测定化学物质对线虫线虫生长和繁殖的影响
October 5th, 2017
一个基本的协议, 以评估化学品的毒性在模型动物,线虫线虫, 描述。该方法对药品的开发和各种环境污染物的风险评估都具有很好的实用价值。
该程序的总体目标是测量化学物质（例如拓扑异构酶抑制剂依托泊苷）对模式动物秀丽隐杆线虫生长和繁殖的影响。这种方法可以帮助回答毒理学领域的关键问题，例如药物开发的毒理学评价和环境毒物的风险评估。该技术的主要优点是可以在非哺乳动物系统中检查各种化学品的毒性，因此该技术方便且具有成本效益。
演示该程序的是我实验室的研究生 So Young Lee。首先，在一个瓶子中加入 0.6 克氯化钠、0.5 克蛋白胨、3.4 克琼脂、195 毫升蒸馏水和磁力搅拌器，准备两个干净的 200 毫升玻璃瓶。然后将磁力搅拌器添加到另一个空瓶中。
将瓶子在 121 摄氏度下高压灭菌 15 分钟，然后在 55 摄氏度的水浴中冷却瓶子 30 分钟。接下来，在装满的瓶子中加入 0.2 毫升 1 摩尔氯化钙、0.2 毫升 5 毫克/毫升胆固醇、0.2 毫升 1 摩尔硫酸镁和 5 毫升 1 摩尔磷酸钾。然后在 55 摄氏度的热板上通过磁力搅拌混合溶液。
将一半混合的 NGM 培养基倒入 200 毫升空瓶中。然后在一个瓶子中加入 1 毫升 DMSO，并使用磁力搅拌再次混合。将另一个瓶子存放在 55 摄氏度的水浴中。
然后将 3 毫升含 DMSO 的培养基分装到 35 x 10 毫米的培养皿中。从水浴中取出另一个瓶子，并使用磁力搅拌将其混合。然后加入 1 毫升 75 毫摩尔依托泊苷。
再次混合后，重复等分程序。将含有化学物质的 NGM 板在室温下放置约 3 小时以冷却，并在 4 摄氏度下储存直至使用。对于化学测试，在每个 NGM 板上涂抹 100 微升热灭活的大肠杆菌 OP50。
让板在 20 摄氏度的秀丽隐杆线虫培养箱中干燥过夜。将年龄同步的秀丽隐杆线虫卵转移到补充有 1% DMSO 或 750 微摩尔依托泊苷的 NGM 板中。将秀丽隐杆线虫放入 20 摄氏度的培养箱中 4 天。
每天在立体显微镜下观察和拍摄秀丽隐杆线虫的显微图像。此外，拍摄显微镜载物台千分尺的显微图像以进行蠕虫尺寸校准。要测量在每个时间点用 DMSO 或依托泊苷处理的秀丽隐杆线虫的体长，请在 ImageJ 中打开显微镜载物台千分尺图像。
然后使用直线工具，在图像上拖动一条 1， 000 微米的线。单击 分析 然后 设置比例，然后输入 1， 000 和微米 到 已知距离 框和 单位长度 框。然后检查 全局 并单击 OK.使用 File （文件） 打开 蠕虫 镜像，然后使用 Open （打开）。
然后，使用手绘线工具，沿着每个蠕虫的特征画一条线。通过单击 Analyze （分析），然后单击 Measure （测量） 来获取体长数据。对 50 条蠕虫重复这些步骤。
将年龄同步的鸡蛋在含有 DMSO 或依托泊苷的 NGM 平板上于 20 摄氏度孵育 64 小时，直到青年阶段。将 5 条成虫转移到不含化学品的新 NGM 板或含有相同化学预处理的新 NGM 板中，并孵育 24 小时。如刚才所示，将成虫转移到新的 NGM 板中，并每天计算鸡蛋的数量。
此外，计算爬出、死亡或内部孵化的蠕虫数量。根据文本协议进行计算。如图所示，在 24 至 96 小时依托泊苷治疗显着延缓了秀丽隐杆线虫的生长。
孵育 96 小时后，依托泊苷处理的蠕虫长到 0.86 毫米，而载体处理的蠕虫长到 1.04 毫米。在立体显微镜观察下也观察到生长迟缓，如依托泊苷处理的蠕虫与对照处理的蠕虫相比，这些图像所示。孵化 72 小时后，观察到来自载体处理的蠕虫的卵。
相比之下，在依托泊苷处理 96 小时后观察到卵，这增加了依托泊苷处理延迟秀丽隐杆线虫首次出生时间的可能性。如这些图表所示，当培养年轻成虫时，观察到依托泊苷处理的总卵数减少，无论是否存在连续依托泊苷处理。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在一周内完成。
看完这个视频，你应该对如何评估秀丽隐杆线虫（一种模式线虫）的化学毒性有了很好的了解。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本文介绍了一种使用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）作为模型生物来评估化学物质毒性的协议。该方法特别适用于药物开发和环境风险评估。
关键研究组成部分
科学领域
- 毒理学
- 药物开发
- 环境科学
背景
- 秀丽隐杆线虫是一种非哺乳动物模型生物。
- 该协议评估了各种化学物质对生长和繁殖的影响。
- 它提供了一种成本效益高的毒性测试方法。
- 该技术可以评估药物和环境污染物。
研究目的
- 测量化学物质（如长春碱）对秀丽隐杆线虫的影响。
- 促进药物开发的毒理学评估。
- 评估环境毒物带来的风险。
使用的方法
- 使用氯化钠、蛋白胨、琼脂和蒸馏水配制生长培养基。
- 使用玻璃瓶培养生物。
- 评估生长和繁殖指标。
- 在受控环境中评估化学物质毒性。
主要结果
- 该协议允许系统性评估化学物质毒性。
- 证明了使用秀丽隐杆线虫进行毒理学研究的可行性。
- 提供了特定化学物质对生物系统影响的见解。
- 突出了非哺乳动物测试系统的优势。
结论
- 所描述的方法对评估化学物质毒性是有效的。
- 它支持药物开发和环境风险评估。
- 使用秀丽隐杆线虫提供了一种便捷且经济的方法。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables early-stage toxicological evaluation using a non-mammalian model, supporting drug development and environmental risk assessment with reduced ethical and cost burdens. By measuring growth and reproduction endpoints in C. elegans, it provides quantitative data for mechanistic de-risking of chemical candidates. The approach aids in prioritizing compounds with favorable safety profiles before mammalian testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chemical effects on fundamental biological processes like growth and reproduction.
- Operational Value: Offers a scalable, ethically favorable system for initial toxicity screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, quantitative phenotypic data on growth retardation and fecundity changes.
- Operational Value: Standardized protocol supports assay reproducibility across laboratories and timepoints.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates assessment of reversible versus irreversible reproductive toxicity, informing risk characterization.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical evaluation using consistent phenotypic readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within discovery biology to inform lead identification by providing early toxicity signals that guide compound progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding chemical impact on developmental and reproductive pathways.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable outputs for compound comparison and hit validation.
- Analytics: Provides measurable endpoints such as body length and egg count for dose-response analysis.
- Translational Research: Connects early phenotypic effects to later-stage risk assessment through reversible/irreversible toxicity determination.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable toxicology platform applicable across therapeutic areas and chemical classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking chemical exposure to functional phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized culture, exposure, and imaging procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by identifying toxic liabilities early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on reversible or irreversible reproductive effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nematode culture, synchronization, and microscopic phenotyping.
- Dependent on access to stereo microscopes, incubators, and image analysis tools like ImageJ.
- Necessitates standardization of chemical preparation, exposure duration, and environmental controls.
- Adaptation considerations include chemical solubility, stability in medium, and species-specific sensitivity.
- Practical limitations include throughput constraints for large-scale screening and reliance on manual counting for fecundity.
