Name: 细胞 Bead-based 免疫分析平台对受激小鼠脾多重细胞因子的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学习使用多重微球免疫分析结合流式细胞术同时定量检测受激小鼠脾细胞培养上清液中的多种细胞因子，该方法样本用量少、特异性高，适用于免疫学疾病研究中的细胞因子谱分析。

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作者希望感谢生物标志物与免疫分析产品开发团队在本检测方法开发过程中所做出的贡献。此外，我们还要感谢Vigene Tech, Inc.在设计数据分析软件包方面的合作努力。

所有动物实验均按照《实验动物护理与使用指南》中美国国立卫生研究院（NIH）的建议进行，并经 BioLegend 机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
<img alt="细胞培养上清液检测流程图，包含微球捕获、检测抗体和流式细胞术。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：滤板检测流程示意图。 使用滤板进行检测的实验方案以示意图形式展示，包括检测中的关键组分及孵育步骤。<a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
1. 生物样本制备
注意：所选解剖部位和采血量由各研究者自行决定，不会影响检测结果。然而，一旦获得样本，应按照下述步骤进行处理。
<ol>
	<li>血清样本的制备
	<ol>
		<li>将所需体积的血液收集至合适的采血管中，并静置至少30分钟以促进凝血。</li>
		<li>在室温下以1,000 × g离心10分钟。</li>
		<li>小心吸出血清，立即进行检测，或分装至聚丙烯微量离心管中，并在≤ -20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血浆样本的制备
	<ol>
		<li>使用含乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝剂的采血管收集所需体积的血液。</li>
		<li>在采集后30分钟内，于室温下以1,000 × g离心10分钟。</li>
		<li>小心吸出血浆，立即进行检测，或分装至聚丙烯微量离心管中，并在≤ -20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织培养上清样本的制备
	<ol>
		<li>在4 °C下以1,500 × g离心10分钟，以去除细胞和碎片。</li>
		<li>收集上清液，立即进行检测，或分装至聚丙烯微量离心管中，并在≤ -20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冷冻生物样本的解冻
	<ol>
		<li>将先前冷冻的生物样本置于冰上完全解冻，使用前短暂涡旋混匀。避免反复冻融超过2次。 
		注：本实验方案中所用样本系通过培养BALB/c小鼠脾细胞（1 × 106 个细胞，在37 °C + 5% CO2条件下，分别在未刺激、LPS（100 ng/mL）、αCD3（1 µg/mL包被）+ αCD28（1 µg/mL可溶性）、PMA（20 ng/mL）+ 离子霉素（500 ng/mL）等不同条件下）获得。培养48小时后收集培养上清，并按第1.3节所述方法处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 试剂准备
<ol>
	<li>预混抗体固定化微珠的制备
	<ol>
		<li>在室温下，将预混微珠瓶放入超声波水浴中超声处理1分钟，使用前再涡旋振荡30秒。若无超声波水浴仪，可将涡旋振荡时间延长至1分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤缓冲液的制备
	<ol>
		<li>将试剂盒中提供的20x洗涤缓冲液（含1% Tween-20的20x PBS）恢复至室温，并涡旋振荡使所有盐类充分溶解。</li>
		<li>取25 mL 20x洗涤缓冲液，加入475 mL去离子水中稀释。未使用部分可在2 °C至8 °C条件下保存，最长可保存一个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基质B的制备（仅用于血清和血浆样本）
	<ol>
		<li>向含有冻干基质B的小瓶中加入5.0 mL试剂盒提供的检测缓冲液（含1% BSA的PBS）。室温静置至少15分钟以确保完全重悬，随后涡旋振荡混匀。剩余的重悬基质B可在≤ -70 °C条件下保存，最长可保存一个月。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 标准品制备
注意：该检测面板中的每种分析物最高标准浓度均为 10,000 pg/mL。
<ol>
	<li>加入 250 µL 分析缓冲液以重悬冻干的小鼠 Th 细胞因子标准品混合液。短暂涡旋混匀，并将管子在室温下静置 10 分钟。</li>
	<li>将标准品混合液转移至标记为“C7”的聚丙烯微量离心管中。此液将作为最高浓度标准品（C7）。</li>
	<li>标记 6 个聚丙烯微量离心管，分别为 C6、C5、C4、C3、C2 和 C1。</li>
	<li>向上述每支管中加入 75 µL 分析缓冲液。</li>
	<li>将 25 µL 最高浓度标准品 C7 转移至 C6 管中，并通过涡旋充分混匀。此即为 C6 标准品。</li>
	<li>继续进行连续的 1:4 稀释：每次使用新的移液器吸头，将前一标准品的 25 µL 加入下一较低浓度标准管中含 75 µL 分析缓冲液的管内，随后涡旋混匀，依次获得 C5、C4、C3、C2 和 C1 标准品。以分析缓冲液作为空白对照（0 pg/mL 标准品，记为 C0）。</li>
</ol>
4. 样品稀释
注意：使用该检测方法对多个稀释度进行初步预实验，可能需要确定特定生物样本最合适的稀释倍数。合适的稀释倍数应使样本的浓度计算值落在标准曲线的范围内。以下步骤仅为指导性建议，具体参数可能需根据样本类型通过实验确定。
<ol>
	<li>用聚丙烯微量离心管将血清或血浆样本用检测缓冲液进行2倍稀释（例如：将50 µL样本与50 µL检测缓冲液混合）。 
	注意：若需要进一步稀释样本，应使用Matrix B而非检测缓冲液，以确保测量结果准确。未经稀释直接加入血清或血浆样本将导致检测准确性降低，并可能堵塞滤板。Matrix B由经去除内源性检测靶标的混合小鼠血清制成，作为血清或血浆样本的稀释液，用于避免基质效应，此类效应已知会影响免疫检测的分析灵敏度。</li>
	<li>细胞培养上清样本无需稀释，直接检测。 
	注意：不同样本中分析物的含量可能差异较大。如有必要，可使用新鲜配制的相应细胞培养基或检测缓冲液对上清样本进行稀释。</li>
</ol>
5. 检测步骤
注意：该实验可在聚丙烯滤膜板、微量FACS管或V型底微量板中进行。推荐使用滤膜板实验流程，因其具有良好的样品间一致性、实验稳健性强且易于操作。本流程需要使用真空过滤装置进行洗涤（由最终用户自行提供）。
<ol>
	<li>使用前将所有试剂平衡至室温（20 - 25 °C）。</li>
	<li>在实验设置和孵育过程中，始终将滤板置于倒置的板盖上，以防止板底部接触任何表面，避免发生泄漏。</li>
	<li>在整个实验过程中（包括洗涤步骤）保持板直立，以防磁珠丢失。</li>
	<li>所有孵育步骤期间，将板置于避光环境或用铝箔纸包裹。</li>
	<li>所有标准品和样品均需设复孔，并按顺序在板上排列。</li>
	<li>预润滤板：在每孔中加入 100 µL 1× 洗涤缓冲液，室温静置 1 分钟（若使用底部带滤膜的微孔板）。</li>
	<li>使用真空 manifold 抽去液体（5 - 10 秒），真空压力不得超过 10 "Hg。用干净纸巾轻压板底部以吸除残留洗涤缓冲液。将板放回倒置的板盖上。 
	注意：若使用 V 型底微孔板或微量 FACS 管，则可省略步骤 5.1 - 5.2。</li>
	<li>对于细胞培养上清样本，在所有孔中加入 25 µL 检测缓冲液。在标准品孔中加入 25 µL 各种标准品。在样本孔中加入 25 µL 各样本。</li>
	<li>对于血清或血浆样本检测，在标准品孔中加入 25 µL Matrix B。在样本孔中加入 25 µL 检测缓冲液。在标准品孔中加入 25 µL 各标准品。在样本孔中加入 25 µL 经稀释的血清或血浆样本。</li>
	<li>将混合磁珠涡旋振荡 30 秒。向每孔加入 25 µL 混合磁珠，期间间歇震荡磁珠瓶以防止磁珠沉降。加入磁珠后，每孔终体积应为 75 µL。</li>
	<li>用板封膜密封板。用铝箔纸包裹整个板（包括倒置的板盖）。将板置于板式摇床上固定，于室温下以约 500 rpm 振荡孵育 2 小时。为防止泄漏，切勿对板封膜施加正压。</li>
	<li>不翻转板，将其置于真空 manifold 上，按前述方式施加真空，并向每孔加入 200 µL 1× 洗涤缓冲液。</li>
	<li>通过真空过滤去除板孔中的液体。用吸水垫或纸巾吸除板底部多余洗涤缓冲液。重复此步骤一次。 
	注意：若使用 V 型底微孔板或微量 FACS 管，则跳过步骤 5.12 和 5.13，改为在室温下以 1,000 × g 离心 5 分钟，然后使用多通道移液器去除上清液。</li>
	<li>向每孔加入 25 µL 检测抗体（参见材料表）。</li>
	<li>使用新的板封膜密封板。用铝箔纸包裹整个板（包括倒置的板盖）。</li>
	<li>将板置于板式摇床上，于室温下以约 500 rpm 振荡 1 小时。</li>
	<li>无需抽真空，直接向每孔加入 25 µL SA-PE 试剂。试剂无需稀释。</li>
	<li>使用新的板封膜密封板。用铝箔纸包裹整个板（包括倒置的板盖）。</li>
	<li>将板置于板式摇床上，于室温下以约 500 rpm 振荡 30 分钟。</li>
	<li>重复上述步骤 5.13。</li>
	<li>向每孔加入 200 µL 1× 洗涤缓冲液。在板式摇床上重新悬浮磁珠 1 分钟。</li>
	<li>使用多通道移液器将样本从滤板转移至 FACS 管中，用于流式细胞仪检测。 
	注意：可通过向每管额外加入 100 µL 1× 洗涤缓冲液，将样本体积从 200 µL 增加至 300 µL，以防止样本干涸。如有需要，样本可在 4 °C 避光保存，并于次日检测。但长时间储存可能导致信号减弱。</li>
</ol>
6. 流式细胞仪设置
注意：为了获得可靠的数据，在数据采集前必须正确设置流式细胞仪。此设置过程在某些方面会因用户和所用仪器配置的不同而有所差异。以下讨论的是针对配备488 nm和633 nm激光器、能够检测PE和APC的流式细胞仪的一般性设置流程。
<ol>
	<li>根据仪器附带的制造商说明，启动流式细胞仪和采集软件。</li>
	<li>创建一个散点图，X轴为FSC（前向散射），Y轴为SSC（侧向散射）。将FSC和SSC设置为线性模式。</li>
	<li>创建第二个散点图，X轴为PE，Y轴为APC。该图应设置为对数显示模式。</li>
	<li>将试剂盒中包含的原始微珠小瓶涡旋振荡30秒，以重新悬浮微珠。这些微珠含有内部APC染料，由两个不同大小的微珠群体组成。</li>
	<li>将400 µL原始微珠转移至一个新的FACS管中。</li>
	<li>将流式细胞仪的流速设置为低速。</li>
	<li>运行原始微珠，仔细调节FSC和SSC的增益和电压，使这两群微珠在图上明显分离且易于设门。</li>
	<li>调节FSC阈值，以排除不需要的事件（i.e. 碎屑或气泡）。</li>
	<li>在FSC与SSC散点图中，绘制一个包含所有微珠群体的门。 
	注意：原始微珠包含两个大小不同的微珠群体，即较小的“A微珠”和较大的“B微珠”区域。</li>
	<li>将FSC与SSC图中设门后的微珠群体显示在第二个散点图上，其中X轴为PE，Y轴为APC。</li>
	<li>调节APC荧光通道的光电倍增管（PMT）电压，使所有微珠群体的APC信号中位荧光强度（MFI）介于1 × 101 至 5 × 103 之间。</li>
	<li>将PE校准微珠小瓶涡旋振荡30秒，以重新悬浮微珠。</li>
	<li>将400 µL PE微珠转移至一个新的FACS管中。</li>
	<li>将流式细胞仪上的原始微珠管更换为PE微珠管。</li>
	<li>调节光电倍增管（PMT）电压，使PE荧光通道的PE微珠MFI落在PE微珠小瓶上标注的批次特异性范围内。 
	注意：PE校准微珠仅包含单一大小的微珠群体（仅“A微珠”）。</li>
</ol>
7. 数据采集
注意：在特定仪器上获取数据的具体操作步骤可能因流式细胞仪的配置规格及其所使用的界面软件而异。因此，以下说明旨在强调无论使用何种流式细胞仪进行检测，均需执行的关键实验步骤。
<ol>
	<li>确认流式细胞仪的流速仍设置为低速。</li>
	<li>每种分析物采集约 300 个微球事件。对于 13 重检测面板，相当于从两种微球大小群体（A 和 B 型微球）共采集 3,900 个事件。</li>
	<li>分析前将每个样本涡旋振荡 5 秒。</li>
	<li>读取样本。读取时，先将流式细胞仪设为设置模式，待微球群体稳定后，再切换至采集模式。</li>
	<li>为数据文件使用简单且连续编号的名称，以方便数据分析。</li>
	<li>仅导出设门后的事件（A 和 B 型微球区域），而非全部事件。</li>
	<li>将每次检测的所有 FCS 文件存储在同一文件夹中。若运行多个检测，应为每个检测创建单独的文件夹。</li>
</ol>
8. 进行数据分析
注意：流式细胞仪生成的 FCS 文件应使用数据分析软件进行分析，该软件可免费下载14。
<ol>
	<li>在计算机上安装数据分析软件。</li>
	<li>将所有检测的 FCS 文件传输至安装有分析软件的计算机。</li>
	<li>将试剂盒中附带的授权密钥加密狗插入计算机的 USB 接口。</li>
	<li>启动数据分析软件。</li>
	<li>点击屏幕顶部的蓝色“添加文件”按钮。</li>
	<li>在弹出的窗口中，浏览至包含检测 FCS 文件的文件夹。</li>
	<li>点击并拖动弹出窗口中的所有检测 FCS 文件至软件显示区域。所有文件现在应出现在列表中。</li>
	<li>点击显示界面右下角的绿色“下一步”按钮。左键点击并按住小的蓝色标准曲线按钮（C7 至 C0），将其拖动至列表中对应的标准曲线 FCS 文件，以定义标准曲线。</li>
	<li>点击显示界面右下角的绿色“下一步”按钮，打开设门弹出窗口。</li>
	<li>在设门窗口的左侧，按升序输入 A 和 B 微球区域检测分析物靶标名称及其对应的微球编号（见随检测提供的说明书）。</li>
	<li>从弹出窗口顶部选择设门工具，并在 FSC 与 SSC 散点图上绘制两个门，一个围绕 A 微球，另一个围绕 B 微球。</li>
	<li>查看 FSC 与 SSC 散点图下方出现的 APC 与 PE 散点图。A 微球（左图）中应有 6 个分析物条带，B 微球（右图）中应有 7 个分析物条带。 
	注意：可通过选择顶部的橡皮擦工具并点击删除特定门，手动重新绘制门。随后可选择设门工具，手动将门应用于目标条带区域。</li>
	<li>点击绿色“确定”按钮，关闭设门弹出窗口，返回 FCS 文件列表。</li>
	<li>通过右键点击特定文件，在菜单中选择“稀释倍数”，并输入正确数值，定义生物样本所进行的任何稀释。</li>
	<li>点击显示界面右下角的绿色“运行”按钮，生成检测的标准曲线，并计算未知生物样本的浓度。</li>
</ol>

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</ol>

作者受雇于 BioLegend 公司，该公司生产本论文中所述的试剂。Vigene Tech, Inc. 开发了 LEGENDplex 数据分析软件，用于分析本论文所述检测方法所产生的数据。

本方案所述的检测方法能够对生物样本中的可溶性介质谱进行可靠的定量分析，前提是实验人员具备良好的实验操作技能，并严格遵循推荐的实验步骤。
为了确保获得可靠的结果，必须遵循若干关键步骤。首先，重组标准品必须在检测缓冲液中充分复溶至推荐的全部时间，之后仅在聚丙烯管中进行稀释。聚苯乙烯管可能促进蛋白质黏附于管壁，从而在生成标准曲线时导致信号偏低。其次，孵育过程中的适当振荡至关重要。若振荡不足，检测微球的结合特性将受到严重阻碍。此外，每次孵育步骤之间的充分洗涤也必不可少。实验人员必须确保在进入下一步操作前，已将孔中多余的试剂彻底去除。用于检测微球的流式细胞仪仪器参数也必须进行优化。特别是，光电倍增管（PMT）的设置应调整至适当水平，以确保微球的良好分离以及标准曲线具备宽广的动态范围。最后，在上机检测前，必须对微球进行涡旋振荡，以保证其充分悬浮，并避免形成聚集体，否则可能导致结果偏差。
该方案有可能经过修改后用于分析组织匀浆以及本文所述的样本类型，前提是研究者愿意在进行大规模全板检测之前优化其裂解方案。实际操作技术当然会因组织类型不同而有所差异；但总体而言，该方案应使用中性pH缓冲液，其中含有生理浓度的离子盐，不含变性化学物质，最好也不含去污剂。如果必须使用去污剂，应尽量减少非离子型去污剂的浓度（例如不超过1%）。缓冲液还应含有足量的蛋白酶抑制剂，以防止目标蛋白发生蛋白水解降解。无论采用何种裂解方案，在分析前均应对最终制备的样品进行离心，以去除颗粒物。
关于检测方法的局限性，生物样本类型中分析物靶标的浓度可能差异很大。为了准确量化分析物浓度，其浓度必须落在标准曲线的上限和下限之间。对标准曲线范围外的数值进行外推并不一定可靠，因此不推荐使用。研究者必须在开展全板检测之前，通过预实验优化其特定样本的稀释倍数。此外，待检测生物样本的仔细制备对于该检测方法的成功至关重要。若样本出现乳糜、溶血或含有蛋白质碎片，将会影响抗原-抗体相互作用——而这正是该免疫测定方法的核心原理，从而导致结果无法解读。
该检测方法相较于现有的定量方法具有多方面的显著意义。若操作得当，该检测方法仅需远小于传统ELISA检测所需的样本体积，即可从一份样本中定量多达13种分析物。此外，该检测方法无需专用仪器即可完成，相较于其他 commercially available 的基于微球的免疫检测方法具有优势，因为它可使用多种常见的流式细胞仪进行检测。
关于分泌因子和细胞因子网络在健康与疾病中作用的科学研究正在不断拓展。本文所述的检测方法可为致力于理解这些多层面且复杂现象的研究人员提供一种有价值的工具。目前，活跃的生物医学研究项目不仅开始探索细胞因子网络在全身性炎症6等领域的功能，还进一步研究其在动脉粥样硬化、癌症和神经炎症等特定疾病状态中的作用15,16,17。随着针对这些慢性疾病的新疗法研发不断推进，相关领域的研究无疑将持续增长。对与这些疾病相关的可溶性介质进行准确且可靠的定量分析，仍将是科研工作的关键优先方向。

作为可溶性信号分子，细胞因子介导了调控宿主免疫应答的高度协调且多因素参与的过程。它们在炎症过程的各个阶段（从启动到消退）均有表达，并调控着一个复杂的相互作用网络，该网络包括细胞因子自身及其细胞受体的合成1。这一通信网络的复杂性超越了各组分之间可能存在的协同或拮抗关系。事实上，许多细胞因子已知具有功能上的冗余性，或至少存在部分功能重叠2,3。
目前，整合性的系统生物学方法能够同时定量多种细胞因子分析物，从而更全面地揭示调控多种疾病状态下免疫反应的独特细胞因子组4,5。这些疾病状态涵盖从全身性炎症到癌症、神经退行性疾病以及心血管疾病等多种病症6,7,8,9。
此类细胞因子网络可利用基于微球的 LEGENDplex 免疫检测试剂盒进行有效分析。该检测方法的原理与传统的夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）相同，采用表面共价结合了捕获抗体的荧光编码微球。这些抗体被固定在远小于传统 ELISA 所需的表面积上，从而能够在显著减少样本用量的同时，降低非特异性结合，并实现对多种分析物的多重检测。
本方案所述检测技术可同时定量多达13个靶标。该检测的数据可通过多种常见流式细胞仪获取，且与其他现有检测不同，无需使用专用的检测特异性仪器。随着经过验证的分析物检测面板目录不断扩展，这些检测已应用于多项正在进行的生物医学研究项目中10,11,12,13。
为了展示该检测方法的简便性和实用性，本实验采用小鼠辅助性T细胞细胞因子检测试剂盒，对在多种刺激条件下培养的小鼠脾细胞组织培养上清液中的13种不同细胞因子浓度进行定量分析。除组织培养上清液外，该检测也可用于血清或血浆样本。

<table><tbody><tr><td>Allegra 6R 离心机配 MICROPLUS 转子适配器</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>用于在微量管、V 型或 U 型底 96 孔板中进行 LEGENDplex 检测（可选）</td></tr><tr><td>LEGENDplex 小鼠辅助性 T 细胞细胞因子检测试剂盒</td><td>BioLegend</td><td>740005</td><td>多重免疫检测试剂盒（13 重）</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD3&amp;epsilon; 抗体</td><td>BioLegend</td><td>100314</td><td>克隆号 145-2C11，低内毒素，无叠氮化物形式</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD28 抗体</td><td>BioLegend</td><td>102112</td><td>克隆号 37.51，低内毒素，无叠氮化物形式</td></tr><tr><td>真空泵</td><td>EMD Millipore</td><td>WP6111560</td><td>用于使用滤膜板的 LEGENDplex 检测（推荐）</td></tr><tr><td>真空过滤装置</td><td>EMD Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td>用于使用滤膜板的 LEGENDplex 检测（推荐）</td></tr><tr><td>无菌一次性试剂储液槽</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-130</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>聚丙烯 MicroFACS 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-842-90</td><td>用于在微量管、V 型或 U 型底 96 孔板中进行 LEGENDplex 检测（可选）</td></tr><tr><td>移液器套装</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td>四种规格移液器（0.2–2&amp;micro;L，2–20&amp;micro;L，20–200&amp;micro;L，100–1000&amp;micro;L）</td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Fisher Scientific</td><td>FA10011G</td><td>可分配 5 &amp;mu;L 至 200 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>微孔板振荡器</td><td>Fisher Scientific</td><td>88880023</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>75002410</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>FACS 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9885747</td><td>12 × 75 mm 圆底</td></tr><tr><td>PMA（佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>脂多糖（LPS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-8274</td><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; O26:B6</td></tr><tr><td>离子霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Branson B200 超声波清洗器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z305359</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505</td><td>1.5 mL 聚丙烯管</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>Various</td><td>Various</td><td>配备单激光（488 nm 蓝光）或双激光（488 nm 蓝光或 532 nm 绿光 + 633 nm 红光），可检测 575 nm 和 660 nm 发射波长</td></tr><tr><td>96 孔聚丙烯板</td><td>VWR</td><td>82050-662</td><td>用于在微量管、V 型或 U 型底 96 孔板中进行 LEGENDplex 检测（可选）</td></tr></tbody></table>

利用基于细胞计数微球的免疫检测平台对刺激后的小鼠脾细胞进行多重细胞因子分析

Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

基于微球的免疫测定法采用与夹心免疫测定法相同的基本原理。捕获微球可通过大小和内部别藻蓝蛋白（APC）荧光强度进行区分，并与针对特定分析物的抗体偶联。随后，将一组选定的特定捕获微球集合与含有目标分析物的生物样本共同孵育，这些分析物可特异性结合捕获抗体。加入生物素标记的检测抗体混合物，从而形成捕获微球-分析物-检测抗体的夹心复合物。
最后加入链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE），其与生物素化的检测抗体结合，产生的荧光信号强度与结合的分析物量成正比。通过流式细胞术定量分析物特异性微球区域的PE荧光信号，并利用数据分析软件及实验中生成的标准曲线确定特定分析物的浓度。
在本实验中，我们使用小鼠辅助性T细胞细胞因子检测试剂盒，同时定量分析在不同刺激条件下培养的小鼠脾细胞组织培养上清液中13种不同细胞因子靶标的浓度。

本方案展示了如何利用基于微球的免疫检测平台，通过流式细胞仪同时定量生物样本中的细胞因子谱。本示例所用的生物样本为小鼠脾细胞在不同激活条件下培养后的细胞培养上清液；尽管如此，该检测方法也已验证可用于血清或血浆样本。
通过该检测生成的数据用于构建多重检测面板中所有分析物的标准曲线。数据分析软件根据独特的微球大小和APC荧光强度对每种特定分析物进行分类，并使用PE报告信号对其进行定量。当以对数-对数坐标绘制时，该检测的动态范围以及灵敏度在图2A中得以展示。软件利用检测数据和五参数曲线拟合算法，不仅准确计算用户提供生物样本中分析物的浓度，还计算所有标准曲线高低两端的检测限（Table 1）。本方案所述的检测格式还具有高度稳健的精密度。图2B和2C展示了每种分析物在单次检测内的变异性。两个不同浓度的标准蛋白（高浓度和低浓度）在一次检测中被分析，每个样本设置16个重复。图2C和2D展示了三次独立检测之间目标分析物的检测间变异性。与检测内精密度实验类似，在每次独立实验中对高、低浓度标准品各进行3次重复分析。目标蛋白计算浓度的变异性极小，结果清晰可见。
为了展示基于微球的流式细胞检测技术在分析细胞因子表达谱方面的实用性，将小鼠脾细胞在多种激活条件下进行孵育。除未刺激的对照组外，细胞还分别与LPS、抗CD3/抗CD28抗体或佛波酯12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）联合离子霉素共同孵育。48小时后收集细胞培养上清液，并使用小鼠辅助性T细胞细胞因子检测试剂盒进行检测。本实验的定量结果如图3所示，不同刺激条件对细胞因子浓度的影响清晰可辨。
只要实验人员具备良好的实验操作技能并严格遵循所提供的检测方案，上述结果即为典型结果。该检测方法中的误差来源可能包括孵育时间、试剂体积、洗涤步骤的偏差，或用于分析样本的流式细胞仪光电倍增管（PMT）设置不当。在图4A中，一次成功的检测所得到的散点图显示出两个清晰可辨的微球群体。相比之下，在图4B中，由于洗涤不充分及未严格遵守操作流程，导致微球发生聚集，使两个群体界限模糊。此外，如左下象限中的碎片信号所示，导出用于分析的是全部细胞仪事件，而非更理想的仅限门控事件的格式。正确的流式细胞仪设置对于获得可靠的检测数据至关重要。在图4C中，适当的PMT设置使得在APC分类通道中能够分辨出全部6种分析物。若PMT设置不当，则会导致类似图4D所示的结果，即APC通道中各微球群体的分类荧光强度发生重叠，从而无法明确区分不同检测微球群体，致使分析物浓度无法准确计算，最终导致检测结果无效。
<img alt="细胞因子谱分析图与柱状图；MFI 与细胞因子浓度分析、变异性研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：标准曲线范围与检测精密度。（A） 使用小鼠辅助性 T 细胞细胞因子检测试剂盒生成的代表性标准曲线。每次检测均需同时运行标准曲线。（B–C） 检测内精密度。对两个含有不同目标蛋白浓度（高和低）的样本，在同一次检测中每份样本进行 16 次重复分析。数据以均值 ± 标准差表示。（D–E） 检测间精密度。对两个含有不同目标蛋白浓度（高和低）的样本，在三次独立检测中每份样本进行 3 次重复分析。数据以均值 ± 标准差表示。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示在刺激条件下IL-10至IL-13、IFN-γ、IL-5、TNF-α、IL-2反应的细胞因子释放柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：代表性结果的定量分析。 将小鼠脾细胞（1 × 106 个细胞）在37 °C、5% CO2条件下，分别在未刺激、LPS（100 ng/mL）、αCD3（1 µg/mL 包被）+ αCD28（1 µg/mL 可溶性）、PMA（20 ng/mL）+ 离子霉素（500 ng/mL）等不同条件下培养。培养48小时后收集上清液，并使用小鼠辅助性T细胞细胞因子检测试剂盒进行定量分析。在不同刺激条件下，细胞因子表达谱的差异清晰可见。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析；用于细胞群体鉴定的散点图（SSC 对 FSC，APC 对 PE）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：成功与失败实验的结果对比。（A） 成功的实验中，微球群体将呈现出明显区分的微珠群。 （B） 失败的实验中，群体分离效果差，出现微珠聚集体，并采集到过多的事件。 （C） 成功的实验在分类荧光通道中具有清晰可辨的荧光强度，易于设门和定量。 （D） 失败的实验中，分类荧光强度分离不佳，多个微珠群体间信号重叠，导致难以定量。许多此类错误可通过严格遵循实验方案而避免。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">标准曲线</td>
			<td colspan="2">灵敏度 (pg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分析物</td>
			<td>拟合公式</td>
			<td>CV</td>
			<td>R2</td>
			<td>最小值</td>
			<td>最大值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-γ</td>
			<td>5-P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01)</td>
			<td>1.77%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.1</td>
			<td>18105.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-5</td>
			<td>5-P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36)</td>
			<td>1.32%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>14514.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-α</td>
			<td>5-P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37)</td>
			<td>1.48%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>1.9</td>
			<td>20109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>5-P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34)</td>
			<td>1.34%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>25109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6</td>
			<td>5-P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37)</td>
			<td>1.70%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.0</td>
			<td>7022.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>5-P.log(4.27, 12.23, 0.62, 5.72, 0.36)</td>
			<td>1.36%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>13273.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10</td>
			<td>5-P.log(4.67, 11.65, 1.20, 6.28, 0.61)</td>
			<td>1.81%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.2</td>
			<td>5190.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-9</td>
			<td>5-P.log(4.32, 13.86, 0.86, 5.90, 0.45)</td>
			<td>1.82%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>12602.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17A</td>
			<td>5-P.log(4.06, 14.03, 0.47, 6.52, 0.32)</td>
			<td>0.99%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>12285.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17F</td>
			<td>5-P.log(4.52, 12.15, 0.61, 5.52, 0.34)</td>
			<td>0.92%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>14841.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-21</td>
			<td>5-P.log(4.90, 8.03, 1.77, 4.74, 1.11)</td>
			<td>0.79%</td>
			<td>1</td>
			<td>9.0</td>
			<td>12943.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-22</td>
			<td>5-P.log(4.57, 12.56, 0.63, 6.06, 0.39)</td>
			<td>1.16%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>6408.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-13</td>
			<td>5-P.log(4.40, 11.44, 0.22, 3.19, 1.45)</td>
			<td>1.11%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
			<td>16728.0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：标准曲线拟合与检测灵敏度。 使用数据分析软件为多重检测中包含的所有分析物生成标准曲线。该全自动分析对检测中的稀释系列标准品应用了稳健的五参数曲线拟合算法，并利用理论检测限来确定检测的灵敏度。

本方案描述了利用基于微球的多重免疫检定平台和流式细胞仪，对经刺激的小鼠脾细胞培养上清液中多种细胞因子靶标进行同时定量的方法。

基于微球的免疫测定采用与夹心免疫测定相同的基本原理。捕获微球可通过大小和内部...进行区分

本实验方案的总体目标是利用基于微球的多重免疫检测技术及流式细胞仪，同时定量检测经刺激的小鼠脾细胞培养上清液中的多种细胞因子。该方法可用于解答免疫学领域的关键问题，例如：在特定疾病状态下，哪些独特的细胞因子谱型调控了免疫应答？该技术的主要优势在于，与传统的ELISA方法相比，可在显著减少样本用量的同时，实现对多种细胞因子的同步定量，并降低非特异性结合。本实验操作将由我们产品开发团队的研究助理 Nicholas Johnsen 演示。首先按照文本方案中所述进行生物样本的制备。为制备预混的抗体固定化磁珠，需将预混磁珠瓶置于室温下的超声水浴中，超声处理一分钟。使用前涡旋振荡30秒。若无超声波水浴仪，可将涡旋振荡时间延长至1分钟。对于标准配制，加入250 µL分析缓冲液以溶解冻干的小鼠Th细胞因子标准品混合物。短暂涡旋混匀，将离心管室温静置10分钟。将标准品混合液转移至标记为C7的聚丙烯微量离心管中，此管作为最高浓度标准品。另标记六个聚丙烯微量离心管，分别标为C1至C6。向每个管中加入75 µL的检测缓冲液。然后，取25微升最上方的标准品C7，转移至C6管中，并通过涡旋充分混匀。此即为C6标准品。继续进行连续的一比四稀释，每次使用新的移液枪头，将前一管标准品25微升加入下一浓度较低的标准品管中已含的75微升检测缓冲液中。每次添加后均需涡旋混匀。以测定缓冲液作为空白对照（0 皮克/毫升标准品）。进行测定时，使用前将所有试剂恢复至室温。本实验演示中使用聚丙烯滤板。在整个检测过程中，包括洗涤步骤，必须始终保持滤板直立，以避免磁珠丢失。通过向每个孔中加入 100 µL 1× 洗涤缓冲液，预润湿滤纸，并在室温下静置一分钟。使用真空抽滤装置去除缓冲液体积。将板压在干净的纸巾堆上，吸去板底部多余的洗涤缓冲液。然后，将板放置在倒置的板盖上方。对于细胞培养上清液样本，向所有孔中加入25微升检测缓冲液。向标准品孔中分别加入25微升各标准品。最后，向样本孔中分别加入25微升各样本。将混合的磁珠涡旋振荡30秒。然后，向每个孔中加入25 µL混合磁珠，期间间歇性地轻轻摇动磁珠瓶，以防止磁珠沉降。使用微孔板封板膜密封微孔板。密封后，用铝箔包裹整个培养板，包括倒置的板盖。将培养板置于板式摇床上固定，于室温下以约500转/分钟振荡两小时。不倒置，将培养板放置于真空 manifold 上，按前述方法施加真空。然后，向每个孔中加入 200 µL 1× 洗涤缓冲液。通过真空抽滤去除检测板各孔中的液体。用吸水垫或纸巾轻轻吸去板底部多余的洗涤缓冲液，再重复此步骤一次。接下来，向每个孔中加入 25 µL 检测抗体。使用新的酶标板封板膜密封酶标板后，用铝箔纸将整个酶标板（包括倒置的板盖）包裹起来。将酶标板置于板式摇床上，在室温下以约 500 RPM 的速度振荡孵育 1 小时。不进行抽真空，直接向每个孔中加入25微升链霉亲和素-藻红蛋白试剂。按之前方法密封并包裹酶标板。然后将酶标板置于板式摇床上，在室温下以约500转/分钟的速度振荡30分钟。重复真空过滤步骤两次后，向每个孔中加入 200 微升 1× 洗涤缓冲液。在平板振荡器上重悬磁珠 1 分钟。使用多通道移液器将样品从滤板转移至流式细胞术管中，以便在流式细胞仪上检测样品。根据仪器附带的制造商说明启动流式细胞仪和数据采集软件。创建一个散点图，以正向散射光为X轴，侧向散射光为Y轴。将正向散射光和侧向散射光设置为线性模式。将试剂盒中提供的原始磁珠小瓶涡旋振荡30秒，以重新悬浮磁珠。取400微升原始磁珠转移至新的FACS管中。将流式细胞仪的流速设置为低速。运行原始珠子，仔细调整前向散射和侧向散射的增益和电压，使这两类珠子的大小群体明显分离并易于设门。调节前向散射阈值以排除不需要的事件。在前向散射对侧向散射的图中，绘制一个包含所有珠子群体的门。在第二个点图上，以PE为X轴、APC为Y轴，显示前向散射光与侧向散射光图中门控后的微球群体。调节APC荧光通道的PMT电压，使所有微球群体的APC信号中位荧光强度（MFI）介于10至5,000之间。接着，将PE校准微球小瓶涡旋振荡30秒，以重新悬浮微球。将400微升重悬的PE微球转移至新的FACS管中。将流式细胞仪中原始微球管替换为PE微球管。调节光电倍增管电压，使PE荧光通道的PE微球MFI值处于PE微球管上标注的批次特异性范围内。进行数据采集时，设置每种阳极液采集的微球事件数约为300个。分析前将每个样品涡旋振荡5秒，然后读取样品。读取样本时，应先将流式细胞仪设为设置模式，并等待微球群体稳定后，再切换至采集模式。在进行数据分析前，仅导出设门后的事件，而非全部事件，具体操作详见文本方案。使用小鼠辅助性 T 细胞细胞因子检测试剂盒生成了目标分析物的代表性标准曲线。正确进行的检测应显示出具有较宽动态范围的曲线，如此处所示。每次进行检测时都必须同时绘制标准曲线。小鼠脾细胞在不同条件下培养48小时。收集培养上清液，然后使用小鼠辅助性T细胞细胞因子检测试剂盒对13种目标因子的浓度进行定量。在不同刺激条件下，细胞因子表达谱的差异清晰可见。若操作得当，掌握该技术后，实验室操作部分可在五个半小时内完成。数据采集和下游分析所需时间将根据样本数量的不同而有所变化。观看本视频后，您应能够充分掌握如何应用该实验方案，利用基于流式细胞术的磁珠免疫分析方法对生物样本中的分析物浓度进行定量检测。该流程包括试剂配制、孵育步骤以及流式细胞仪的数据采集设置。

multiplex-cytokine-profiling-stimulated-mouse-splenocytes-using

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

细胞 Bead-based 免疫分析平台对受激小鼠脾多重细胞因子的研究

本实验方案描述了经刺激后可主动分泌IL-17的小鼠TH17淋巴细胞的检测与分离方法。...

检测与分离可存活的小鼠IL-17分泌型T细胞

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