替代体外测定病毒衣壳结构完整性的方法
November 16th, 2017
利用病毒基因组扩增的常规检测方法由于不能区分传染性的非传染性微粒而受到限制。本文的目的是提供的其他方法, 以帮助区分传染性病毒颗粒使用适结合, 动态光散射和透射电子显微镜详细的协议。
这些方法的总体目标是进一步了解治疗对人诺如病毒衣壳感染性或完整性的影响。这种方法可以帮助回答非包膜病毒灭活领域的关键问题。例如，在给定处理后，病毒衣壳感染细胞的能力发生了什么变化。
这些方法的主要优点是它们可以为任何给定治疗对病毒的作用提供额外的机制见解。虽然这种方法可以提供对人诺如病毒灭活策略的见解，但它也有可能应用于其他无包膜病毒，如鼻病毒或肝炎，A.To 开始稀释纯化的人诺如病毒主要衣壳蛋白，在 1X 磷酸盐缓冲盐水中组装成 50 μg/mL。在单个加盖的 PCR 管中使用最大体积为 15 μL。
确保试管中至少含有 600 纳克衣壳，并且每个处理配体组合含有 600 纳克衣壳。接下来，将热循环仪预热至所需的热处理。然后，将另一个热循环仪预热至 4 摄氏度以立即冷却。
将带有衣壳溶液的试管添加到热循环仪中所需时间。加热后，立即将试管转移到预冷的 4 摄氏度循环仪中 5 分钟。在离心机中短暂旋转试管，使所有液滴到达试管底部。
将处理过的衣壳溶液和 PBS 稀释至每毫升 3 微克。确保至少有 200 微升稀释的处理衣壳。接下来，向每个孔中涂抹 100 微升衣壳溶液，确保每次处理至少有两个孔。
此外，还包括两个对照孔，每个配体含 100 微升 PBS。这提供了测定的背景吸光度。用盖子盖住板，并用石蜡膜密封边缘以减少蒸发。
将板放在 4 摄氏度的振荡培养箱中过夜，或在室温下放置 2 小时。孵育后，从板中取出处理过的衣壳溶液。然后，每孔添加 200 微升封闭缓冲液。
在室温下孵育 2 小时或在 4 摄氏度下密封过夜。同时，在无核酸酶的水中将生物素化的适配体稀释至一微摩尔。确保每次处理有足够的溶液，总共 200 微升。
此外，在封闭缓冲液中将所选的生物素化 HPGA 稀释至 30 μL/mL。同样，确保每次处理有足够的溶液容纳 200 微升的总体积。孵育后，去除封闭缓冲液，用每孔 200 微升 PBST 洗涤板 3 次。
用无菌纸巾将板子倒置拍打，以擦干残留的水分。接下来，以每孔 100 微升的配体结合溶液确保每个热处理配体组合有两个孔，在室温下将覆盖的板在轨道振荡器上以约 60 RPM 的温度孵育 1 小时。按照文本方案中的说明洗涤孔后，每孔添加 100 微升链霉亲和素、辣根过氧化物酶和 PBS 0.2 微克/毫升。
在室温下孵育 15 分钟，在轨道摇床上轻轻摇动，然后再次清洗孔。然后，在另一次洗涤后，每孔添加 100 μL 的 TMB 底物，让颜色显色 5 至 15 分钟。观察井的颜色。
确保在重复板之间始终保持相同的显影时间，并注意所用读板器的吸光度范围。用每孔 100 μL 的 1 摩尔磷酸终止反应的发展。立即读取 450 纳米的印版。
在 DLS 仪器软件中创建新的尺寸标准作程序，如文本协议中所述。然后，选择软件中的绿色运行箭头并命名样品。在 1X PBS 中将热处理过的病毒样颗粒或 VLP 稀释 1 至 10 倍，最终浓度为 5 μg/mL。
然后，用 1 微米孔径过滤样品以去除灰尘颗粒。DLS 对灰尘非常敏感，因为大颗粒比小颗粒散射的光要多得多。将 50 微升稀释的 VLP 转移到小体积的一次性比色皿中。
将比色皿插入仪器的样品室。开始运行并使用 correlogram cumulant fit 和 expert advice 选项卡来评估数据质量。在运行期间，检查指数值的多边形分散度是否小于 0.3，表示质量测量。
在多视图选项卡中，确保相关系数是恒定的，并且在短时间内接近但不超过 1，并在稍后急剧下降到零，这是颗粒大小的特征。使用专家建议选项卡获取有关测量期间数据质量的反馈。测量完成后，再次检查指数值的多分散度是否小于 0.3。
确保累积量拟合线紧贴 cumulants fit（累积量拟合）选项卡中的数据点。在 DLS 仪器软件中创建新的尺寸标准作程序，如文本方案中所述。选择软件中的运行箭头以打开并命名新样品，并让仪器达到温度平衡。
将 VLP 悬浮液转移到小体积石英比色皿中，避免气泡，并缓慢移液靠着比色皿壁。仪器达到温度平衡后，将比色皿插入样品室。等待 10 秒让样品温度达到平衡后，开始运行并同时启动计时器。
在第一次测量结束时停止计时器。以此时间为第一个时间点。从软件记录的测量时间中获取后续时间点。
像以前一样进行热处理，除了用 PBS 代替 10 毫摩尔堆，pH 7.4，并且处理后不要进一步稀释衣壳。接下来，将整个 15 微升处理过的衣壳溶液滴到石蜡膜上。用镊子抓住网格边缘，让它们在边缘闭合以固定网格，并将网格碳面朝下放在处理过的溶液液滴的顶部。
让网格孵育 10 分钟，让衣壳附着在网格上。根据衣壳制备物的纯度，以 10 至 15 微升液滴的形式加入堆溶液的洗涤液，在处理过的衣壳液滴后排成一行。10 分钟后，捡起带有液滴的网格。
将网格几乎垂直于一张滤纸，以吸走液滴。然后，使用网格捡起 10 至 15 微升堆缓冲液的液滴并保持 30 秒。洗涤 30 秒后，用另一张滤纸吸走。
接下来，将 15 微升的 2% 乙酸铀酰溶液液滴放在石蜡膜上的空白区域。用网格捡起乙酸铀酰液滴并保持 45 秒。然后，吸走乙酸铀酰，确保去除大部分溶液。
将网格碳面朝上放在一张滤纸上，小心不要让网格粘在镊子上的水分上。然后，将带有网格的滤纸放入打开的玻璃培养皿中。对所有处理重复此过程后，将带有网格的培养皿半部分放入干燥器中干燥过夜，然后再用 TEM 观察。
下图显示了在 68 摄氏度下处理时，人诺如病毒衣壳的结合能力随时间推移而降低。可以看出，HPGA 结合是第一个完全消失的信号。此时，假设溶液中的绝大多数衣壳已经失去了结合宿主细胞 HPGA 的能力，因此不能内化到细胞中。
适配子结合与 HBGA 的结合相同，但需要稍多的热处理才能去除信号。此处显示的是代表高质量数据的 DLS 相关系数曲线。在时间接近零时，相关图在接近但低于 1 的值处是常数。
然后，它在颗粒大小特征的时间急剧下降到零。该实验的 Size 结果可能是可信的。相反，此相关系数曲线代表质量差的数据。
相关图从大于 1 的值开始，然后逐渐下降到 0。不应使用本实验的结果。在这里，粒度数据显示了在 68 摄氏度下处理的衣壳的清晰聚集曲线，大约 20 分钟后形成超级聚集体。
超级聚集发生的时间是 VLP 对该处理的敏感性的特征。该图可视化了人诺如病毒衣壳热处理的 TEM 结果。在这里，衣壳在从左到右 60 到 80 摄氏度的温度下进行处理。
可以看出，衣壳形态会随着衣壳的聚集和变性而随着处理而明显改变。在 68 摄氏度下处理 0 到 25 分钟的衣壳也出现了类似的现象。一旦掌握了这些技术，如果执行得当，可以在 1 到 24 小时内完成。
开发后，该技术为食品病毒学领域的研究人员提供了探索灭活对人类诺如病毒衣壳的机制和影响的额外途径。按照此程序，可以进行其他方法，如有和没有 RNase 预处理的实时 RT-PCR、病毒衣壳的 STS 页面以及具有可培养替代病毒的噬菌斑测定，以获得给定处理后病毒减少的更完整的整体视图。观看本视频后，您应该对如何利用配体结合、动态光散射和透射电子显微镜来进一步了解灭活处理对人诺如病毒衣壳影响的机制见解。
不要忘记，使用某些使用的试剂可能很危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护设备和遵循实验室安全最佳实践。
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概述
本文介绍了区分传染性和非传染性诺如病毒颗粒的替代方法。讨论的技术包括适配子结合、动态光散射和透射电子显微镜。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 传染病研究
- 病毒失活策略
背景
- 当前的病毒基因组扩增方法无法区分传染性和非传染性颗粒。
- 了解人类诺如病毒的传染性对公共健康至关重要。
- 非包膜病毒在检测和失活方面提出了独特的挑战。
- 对病毒衣壳完整性的机制洞察对于开发有效的治疗方法至关重要。
研究目的
- 提供区分传染性诺如病毒颗粒的协议。
- 增进对治疗对病毒传染性影响的理解。
- 探索对其他非包膜病毒的潜在应用。
使用的方法
- 适配子结合技术。
- 用于粒子表征的动态光散射。
- 用于可视化病毒颗粒的透射电子显微镜。
- 纯化人类诺如病毒主要衣壳蛋白的制备。
主要结果
- 建立了详细的传染性颗粒区分协议。
- 获得了对治疗对病毒衣壳完整性影响的洞察。
- 这些方法显示出对其他非包膜病毒的潜在适用性。
- 增强了对病毒失活机制的理解。
结论
- 提出的方法为诺如病毒研究提供了重大进展。
- 这些技术可以为病毒失活策略提供信息。
- 未来的应用可能扩展到其他病毒，改善公共卫生响应。
常见问题
Executive Industry Relevance
Discriminating infectious from non-infectious viral particles is a critical challenge in virology and biopharma R&D, especially for non-enveloped viruses like norovirus where standard nucleic acid amplification cannot assess infectivity. Integrating aptamer binding, dynamic light scattering, and electron microscopy enables mechanistic de-risking of inactivation strategies and supports predictive confidence in viral reduction workflows. These capabilities are essential for robust evaluation of antiviral interventions and for risk-adjusted advancement of candidate treatments in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of viral capsid integrity post-treatment to clarify mechanisms of inactivation.
- Supports biological de-risking by distinguishing between structurally intact and compromised viral particles.
- Improves predictive confidence in target validation for antiviral strategies.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated viral capsid systems for downstream infectivity assays.
- Enables assay standardization and reproducibility through quantitative aptamer binding and DLS outputs.
- Supports screening readiness by providing orthogonal readouts of capsid integrity and aggregation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanistic insights with translational biomarker development for viral inactivation efficacy.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by linking structural integrity to infectivity potential.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on comprehensive capsid integrity data.
Pipeline & Workflow Integration
These methods position within the discovery-to-preclinical continuum, bridging mechanistic evaluation of viral inactivation with quantitative assay development and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on capsid disruption and infectivity loss post-treatment.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative measurements of ligand binding and particle size for assay development.
- Analytics: Provides statistical outputs and visual confirmation of capsid integrity for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vitro structural data to preclinical infectivity models when supported by orthogonal assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating inactivation strategies across multiple non-enveloped viruses.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in viral inactivation studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of capsid integrity assessments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency by clarifying infectivity status early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antiviral candidates based on robust mechanistic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology, aptamer chemistry, DLS, and electron microscopy.
- Needs access to specialized instrumentation and analytical infrastructure for DLS and TEM.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and data interpretation protocols.
- Adaptation across different viral model systems may require protocol optimization.
- Limitations include non-specific aptamer binding, DLS sample purity requirements, and TEM sensitivity constraints.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:49
Plate-based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure
4:44
Dynamic Light Scattering (DLS) Detecting Virus Aggregation After Heat Treatment
6:32
DLS for Detecting Virus Aggregation in Real Time
7:29
Transmission Electron Microscopy (TEM) Sample Preparation
9:34
Results: Reduction of Human Norovirus Capsid Stability After Heating
11:36
Conclusion
