细胞 Bead-based 免疫分析平台对受激小鼠脾多重细胞因子的研究
2017年11月9日
该协议描述了多细胞因子靶点的定量, 同时在组织培养清收集的刺激小鼠脾使用多路微珠基免疫分析平台和流式仪。
该方案的总体目标是使用基于多重珠子的免疫测定和流式细胞仪同时定量从受刺激的小鼠脾细胞收集的组织培养上清液中的多个细胞因子靶标。该方法可用于回答免疫学领域的关键问题，例如，在特定疾病状态下协调免疫反应的独特细胞因子谱是什么？该技术的主要优点是可以使用比传统 ELISA 形式少得多的样品体积同时定量多个环节动物，同时减少非特异性结合。
演示该程序的是我们产品开发团队的研究助理 Nicholas Johnsen。按照文本方案中的说明，从生物样品制备开始此过程。要制备预混抗体固定的微珠，请在室温下在超声浴中对预混微珠瓶进行超声处理 1 分钟。
然后在使用前涡旋 30 秒。如果没有可用的超声浴，请将涡旋时间增加到 1 分钟。对于标准品制备，加入 250 μL 检测缓冲液以复溶冻干的小鼠 Th 细胞因子标准混合物。
通过短暂涡旋混合，让样品瓶在室温下静置 10 分钟。将标准混合物转移到标有 C7 的聚丙烯微量离心管中。这将被用作最高标准。将 6 个聚丙烯微量离心管标记为 C1 至 C6。向每个试管中加入 75 微升测定缓冲液。
然后，将 25 微升顶级标准 C7 转移到 C6 管中，涡旋混合均匀。这将是 C6 标准。继续进行连续的 1 到 4 次稀释，为每管使用新的移液器吸头，将 25 微升前一个标准液添加到下一个最低标准管中的 75 微升检测缓冲液中。
通过涡旋进行每次添加。使用检测缓冲液作为零 pg/mL 标准品。要进行检测，请在使用前让所有试剂加热至室温。
本演示中使用了聚丙烯滤板。在整个检测过程（包括洗涤步骤）中，板必须保持直立，以避免磁珠丢失。向每个孔中加入 100 μL 1X 洗涤缓冲液，预润湿滤纸，并在室温下放置板 1 分钟。
使用真空歧管去除缓冲液体积。将板压在一叠干净的纸巾上，从板底部吸干多余的洗涤缓冲液。然后，将板放在倒置的板盖顶部。
对于细胞培养上清液样品，向所有孔中加入 25 μL 检测缓冲液。向标准孔中加入 25 μL 每种标准品。最后，向样品孔中加入 25 微升每个样品。
将混合的微珠涡旋 30 秒。然后，向每个孔中加入 25 μL 混合珠子，间歇性摇动珠瓶以避免珠子沉淀。用板密封剂密封板。
密封后，用铝箔包裹整个板，包括倒置的板盖。将板放在摇板器上，固定，并在室温下以大约 500 RPM 的速度摇动 2 小时。在不倒置的情况下，将板放在真空歧管上并像以前一样施加真空。
然后，向每个孔中加入 200 μL 1X 洗涤缓冲液。通过真空过滤去除检测板孔的内容物。用吸水垫或纸巾从板底部吸干多余的洗涤缓冲液，然后再重复此步骤一次。
接下来，向每个孔中加入 25 μL 检测抗体。使用新的印版密封机密封印版后，用铝箔包裹整个印版，包括倒置的印版盖。将板放在平板振荡器上，在室温下以大约 500 RPM 的速度摇动 1 小时。
无需抽真空，直接向每个孔中加入 25 μL 链霉亲和素藻红蛋白试剂。像以前一样密封并包裹板。然后，将板放在平板振荡器上，在室温下以大约 500 RPM 的速度摇动 30 分钟。
重复真空过滤步骤两次后，向每个孔中加入 200 μL 1X 洗涤缓冲液。将微珠重新悬浮在平板摇床上 1 分钟。使用多通道移液器，将样品从滤板转移到 FACS 管中，以便在流式细胞仪上读取样品。
根据仪器随附的制造商说明启动流式细胞仪和采集软件。创建一个点图，X 轴上有前向散射，Y 轴上有侧向散射。将 forward scatter 和 side scatter 设置为 linear 模式。
将试剂盒中包含的原始微珠小瓶涡旋 30 秒，以重新悬浮微珠。将 400 微升生珠转移到新的 FACS 管中。将流式细胞仪流速设置为低。
运行原始磁珠，仔细调整前向散射和侧向散射的增益和电压，以便这些磁珠的两个大小的群体明显分离且易于设门。调整前向散射阈值以排除不需要的事件。在前向散点图与侧散点图中，绘制一个包含所有微珠群的门。
在第二个点图上显示前向散射与侧向散点图中的门控微珠群，其中 PE 在 X 轴上，APC 在 Y 轴上。调整 APC 荧光通道的 PMT 电压，使所有微珠群的 APC 信号具有介于 10 和 5， 000 之间的中位荧光强度或 MFI。接下来，将 PE 定型珠小瓶涡旋 30 秒以重新悬浮珠子。
将 400 微升重新悬浮的 PE 珠子转移到新的 FACS 管中。将流式细胞仪中的生珠管更换为 PE 珠管。调整 PE 荧光通道设置的光电倍增管电压，使 PE 珠的 MFI 介于 PE 珠小瓶上列出的批次特定范围之间。
要进行数据采集，请将每个阳极液要采集的微珠事件数量设置为大约 300 个。分析前将每个样品涡旋 5 秒。然后，读取样本。
读取样品时，首先将流式细胞仪设置为设置模式，然后等到微珠群稳定后再切换到采集模式。在执行数据分析之前，仅导出门控事件，而不是总事件，如文本协议中所述。使用小鼠 T 辅助细胞因子面板生成目标阳极物的代表性标准曲线。
正确运行的分析将展示具有宽动态范围的曲线，如下所示。每次进行分析时都必须运行标准曲线。小鼠脾细胞在各种条件下培养 48 小时。
收集培养物上清液，然后使用小鼠 T 辅助细胞因子面板定量 13 个靶标的浓度。响应刺激条件的差异细胞因子表达谱清晰可见。一旦掌握，如果执行得当，该技术的实验室工作台工作可以在不到五个半小时内完成。
数据采集和下游分析时间将根据样品数量而变化。观看此视频后，您应该对如何使用此方案有很好的了解，使用基于微珠的细胞术免疫测定法定量生物样品中的阳极液浓度。这包括试剂制备、孵育步骤和用于数据采集的流式细胞仪设置。
概述
本协议描述了一种方法，用于在受刺激的小鼠脾细胞的组织培养上清液中同时量化多种细胞因子目标，使用多重珠基免疫分析和流式细胞术。该技术允许分析在各种疾病背景下对理解免疫反应至关重要的独特细胞因子谱。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 细胞因子谱分析
- 流式细胞术
背景
- 细胞因子在免疫反应中起着至关重要的作用。
- 传统的ELISA方法需要更大的样本体积，可能导致非特异性结合。
- 多重分析使得能够同时测量多个目标。
- 该方法提高了效率并减少了样本浪费。
研究目的
- 在单一分析中量化多种细胞因子。
- 识别与特定免疫反应相关的细胞因子谱。
- 提高细胞因子测量的准确性和效率。
使用的方法
- 抗体固定珠和标准品的制备。
- 使用聚丙烯过滤板执行分析。
- 使用流式细胞术进行数据采集和分析。
- 进行串行稀释以准备标准品以确保准确性。
主要结果
- 成功量化来自小鼠脾细胞上清液的多种细胞因子。
- 相比ELISA，所需的样本体积减少。
- 为受刺激的免疫反应提供了清晰的细胞因子谱。
- 通过流式细胞术分析验证了该方法的有效性。
结论
- 珠基多重免疫分析是一种可靠的细胞因子量化方法。
- 这种方法可以促进免疫学及相关领域的研究。
- 未来的应用可能包括研究各种疾病状态下的细胞因子谱。
常见问题解答
Executive Industry Relevance
Multiplex bead-based immunoassays enable simultaneous quantification of multiple cytokines from minimal sample volumes, supporting high-content immune profiling in early discovery. This platform enhances predictive confidence in immune pathway interrogation and accelerates target validation for immunology-focused portfolios. The approach reduces sample consumption and increases throughput, directly impacting decision-making at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive cytokine profiling to clarify immune pathway activation under diverse stimulatory conditions.
- Supports functional target validation by quantifying multiple immune mediators in parallel.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing differential cytokine signatures linked to disease-relevant immune responses.
- Improves predictive confidence for advancing immunomodulatory targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multiplexed assay systems for downstream compound screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible cytokine measurements essential for assay standardization.
- Enables high-throughput screening readiness with reduced sample input requirements.
- Supports platform reuse across multiple immune targets and conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cytokine profiling outputs with disease-relevant immune biomarkers for translational continuity.
- Provides data continuity from in vitro discovery through preclinical immune response validation.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by linking cytokine signatures to functional immune outcomes.
- Enhances predictive de-risking for immunology-focused therapeutic programs.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplex immunoassay platform integrates from early discovery through lead identification and preclinical immune response validation, supporting iterative hypothesis testing and data-driven triage.
- Discovery Biology: Enables robust hypothesis testing and pathway clarification via simultaneous cytokine quantification.
- Screening: Provides standardized, quantitative outputs for reliable compound evaluation and assay scalability.
- Analytics: Generates multiplexed readouts and standard curves for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and continuity from in vitro to preclinical models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse immune profiling applications across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune pathway studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable multiplexed assays.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and improves capital efficiency by reducing sample and reagent use.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry setup, gating, and data analysis.
- Needs access to flow cytometers and compatible analytical software for multiplex bead detection.
- Demands rigorous cross-team standardization of assay setup and data interpretation.
- Adaptable to various immune cell models and stimulation conditions with appropriate validation.
- Dependent on consistent standard curve generation and careful sample handling to ensure data quality.
