替代方法 体外 病毒衣壳结构完整性的测定方法

这些方法的总体目标是进一步深入了解治疗对人诺如病毒衣壳感染性或完整性的效应。该方法有助于回答非包膜病毒灭活领域中的关键问题，例如，在特定处理后，病毒衣壳感染细胞的能力发生了何种变化。

这些方法的主要优势在于能够进一步揭示任何特定治疗手段对病毒作用的机制。尽管该方法可为人类诺如病毒的灭活策略提供见解，但也有可能应用于其他无包膜病毒，例如鼻病毒或甲型肝炎病毒。

首先，将纯化的人诺如病毒主要衣壳蛋白（在衣壳中组装）用1×磷酸盐缓冲液稀释至每毫升50微克。每个带盖的PCR管中加入的最大体积为15微升。

确保试管中含有至少600纳克的衣壳蛋白，并且每种处理配体组合对应600纳克的衣壳蛋白。接下来，将PCR仪预热至所需的加热处理温度。然后，将另一台PCR仪预热至4°C，用于立即冷却。

将装有衣壳溶液的带盖离心管放入热循环仪中，孵育所需时间。加热结束后，立即将离心管转移至预冷至4摄氏度的循环仪中，孵育5分钟。在离心机中短暂离心，使管壁上的所有液滴沉降至管底。

将处理后的衣壳溶液和 PBS 稀释至每毫升含三微克。确保稀释后的处理衣壳溶液至少有 200 微升。接下来，向每个孔中加入 100 微升衣壳溶液，每种处理至少设置两个孔。此外，每种配体分别设置两个对照孔，每孔加入 100 微升 PBS，用于测定实验的背景吸光度。用板盖盖住板子，并用石蜡膜密封边缘以减少蒸发。将板子置于摇床孵育器中，4 摄氏度过夜，或室温孵育两小时。

孵育结束后，从孔板中移除处理过的衣壳溶液。然后每孔加入200 µL封闭缓冲液，在室温下孵育2小时，或在4°C下密封过夜。

同时，用无核酸酶的水将生物素标记的适配体稀释至一微摩尔。确保每种处理所需的总体积为200微升，且溶液量充足。

此外，将选定的生物素化HPGA用封闭缓冲液稀释至每毫升30微升。同样，确保每种处理所需的总体积为200微升，并准备足够的溶液量。

孵育结束后，移除封闭缓冲液，并用200微升/孔的PBST洗涤平板三次。将平板倒置在无菌纸巾上轻拍，以吸干残留水分。随后，每孔加入100微升配体结合溶液，确保每种热处理-配体组合对应两个孔，在室温下将平板盖好后置于旋转摇床上，以约60 RPM振荡孵育一小时。

按照文本方案中所述清洗各孔后，每孔加入100微升PBS中的0.2微克/毫升链霉亲和素-辣根过氧化物酶。

在室温下，于轨道摇床上轻轻振荡孵育15分钟，然后再次洗涤各孔。随后，再进行一次洗涤，每孔加入100 µL TMB底物，显色5至15分钟。观察各孔颜色变化。

确保在重复实验的各块板之间保持一致的显色时间，并注意所用酶标仪的吸光度检测范围。每孔加入100 µL 1 M磷酸停止反应，随后立即在450 nm波长下读取吸光值。

按照文本方案中的详细说明，在DLS仪器软件中创建一个新的尺寸标准操作程序。然后，在软件中选择绿色运行箭头，并为样品命名。

将热处理后的病毒样颗粒（VLPs）在1×PBS中按1至10倍稀释，使其终浓度为每毫升5微克。然后使用孔径为1微米的滤膜过滤样品，以去除灰尘颗粒。动态光散射（DLS）对灰尘非常敏感，因为大颗粒散射的光远多于小颗粒。将50微升稀释后的VLPs转移至一次性微量比色皿中。将比色皿插入仪器的样品室。开始运行，并使用相关图累积量拟合和专家建议选项卡评估数据质量。在运行过程中，检查多分散指数值是否小于0.3，以确保测量质量合格。

在多视角标签页中，确保相关系数在短时间内保持恒定且接近但不超过1，而在较晚时间迅速降至零，这是粒径的特征。在测量过程中，使用专家建议标签页获取数据质量的反馈。测量完成后，再次检查多分散指数值小于0.3。

确保在累积量拟合标签页中，累积量拟合曲线与数据点高度吻合。按照文本方案中的说明，在DLS仪器软件中创建新的粒径标准操作程序。在软件中选择运行箭头，以打开并命名新样品，并让仪器达到温度平衡。

将VLP悬液转移至小体积石英比色皿中，避免产生气泡，并沿比色皿壁缓慢移液。待仪器达到温度平衡后，将比色皿插入样品室。等待10秒使样品温度平衡后，启动测量并同时开始计时。

在第一次测量结束时停止计时器。将此时间作为第一个时间点。后续时间点从软件记录的测量时间中获取。

进行热处理操作，步骤同前，但以 PBS 替代 10 毫摩尔 HEPES（pH 7.4），处理后不再稀释衣壳。接着，用移液器将全部 15 微升处理后的衣壳溶液滴加到石蜡膜上。用镊子夹住载网边缘，使镊子闭合并固定载网，将载网碳膜面朝下放置于处理后溶液液滴的上方。

将载网孵育10分钟，使衣壳结合到载网上。根据衣壳制备物的纯度，在处理过的衣壳液滴后，依次加入10至15微升的HEPES溶液液滴进行洗涤。孵育10分钟后，用载网拾取液滴。

将载网几乎垂直地接触一片滤纸，以吸去液滴。然后用载网蘸取10至15微升HEPES缓冲液液滴，保持30秒。经过30秒洗涤后，用另一片滤纸吸去液滴。

接下来，在空的石蜡膜上放置一滴15微升的2%醋酸铀酰溶液。用载网吸取醋酸铀酰液滴，静置45秒。然后用滤纸吸去醋酸铀酰溶液，确保去除大部分液体。

将网格的碳面朝上放置在一张滤纸上，注意避免网格粘附在镊子上的湿气。然后，将带有网格的滤纸放入敞口的玻璃培养皿中。对所有处理组重复此步骤后，将装有网格的培养皿半部置于干燥器中过夜干燥，以便后续使用透射电子显微镜（TEM）观察。

下图显示了人诺如病毒衣壳在68摄氏度处理下随时间推移其结合能力的降低情况。可以看出，HPGA结合信号是第一个完全消失的信号。此时可认为溶液中绝大多数衣壳已失去结合宿主细胞HPGA的能力，因而无法被细胞内化。

适体的结合方式与HBGA相似，尽管需要稍多的加热处理才能消除信号。此处显示的是代表高质量数据的DLS相关系数曲线。在接近零的时间点，相关图的值恒定在接近但低于1的水平。

随后，该值会急剧下降至零，其下降时间特征与颗粒大小相关。本实验所得的粒径结果可信度较高。相反，此相关系数曲线则代表了质量较差的数据。

相关图从高于1的值开始，逐渐下降至零。本实验的结果不应被采用。此处，粒径数据显示，在68摄氏度处理的衣壳呈现出明显的聚集特征，约20分钟后形成超大聚集体。

超级聚集发生的时间是VLPs对该处理方式敏感性的特征性指标。该图展示了人诺如病毒衣壳经加热处理后的透射电子显微镜（TEM）结果。此处，衣壳从左至右分别在60至80摄氏度下进行处理。

可以看出，随着衣壳发生聚集和变性，其形态随处理方式发生明显变化。在68摄氏度下处理0至25分钟的衣壳也观察到类似现象。

一旦掌握，这些技术若操作得当，可在1至24小时内完成。

该技术建立后，为食源性病毒学领域的研究人员探索人诺如病毒衣壳失活机制及其效应提供了新的途径。在完成本实验步骤后，还可进一步采用其他方法，如加或不加RNase预处理的实时RT-PCR、病毒衣壳的SDS-PAGE分析，以及利用可培养的替代病毒进行蚀斑实验，以更全面地评估特定处理后的病毒减量效果。观看本视频后，您应能够充分掌握如何运用配体结合实验、动态光散射技术和透射电子显微镜，深入揭示灭活处理对人诺如病毒衣壳作用的分子机制。

请注意，使用某些试剂可能存在危险，因此在进行本实验操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护装备并遵守实验室安全最佳实践。