利用基于细胞计数微球的免疫检测平台对刺激后的小鼠脾细胞进行多重细胞因子分析

本实验方案的总体目标是利用基于微球的多重免疫检测技术及流式细胞仪，同时定量检测经刺激的小鼠脾细胞培养上清液中的多种细胞因子。该方法可用于解答免疫学领域的关键问题，例如：在特定疾病状态下，哪些独特的细胞因子谱型调控了免疫应答？该技术的主要优势在于，与传统的ELISA方法相比，可在显著减少样本用量的同时，实现对多种细胞因子的同步定量，并降低非特异性结合。

本实验操作将由我们产品开发团队的研究助理 Nicholas Johnsen 演示。首先按照文本方案中所述进行生物样本的制备。为制备预混的抗体固定化磁珠，需将预混磁珠瓶置于室温下的超声水浴中，超声处理一分钟。

使用前涡旋振荡30秒。若无超声波水浴仪，可将涡旋振荡时间延长至1分钟。对于标准配制，加入250 µL分析缓冲液以溶解冻干的小鼠Th细胞因子标准品混合物。

短暂涡旋混匀，将离心管室温静置10分钟。将标准品混合液转移至标记为C7的聚丙烯微量离心管中，此管作为最高浓度标准品。另标记六个聚丙烯微量离心管，分别标为C1至C6。向每个管中加入75 µL的检测缓冲液。

然后，取25微升最上方的标准品C7，转移至C6管中，并通过涡旋充分混匀。此即为C6标准品。继续进行连续的一比四稀释，每次使用新的移液枪头，将前一管标准品25微升加入下一浓度较低的标准品管中已含的75微升检测缓冲液中。

每次添加后均需涡旋混匀。以测定缓冲液作为空白对照（0 皮克/毫升标准品）。进行测定时，使用前将所有试剂恢复至室温。

本实验演示中使用聚丙烯滤板。在整个检测过程中，包括洗涤步骤，必须始终保持滤板直立，以避免磁珠丢失。通过向每个孔中加入 100 µL 1× 洗涤缓冲液，预润湿滤纸，并在室温下静置一分钟。

使用真空抽滤装置去除缓冲液体积。将板压在干净的纸巾堆上，吸去板底部多余的洗涤缓冲液。然后，将板放置在倒置的板盖上方。

对于细胞培养上清液样本，向所有孔中加入25微升检测缓冲液。向标准品孔中分别加入25微升各标准品。最后，向样本孔中分别加入25微升各样本。

将混合的磁珠涡旋振荡30秒。然后，向每个孔中加入25 µL混合磁珠，期间间歇性地轻轻摇动磁珠瓶，以防止磁珠沉降。使用微孔板封板膜密封微孔板。

密封后，用铝箔包裹整个培养板，包括倒置的板盖。将培养板置于板式摇床上固定，于室温下以约500转/分钟振荡两小时。不倒置，将培养板放置于真空 manifold 上，按前述方法施加真空。

然后，向每个孔中加入 200 µL 1× 洗涤缓冲液。通过真空抽滤去除检测板各孔中的液体。用吸水垫或纸巾轻轻吸去板底部多余的洗涤缓冲液，再重复此步骤一次。

接下来，向每个孔中加入 25 µL 检测抗体。使用新的酶标板封板膜密封酶标板后，用铝箔纸将整个酶标板（包括倒置的板盖）包裹起来。将酶标板置于板式摇床上，在室温下以约 500 RPM 的速度振荡孵育 1 小时。

不进行抽真空，直接向每个孔中加入25微升链霉亲和素-藻红蛋白试剂。按之前方法密封并包裹酶标板。然后将酶标板置于板式摇床上，在室温下以约500转/分钟的速度振荡30分钟。

重复真空过滤步骤两次后，向每个孔中加入 200 微升 1× 洗涤缓冲液。在平板振荡器上重悬磁珠 1 分钟。使用多通道移液器将样品从滤板转移至流式细胞术管中，以便在流式细胞仪上检测样品。

根据仪器附带的制造商说明启动流式细胞仪和数据采集软件。创建一个散点图，以正向散射光为X轴，侧向散射光为Y轴。将正向散射光和侧向散射光设置为线性模式。

将试剂盒中提供的原始磁珠小瓶涡旋振荡30秒，以重新悬浮磁珠。取400微升原始磁珠转移至新的FACS管中。将流式细胞仪的流速设置为低速。

运行原始珠子，仔细调整前向散射和侧向散射的增益和电压，使这两类珠子的大小群体明显分离并易于设门。调节前向散射阈值以排除不需要的事件。在前向散射对侧向散射的图中，绘制一个包含所有珠子群体的门。

在第二个点图上，以PE为X轴、APC为Y轴，显示前向散射光与侧向散射光图中门控后的微球群体。调节APC荧光通道的PMT电压，使所有微球群体的APC信号中位荧光强度（MFI）介于10至5,000之间。接着，将PE校准微球小瓶涡旋振荡30秒，以重新悬浮微球。

将400微升重悬的PE微球转移至新的FACS管中。将流式细胞仪中原始微球管替换为PE微球管。调节光电倍增管电压，使PE荧光通道的PE微球MFI值处于PE微球管上标注的批次特异性范围内。

进行数据采集时，设置每种阳极液采集的微球事件数约为300个。分析前将每个样品涡旋振荡5秒，然后读取样品。

读取样本时，应先将流式细胞仪设为设置模式，并等待微球群体稳定后，再切换至采集模式。在进行数据分析前，仅导出设门后的事件，而非全部事件，具体操作详见文本方案。使用小鼠辅助性 T 细胞细胞因子检测试剂盒生成了目标分析物的代表性标准曲线。

正确进行的检测应显示出具有较宽动态范围的曲线，如此处所示。每次进行检测时都必须同时绘制标准曲线。小鼠脾细胞在不同条件下培养48小时。

收集培养上清液，然后使用小鼠辅助性T细胞细胞因子检测试剂盒对13种目标因子的浓度进行定量。在不同刺激条件下，细胞因子表达谱的差异清晰可见。若操作得当，掌握该技术后，实验室操作部分可在五个半小时内完成。

数据采集和下游分析所需时间将根据样本数量的不同而有所变化。观看本视频后，您应能够充分掌握如何应用该实验方案，利用基于流式细胞术的磁珠免疫分析方法对生物样本中的分析物浓度进行定量检测。该流程包括试剂配制、孵育步骤以及流式细胞仪的数据采集设置。