分钟以终止反应。 
	注意：可使用管盖密封翻盖式微量离心管。
	<ol>
		<li>使用台式微量离心机在最大转速下离心 10 分钟，保留上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将沉淀物重悬于 250 µL H2O 中，按上述条件离心，并保留上清液。</li>
	<li>合并两次所得上清液，在 30 °C 下用真空离心浓缩仪（见材料表）干燥（约 3 小时，或不加热过夜）。</li>
</ol>
5. 寡糖标准品的制备
<ol>
	<li>用 H2O 配制 1 mM 的甘露糖（Man）、甘露二糖（Man2）、甘露三糖（Man3）、甘露四糖（Man4）、甘露五糖（Man5）和甘露六糖（Man6）储备液，均为 β,1-4 连接。分装后于 -20 °C 保存，备用。</li>
	<li>取上述六种糖各 1 µL（标准品 S1）、2 µL（S2）或 5 µL（S3），分别配制成三种不同浓度的 Man1-6 混合溶液。</li>
	<li>在 30 °C 下使用真空离心浓缩仪（见材料表）干燥（约 1 小时）。</li>
</ol>
6. 寡糖的衍生化
<ol>
	<li>在 H2O:乙酸 17:3 溶液中配制 0.2 M ANTS（8-氨基萘-1,3,6-三磺酸）储备液。将储备液加热至 60 °C 以完全溶解固体。避光保存于 -20 °C，可稳定存放 2 至 3 个月。</li>
	<li>在 DMSO 中配制 0.2 M 2-皮考啉硼烷（2-PB）储备液。该物质极易吸湿，因此收到粉末后应立即用 DMSO 溶解。分装后于 -20 °C 保存，可稳定 1 至 2 年。按需解冻分装样品（可在 4 °C 保存 2 周，之后弃去）。</li>
	<li>配制 H2O:乙酸:DMSO 体积比为 17:3:20 的衍生化缓冲液。</li>
	<li>向每个样品中加入 5 µL ANTS、5 µL 2-PB 和 10 µL 衍生化缓冲液。短暂离心以使液体沉降至管底，充分涡旋混匀，再短暂离心一次。反应过程示意图见 图1。</li>
	<li>将样品在 37 °C 避光孵育过夜。</li>
	<li>在 30 °C 下使用真空离心浓缩仪（见材料表）干燥样品（约 2 小时）。</li>
	<li>用 100 µL 3 M 尿素溶液重悬样品和标准品。避光保存于 -20 °C，直至使用。</li>
</ol>
7. PACE 凝胶的制备
注意：凝胶制备装置的组装取决于品牌。此处我们使用一种垂直电泳系统（参见材料表），配备 18 cm × 24 cm 玻璃板和 1.5 mm 间隔垫片。
<ol>
	<li>按照制造商的说明组装凝胶制备装置。</li>
	<li>配制10倍浓度PACE缓冲液（1 M Tris-硼酸盐，pH 8.2）：将121.14 g Tris-Base加入约400 mL H2O中，搅拌至溶解。通过加入固体硼酸（约60 g）调节pH至8.2，然后加水定容至1 L。</li>
	<li>用H2O配制10%（w/v）过硫酸铵（APS）储存液。分装后于-20 °C保存。分装物解冻后置于4 °C保存，2周后弃用。</li>
	<li>配制并灌注分离胶。对于上述设备，1块凝胶体积为50 mL。在50 mL离心管中混合H2O（20.2 mL）、10x PACE缓冲液5 mL、40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1丙烯酰胺:双丙烯酰胺）24.6 mL。（注意：有毒）。
	<ol>
		<li>加入200 µL APS和20 µL N,N,N,N´-四甲基乙二胺（TEMED）。轻轻倒置混匀（避免引入气泡）。使用移液管或大容量移液器将凝胶溶液灌注至玻璃板顶部以下约4 cm处。注意防止气泡滞留在凝胶中。若出现气泡，应暂停灌注，倾斜或轻敲凝胶装置以释放气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在凝胶上层覆盖异丙醇（注意：易燃）或小心地覆盖H2O。静置聚合20–30分钟，然后倾去上层液体。若使用异丙醇，则用H2O洗涤2次。用吸水纸吸去多余液体。</li>
	<li>配制并灌注浓缩胶。在15 mL离心管中混合H2O 6.8 mL、10x PACE缓冲液1 mL、丙烯酰胺/双丙烯酰胺2.8 mL（注意：有毒）、APS 80 µL和TEMED 8 µL。倒置混匀后，覆盖于已聚合的分离胶上方。轻轻插入梳子，避免梳齿下方困住气泡。</li>
	<li>静置聚合（20–30分钟），用湿润的纸巾包裹后再用塑料膜包好，于4 °C保存备用。保存时应保持梳子插入状态。 
	注：PACE凝胶若保持湿润，最多可保存2周（但建议不超过1周为宜）。</li>
</ol>
8. 运行 PACE 凝胶
<ol>
	<li>使用永久性记号笔在玻璃上标记孔位，以帮助记录加样顺序，并在拔出梳子后识别各孔的位置。</li>
	<li>移除梳子。用1x PACE缓冲液填充加样孔。</li>
	<li>使用10 µL微量注射器将2 µL标准品和样品加入孔中。避免使用最外侧的泳道，因其通常会导致样品电泳效果不佳。</li>
	<li>组装凝胶电泳装置的上层室，将凝胶置于含有1x PACE缓冲液的冷却（约10 °C）电泳槽（10 °C）中。用1x PACE缓冲液填充上层室。</li>
	<li>打开电源，以200 V（恒压）电泳30分钟，然后将电压升至1000 V，继续电泳1小时40分钟。电泳过程中需避光保护凝胶。例如， 通过用黑色垃圾袋包裹水箱实现。 
	注意：打开电压约5分钟后检查凝胶，然后在将电压升至1,000 V后5分钟再次检查。如果电源无法维持设定电压，则可能存在缓冲液泄漏。将凝胶从电泳槽中取出，重新组装上层室，并仔细检查所有垫圈的位置。玻璃板上边缘若有较大缺口，可能导致玻璃板与垫圈之间无法形成良好密封。通常可在安装上层室前，向玻璃板缺损处滴加一滴5%（w/v）熔化的琼脂糖，暂时解决此问题。</li>
</ol>
9. PACE 凝胶的可视化
注意：使用配备长波紫外灯的凝胶成像系统，以及适用于荧光染料的相机发射滤光片，此处为530 nm。或者，也可使用激光扫描仪，如Goubet2所述。 
<ol>
	<li>使用湿润的无尘纸巾擦拭凝胶成像系统，确保其无灰尘。</li>
	<li>从 PACE 电泳槽中取出凝胶，并在凝胶仍处于玻璃板之间时短暂观察&#60;80 毫秒）以确定染料前沿是否仍在凝胶上。</li>
	<li>使用楔形工具打开凝胶，当凝胶仍附着在一块玻璃板上时，用切片刀切除浓缩胶，以及如果染料前沿仍在凝胶上，则同时切除凝胶底部。</li>
	<li>加入约 5 mL H2将凝胶直接转移至透射仪表面，然后将透射仪滤光片设置为UV 605，并开启长波紫外透射仪（参见 材料表) 使用该软件。 
	注意：此处使用的 ANTS 荧光染料的激发/发射波长为 353/520 nm。</li>
	<li>在不同曝光时间下拍摄多张图像（例如， 100 毫秒至 10 秒）。每次成像之间需点击紫外灯按钮关闭紫外光，以避免荧光信号降解。确保至少有 2 张图像中无饱和条带（凝胶成像软件会对此进行提示）。</li>
	<li>将文件保存为高分辨率的 .tif 图像。 
	注意：可使用凝胶成像系统配套的软件，或免费的图像分析软件（如 ImageJ，https://imagej.nih.gov/ij/）进行图像分析。参见 结果 定量分析讨论部分</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

PACE 是一种用于表征多糖结构的简便方法。该方法可应用于任何已知具有明确活性的糖基水解酶（GHs）作用的多糖，文献中已有大量实例1,6,9,11。此外，通过使用定义明确的多糖底物和受体，PACE 也已被用于新型糖基水解酶12,13,18以及糖基转移酶9的表征。
可重复且可解释的结果依赖于三个关键步骤。首先，所使用的糖苷水解酶（GH）应不含污染性活性。这一点最好通过仅使用异源表达并经亲和纯化的酶来实现。其次，对于大多数实验而言，底物的酶促水解应进行完全。这将确保相同的生物质在使用相同的糖苷水解酶时，在每次实验中产生相同的指纹图谱。最后，衍生化反应中应有过量的荧光标记物。这可确保几乎100%的还原性末端被标记。上述措施将带来高重复性的实验结果，并获得定量的数据。
凝胶和试剂的质量对于确保数据的可重复性至关重要。缓冲液质量差（尤其是pH值不正确）、凝胶中存在气泡以及样品中盐分过多，均可能影响寡糖的分辨率和保留因子。然而，通过在实验方案和结果部分中所述的推荐对照，可实现问题排查。
PACE 受限于其对寡糖的鉴定能力。对于某些实验而言，仅需获得简单的图谱指纹即可。然而，若要准确定量 AIR 样品中葡甘露聚糖的含量，则必须明确所有释放出的寡糖的结构，这一过程较为耗时。相比之下，对于木聚糖等结构较简单的多糖，分析则更为直接。3由于市面上可购得的寡糖标准品较少，因此可能并非总能或有必要鉴定所有条带。在此情况下，PACE 可为质谱分析提供非常有益的补充数据即， MALDI-CID9 或 ESI-MS7，以及核磁共振（NMR）6）。对于这些方法，通常有助于进行大规模制备，通过尺寸排阻色谱进行分离，然后在质谱或核磁共振分析之前，使用PACE对每个组分进行分析。尽管已有报道表明可通过切取条带并利用MALDI-CID进行鉴定，但在实际操作中我们发现该方法成功率较低（可能是由于标记的寡糖在暴露于紫外光时与丙烯酰胺凝胶发生相互作用所致）。
PACE 的另一个主要局限性是通量。为了获得具有适当对照、质量良好且可解释的凝胶结果，每块凝胶通常只能容纳约 10 个实验样本，研究人员每天大约可运行 4 块 PACE 凝胶。最近已开发出一种基于毛细管电泳（CE）的 PACE 方法19，该方法允许在 96 孔板中制备样品。该技术已成功用于表征糖基转移酶活性及多糖结构6,19，但其需要使用毛细管电泳仪，而该设备的购置和维护成本较高。

凝胶电泳多糖分析（PACE）是一种用于多糖详细表征的方法1,2,3。植物细胞壁多糖 notoriously 难以分析，大多数方法需要昂贵的设备、熟练的操作人员以及大量纯化的材料。本文中，我们描述了一种简单的方法，可获得详细的多糖结构信息，包括结构异构体的分辨。
了解植物细胞壁多糖结构对于研究植物细胞壁生物合成或植物细胞壁在植物发育中作用的研究人员至关重要。然而，近年来，由于人们关注将植物生物质（本质上是细胞壁）作为原料用于生产生物燃料和生物化学品，植物细胞壁组成引起了更广泛研究人员的兴趣4。例如，要实现对此类材料的有效酶解糖化，就需要深入理解多糖结构，以便筛选出最优的酶组合5。
与替代方法相比，PACE 具有多种优势，使其成为快速分析复杂糖链结构的理想选择。首先，与溶液态核磁共振（NMR）不同，PACE 无需对目标多糖进行纯化6。其次，PACE 能够分辨结构异构体，而质谱（MS，例如基质辅助激光解吸/电离（MALDI）和电喷雾电离（ESI））则无法做到，液相色谱（LC）在此方面也常面临挑战7。第三，PACE 灵敏度极高，可达低皮摩尔级分辨率，优于薄层色谱（TLC）或纸色谱。最后，与质谱、核磁共振和液相色谱不同，PACE 无需昂贵的设备或专业知识。
PACE 方法依赖于糖基水解酶（GH）对多糖混合物中特定糖苷键的特异性。当 GH 酶作用于多糖链时，会暴露出一个还原性末端，该末端可被化学衍生化，此处使用荧光标记。因此，样品中未水解的部分无法被该方法检测到。标记后的寡糖随后通过电泳在大尺寸丙烯酰胺凝胶中进行分离。该方法可对结构非常相似的分子实现优异的分辨，例如，三糖 Glc-Man-Man 和 Glc-Man-Glc 具有不同的 Rf 值。
PACE 已被广泛用于表征不同植物物种中的木聚糖结构8，鉴定拟南芥中的糖基转移酶突变体6,9,10,11，开展糖基转移酶活性检测9，以及表征新型糖苷水解酶（GH）活性12,13。我们最近还利用该方法表征了酵母细胞壁甘露聚糖（Mahboubi 和 Mortimer，正在准备中）。本文中，我们基于先前的研究报道11,14，描述了一种用于表征植物细胞壁葡甘露聚糖结构的方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;寡糖标准品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘露糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 3458-28-4</td><td></td></tr><tr><td>甘露二糖</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 14417-51-7</td><td></td></tr><tr><td>甘露三糖</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 28173-52-6</td><td></td></tr><tr><td>甘露四糖</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 51327-76-5</td><td></td></tr><tr><td>甘露五糖</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 70281-35-5</td><td></td></tr><tr><td>甘露六糖</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 70281-36-6</td><td></td></tr><tr><td>葡甘露聚糖（魔芋；低黏度）</td><td>Megazyme</td><td>P-GLCML</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他专用化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-氨基萘-1,3,6-三磺酸</td><td>(Molecular probes) Thermo</td><td>A350</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基吡啶硼烷</td><td>TCI</td><td>B3018</td><td></td></tr><tr><td>40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1 丙烯酰胺:双丙烯酰胺）</td><td>Bio-rad</td><td>1610146</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;专用设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>凝胶制备套件</td><td>Hoefer</td><td>SE660 kit</td><td>18x24 cm 玻璃板，0.75 mm 间隔垫</td></tr><tr><td>冷却循环水浴&amp;nbsp;</td><td>Hoefer</td><td>RCB20-plus 115v</td><td>需能够维持约 10 °C 的温度</td></tr><tr><td>G:Box Chemi XRQ 成像系统</td><td>Syngene</td><td>05-GBOX-CHEMI-XRQ</td><td>订购时需配备适用于荧光染料的滤光片，透射光源应安装长波紫外灯</td></tr><tr><td>高压电源</td><td>Thermo</td><td>EC1000XL</td><td>1000V&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>真空离心浓缩仪（Speedvac）</td><td>Savant</td><td>SPD131</td><td></td></tr><tr><td>垂直凝胶电泳系统</td><td>Hoefer</td><td>SE660</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;糖基水解酶&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>这些酶可从公司（如 Megazyme（https://www.megazyme.com/）或 Prozomix（http://www.prozomix.com/））购买，也可通过向相关研究组索取质粒在实验室内部表达获得。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;实验室耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管（Falcon 离心管，聚丙烯，无菌，Corning）</td><td>VWR</td><td>21008-918</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管（Falcon 离心管，聚丙烯，无菌，Corning）</td><td>VWR</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像软件（Genesys）</td><td>Syngene</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用pace对植物细胞壁甘露聚糖的结构表征

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

植物细胞壁多糖 notoriously 难以分析，大多数方法需要昂贵的设备、熟练的操作人员以及大量纯化的样品。本文介绍一种简单的方法，可获得详细的多糖结构信息，包括结构异构体的分辨。对于通过凝胶电泳分析多糖（PACE），植物细胞壁材料首先使用针对目标多糖特异的糖基水解酶进行水解（例如， 甘露聚糖酶用于甘露聚糖）。随后使用大尺寸聚丙烯酰胺凝胶分离已进行荧光标记的释放寡糖。凝胶可通过改良的凝胶成像系统进行可视化观察（参见 材料表）。所得寡糖指纹图谱可进行定性比较，或在重复实验条件下进行定量分析。通过使用额外的糖基水解酶，可确定糖链的连接方式和分支结构信息。例如， 甘露糖苷酶和半乳糖苷酶）。虽然本方案描述的是分析葡甘露聚糖结构的方法，但也可应用于任何存在已知特性的糖基水解酶的多糖。或者，该方法也可利用明确的多糖底物来表征新的糖基水解酶。

此处，我们展示了一个按照本方案进行的PACE凝胶电泳示例，并提供了有助于数据分析与故障排查的说明，随后给出了成功解读PACE凝胶的一般性指南13,16。图2展示了一个测定细胞壁甘露聚糖含量的标准PACE实验的代表性凝胶结果，并按泳道逐一进行描述。
标准品 
泳道 1、2 和 3 显示了市售寡糖（Man1- Man6）在 5（S1）、10（S2）和 50（S3）pmol 浓度下的分子量标记物。当收到新的市售寡糖批次时，重要的是在凝胶上检测其纯度。许多寡糖，特别是四糖及更长的寡糖，可能含有显著量的其他聚合度（DPs）的寡糖杂质，如本图中 Man6 所示（以 * 标记）。在对凝胶进行定量时，必须至少包含三种不同浓度的标准品，因为这是计算标准曲线所必需的。标准曲线的计算也有助于确认衍生化反应是否基本完成。已知浓度的标准品可用于不同凝胶之间的比较，并作为分离质量和衍生化质量的有效对照。
阳性对照 
第4泳道显示了魔芋葡甘露聚糖的甘露聚糖酶消化结果。魔芋葡甘露聚糖可商业获得，尽管其结构与例如拟南芥中的葡甘露聚糖不同，但它具有两个作用。首先，它是酶消化的重要对照。研究人员应明确其选用的糖苷水解酶对商业底物完全消化后的产物形态即， 加入过量的GH进行反应）。如果在后续实验中该模式发生变化，则可能表明GH储备液的活性丧失或受到污染。其次，该步骤还可作为在酶和缓冲盐存在下衍生化反应的对照。如果标准品结果良好，但阳性对照结果较差，则可能表明水解反应中的某一组分对衍生化过程具有抑制作用。
野生型（WT）拟南芥茎部AIR组分与甘露聚糖酶混合物（GH5 + GH26） 
泳道5显示了野生型拟南芥茎部的PACE指纹图谱（可与参考文献11,14对比）。
csla9 拟南芥茎部 AIR + 甘露聚糖酶混合物（GH5 + GH26） 
第6泳道显示了缺乏主要茎部甘露聚糖合酶的拟南芥植株茎部的PACE指纹图谱11。请将其与野生型及阴性对照的指纹图谱进行比较。尽管该植株中大部分甘露聚糖缺失，但仍残留少量，这由所有甘露聚糖酶衍生的寡糖条带强度降低得以证实。这些残留甘露聚糖由其他甘露聚糖合酶（CSLA2、3）合成11。
阴性对照——仅有酶 
第8泳道中出现的条带并非特异性产物，而是来源于甘露聚糖酶混合液中的污染物，应在分析中予以排除（用*标记）。
阴性对照 - 仅野生型 AIR 
泳道 9 显示凝胶上存在非特异性条带，应在分析中排除（用 * 标记）。
阴性对照 - csla9 仅 AIR 
泳道 10 显示凝胶上存在非特异性条带，不应纳入分析（用 * 标记）。
松木粉 AIR + 甘露聚糖酶鸡尾酒（GH5 + GH26） 
第 7 泳道显示了含有半乳甘露聚糖的松木粉的 PACE 指纹图谱。由于结构不同，其释放的寡糖图谱明显不同于拟南芥。
阴性对照——仅松树AIR 
第11泳道显示了凝胶上非特异性的条带，这些条带应在分析中排除（用*标记）。
解读 PACE 凝胶相对简单，但需注意以下几点。为获得可靠的数据，建议对至少 3 个独立培养的生物学重复样本进行 PACE 实验，并对每个生物学重复样本至少进行 2 次技术重复。所述对照对于结果解读至关重要，因为需要排除非特异性条带。我们还建议在重复凝胶上以不同顺序加样，以排除因透射光源照明显影不均所导致的假象。准确的解读需要分析未达到饱和的条带。由于某些寡糖指纹图谱可能同时包含丰度极高和极低的多糖成分，因此建议对同一块凝胶进行多次不同曝光时间的成像分析。可利用标准品对不同图像之间进行归一化处理。
对于某些类型的实验，可能需要对AIR制备物中的多糖含量进行定量。虽然可以通过PACE凝胶进行定量，但这需要明确知道由GHs释放的每种寡糖的确切分子身份及其在PACE凝胶上的位置。目前，甘露聚糖（mannan）的这些信息尚未完全明确，但其他多糖的相关信息已确定。 例如 木聚糖3标准品可在不同凝胶之间提供归一化方法，即使不进行定量分析，也有助于任何定性或半定量分析。
利用糖苷水解酶（GHs）混合物可鉴定单个寡糖的结构。通过依次添加不同的GHs，可揭示所释放寡糖的连接方式和取代基细节。例如， 添加作用于非还原末端的 β-1,4-葡萄糖苷酶将揭示混合物中哪些寡糖含有该结构特征）。可用的酶包括半乳糖苷酶、葡萄糖醛酸苷酶和葡萄糖苷酶（参见 CAZy 数据库）。16 有关更多信息，请参见 Hogg, D. 等17 例如。
上述方案可用于表征未知糖苷水解酶（GH）的活性。在此情况下，应使用定义的生物质（如拟南芥茎或魔芋葡甘露聚糖）来筛选未知的糖苷水解酶13。
<img alt="显示胺化过程的化学反应图示；包含 NH2-ANTS 和 2-PB 的结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：此图展示了寡糖与 ANTS 进行荧光衍生化的反应方案。 改编自 Goubet2。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56424/56424fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="聚合酶链式反应凝胶图谱；寡糖条带；泳道比较；csla9 分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2： 代表性 PACE 凝胶图谱，显示来自拟南芥、松树以及一种拟南芥突变体（csla9）的甘露聚糖指纹图谱，该突变体的甘露聚糖生物合成能力受损。AlR 经甘露聚糖酶混合物水解后，释放的寡糖以荧光染料进行衍生化处理。根据寡糖的大小、形状和电荷，通过凝胶电泳实现分离。图中提供了甘露寡糖标准品（Man1-6），以辅助鉴定所释放寡糖的相对迁移率；同时展示了从魔芋中提取的纯化甘露聚糖的水解产物作为阳性对照。* = 非特异性条带。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56424/56424fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文描述了一种以甘露聚糖为例，通过凝胶电泳（PACE）进行多糖结构分析的实验方案。

利用PACE对植物细胞壁甘露聚糖的结构表征

植物细胞壁多糖 notoriously 难以分析，大多数方法需要昂贵的设备、熟练的操作人员和大量的样品……

本实验的总体目标是表征植物细胞壁多糖。该方法有助于我们回答植物细胞壁生物学领域中的关键问题，包括葡甘露聚糖的结构与含量。该技术的主要优势在于无需特殊培训或昂贵设备。通常，初次使用该方法的研究人员在凝胶结果的解读方面会遇到困难，因此包含并理解文中所述的所有对照至关重要。酒精不溶性残渣（AIR）需按照文本方案中的描述，从收获的植物材料中预先制备。取六毫克 AIR 置于 15 毫升离心管中，并加入水，使其最终浓度为每毫升含两毫克 AIR。涡旋以获得均匀的悬浮液。将500微克分装至微量离心管中。在30°C下使用真空离心机干燥分装样品，过夜。用一摩尔氢氧化钠在室温下处理 AIR，包括用于无酶对照的一份等分试样，处理一小时。一小时后，向每根试管中加入 200 微升水和 20 微升一摩尔盐酸，以中和氢氧化钠。取一微升溶液点在 pH 试纸指示条上，检测 pH 是否约为 6 至 7。向每根试管中加入50微升1摩尔的乙酸铵缓冲液（pH 6.0），并加水至总体积为500微升。开始此操作时，向AIR等分试样和缓冲液中加入预定量的甘露聚糖酶。同时设置适当的阴性对照以及阳性对照。涡旋混匀，然后短暂离心，使反应混合物聚集在管底。在37摄氏度下轻轻振荡孵育过夜。次日，于95摄氏度孵育20分钟以终止反应。以最大速度离心10分钟。保留上清液，并将每个沉淀物重新悬浮于250 µL水中。再次离心，并保留上清液。合并两份上清液，并在30摄氏度下用真空离心机干燥约三小时。在进行衍生化操作前，按照文本方案中的描述配制所需的试剂。将0.2摩尔的ANTS储备液加热至60摄氏度，以彻底溶解其中的固体。向每个样品中加入5 µL ANTS、5 µL 2-吡啶硼烷和10 µL 衍生化缓冲液。短暂离心以收集至管底，充分涡旋混匀，然后再短暂离心一次。将样品在37 °C避光条件下孵育过夜。次日，在30摄氏度下使用真空离心浓缩仪干燥样品，约两小时。将每个样品重悬于寡糖标准品和100微升3摩尔尿素中。避光保存于-20摄氏度，直至使用时取出。凝胶灌注设备的组装取决于具体品牌。本演示中所用设备中，一块凝胶相当于50毫升。在50毫升离心管中，混合20.2毫升水、5毫升10x PACE缓冲液、24.6毫升40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺、200微升APS以及20微升TEMED。轻轻倒置以混匀，注意避免引入气泡。使用血清学移液管或其他大容量移液管将分离胶倒入玻璃板中，至距离玻璃板顶部约四厘米处。小心地在凝胶上层覆盖异丙醇。让凝胶聚合20至30分钟。倒去上层液体。用吸水纸吸干残留的多余液体。接下来，制备浓缩胶。在15毫升离心管中，加入6.8毫升水、1毫升10× PACE缓冲液、2.8毫升丙烯酰胺/双丙烯酰胺、80微升APS和8微升TEMED，颠倒混匀后，覆盖于已聚合的分离胶上方。轻轻插入梳子，避免梳齿下方滞留气泡。待凝胶聚合后，用湿润的纸巾包裹，再用塑料膜包好，于4°C保存备用。为便于追踪加样顺序，并在拔出梳子后识别加样孔位置，可使用永久性记号笔在玻璃板上标记加样孔的位置。取下梳子。用一倍浓度的 PACE 缓冲液填充孔。使用 10 微升微量注射器，向孔中加入 2 微升的标准品和样品。避免使用最外侧的泳道，因为这些泳道通常电泳效果较差，且样品之间应留出一个空泳道。组装好电泳装置的上层室，将凝胶放入含有1× PACE缓冲液的预冷电泳槽中，并用1× PACE缓冲液充满上层室。接通电源，以 200 伏电压电泳 30 分钟。30 分钟后，将电压升至 1,000 伏，持续运行 1 小时 40 分钟。电泳过程中需避光保护凝胶。首先用湿润的无尘布擦拭凝胶成像系统，确保其无灰尘。从 PACE 电泳槽中取出凝胶，在凝胶仍位于玻璃板之间时快速观察，以确定染料前沿是否仍在凝胶上。使用楔形工具打开凝胶，当凝胶仍附着在一块玻璃板上时，若染料前沿仍在凝胶上，则使用披萨切刀切除浓缩胶以及凝胶底部。在透射仪表面加入约五毫升水，然后将凝胶直接转移至透射仪上。使用软件将滤光片设置为 UV 605，并打开长波紫外透射仪。在不同曝光时间下拍摄多张图像，每次拍摄之间务必关闭紫外光，以避免荧光降解。确保至少有两张图像中没有饱和条带。将文件保存为高分辨率的 TIFF 图像。下图显示了一个典型的PACE细胞壁甘露聚糖含量测定的凝胶结果。泳道一、二和三分别显示了浓度为5、10和50皮摩尔的市售寡糖分子量标记物。泳道四显示了魔芋葡甘露聚糖经甘露聚糖酶消化的结果，该泳道作为酶消化及在酶和缓冲盐存在下衍生化反应的阳性对照。泳道五显示了野生型拟南芥茎的PACE指纹图谱。第6泳道显示了缺乏主要茎部甘露聚糖合酶的拟南芥植株茎部的PACE指纹图谱。与野生型相比，甘露聚糖含量极少，这由所有甘露聚糖酶衍生的寡糖条带强度降低可见。第10泳道显示了含有半乳葡甘露聚糖的松木的PACE指纹图谱，其释放的寡糖图谱明显不同于拟南芥。第7、8、9和11泳道为不同的阴性对照，显示出由星号标记的非特异性条带，这些条带应在分析中排除。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用PACE技术分析甘露聚糖的结构。一旦掌握，该技术可应用于其他多糖的研究，只需更换不同的糖苷水解酶即可。除了拟南芥外，我们还成功地将该技术应用于许多其他植物物种，以及其他非植物物种，如酵母甘露聚糖。

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