Name: 替代体外测定病毒衣壳结构完整性的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: 学习利用适配体结合、动态光散射和透射电子显微镜区分感染性诺如病毒颗粒的方法。该技术为研究病毒衣壳结构完整性和病毒灭活机制提供了重要工具。

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本研究由美国农业部国家食品与农业研究所通过诺如病毒核心研究项目（NoroCORE）资助，项目编号为农业与食品研究倡议竞争性拨款 2011-68003-30395。开放获取费用由美国农业部提供资助。我们感谢 Robert Atmar（德克萨斯州休斯顿市贝勒医学院）慷慨提供纯化的衣壳，感谢 Valerie Lapham 在透射电子显微镜（TEM）图像方面的协助。我们还感谢 Frank N. Barry 在开展本研究中所展示的实验工作方面提供的帮助。

1. 基于平板的结合实验用于评估诺如病毒衣壳高级结构的丧失
注意：与此处所述非常相似的ELASA方案已有发表29，类似的ELASA检测此前已在其他研究文章中报道过17,18,22。
<ol>
	<li>人诺如病毒GII.4 Sydney衣壳的热处理
	<ol>
		<li>获取纯化的GII.4 Sydney型（登录号：JX459908）人诺如病毒主要衣壳蛋白（VP1），该蛋白已组装成衣壳结构。 
		注：本研究中使用的衣壳由 R. Atmar（贝勒医学院，休斯顿，德克萨斯州）惠赠。</li>
		<li>将衣壳稀释至50 µg/mL，溶于1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）中，分装至单个带盖PCR管，每管最大体积为15 µL。确保每管中含有至少600 ng衣壳。确保每种处理-配体组合对应600 ng衣壳。</li>
		<li>将热循环仪预热至所需的热处理温度。 
		注意：本实验方案选择在 68 °C 下处理不同时间（0 - 25 分钟）。</li>
		<li>将另一台热循环仪预冷至 4 °C 以用于立即冷却。将含有衣壳溶液的管子放入热循环仪中，孵育所需时间。加热结束后，立即转移至预冷的 4 °C 热循环仪中，孵育 5 分钟。
		<ol>
			<li>将95 °C处理5分钟作为变性衣壳对照。以未经处理（23 °C）的衣壳溶液作为阳性对照。以不含衣壳的PBS作为额外的阴性对照。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>短暂离心以使所有液滴沉降至管底，用PBS将处理后的衣壳溶液稀释至3 µg/mL。确保稀释后的处理衣壳溶液至少有200 µL（每孔100 µL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每个孔中加入100 µL衣壳溶液，确保每种处理至少设置两个孔。此外，每种配体分别设置2个对照孔，每孔加入100 µL PBS，用于测定实验的背景吸光度。用盖子盖好板子，边缘用石蜡膜密封以减少蒸发，于4 °C振荡孵育过夜，或在室温下振荡孵育2小时。</li>
	<li>将脱脂奶粉按5%（w/v）加入含0.05% Tween 20的PBS缓冲液（PBST）中，配制封闭液。</li>
	<li>从孔板中移除处理过的衣壳溶液。每孔加入 200 µL 封闭缓冲液，在室温下孵育 2 小时，或在 4 °C 密封孵育过夜。</li>
	<li>制备生物素化适配体M6-2的配体结合溶液18,29 以及生物素标记的合成 HBGA 血型 A 或生物素标记的 H 型。
	<ol>
		<li>将生物素标记的适配体用无核酸酶水稀释至1 µM。确保每种处理有足够的溶液，总体积为200 µL。将选定的生物素标记HBGA用封闭缓冲液稀释至30 µg/mL。确保每种处理有足够的溶液，总体积为200 µL。 
		注意：为减少HBGA用量，可使用含0.25%脱脂奶粉-PBST的10 µg/mL HBGA替代。生物素化M6-2和HBGA的浓度均已在此前研究中优化并报道。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除封闭缓冲液，用 200 µL/孔 PBST 洗涤平板 3 次。将平板倒置在无菌纸巾上轻拍，以吸干残留水分。</li>
	<li>每孔加入 100 µL 配体结合溶液，确保每种热处理-配体组合对应两个孔。将酶标板盖上盖子，在室温下置于摇床中，以约 60 rpm 振荡孵育 1 小时。 
	注意：每种配体均需分别设置2个未处理衣壳和完全变性衣壳的孔，作为阳性对照和阴性对照。此外，还需设置2个 &#34;无衣壳&#34; 每个配体设置复孔作为平板背景对照。</li>
	<li>移除配体溶液，用 200 µL/孔 PBST 洗涤 3 次。将板倒置在无菌纸巾上，吸干残留水分。</li>
	<li>每孔加入 100 µL 含 0.2 µg/mL 链霉亲和素-辣根过氧化物酶的 PBS 溶液。在室温下于旋转摇床上轻轻振荡孵育 15 分钟。 
	注意：不同的链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物浓度各不相同。请查阅产品说明书，了解该酶在ELISA应用中的理想浓度范围，并确保所用浓度处于最佳条件。</li>
	<li>移除结合物溶液。用 200 µL/孔 PBST 洗涤 3 次。将酶标板倒置于无菌纸巾上，吸干残留液体。</li>
	<li>每孔加入 100 µL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物，显色 5–15 分钟。观察阴性对照孔是否有显色，并确保重复板之间的显色时间保持一致。同时需注意所用酶标仪的吸光度检测范围。 
	注意：显色时间可能因所用配体/试剂的质量不同而有所差异。</li>
	<li>用每孔100 µL的1 M磷酸终止反应。立即在450 nm读取酶标板，保存数据。 
	注意：加入酸通常会显著减缓反应，但不会完全终止反应。在读取吸光度之前，不要将终止后的反应板放置过长时间。</li>
</ol>
2. 基于平板检测结果的分析
<ol>
	<li>将原始吸光度数据保存在电子表格程序中。计算每对经特定处理和配体作用的孔的平均吸光度值，并在所有后续分析中使用这些平均值。 
	注意：比较每对孔的吸光度值，以确保没有孔对之间的数值存在显著差异。</li>
	<li>为分析衣壳完整性的绝对值（全部结合），从所有其他样品的吸光度值中减去&#34;无衣壳&#34;对照组的原始吸光度。 
	注意：也可直接分析因高级结构（二级、三级、四级结构）丧失而导致的结合能力下降。此时不减去阴性对照（无衣壳）的吸光度，而是减去完全变性衣壳对照组的吸光度值。这种方法可消除装置非特异性结合以及衣壳序列介导结合所产生的信号。HBGA 和适配体 M6-2 对完全变性的衣壳结合极少，因此两种方法结果相似。在选择分析方法时，必须考虑由适配体非特异性结合引起的假阳性信号。</li>
	<li>使用经阴性对照或变性对照校正后的吸光度值，将各处理组的吸光度除以其相应的阳性对照（无处理）吸光度，再乘以 100。由此得到处理组衣壳相对于未处理对照组的信号百分比。</li>
	<li>为估算每种配体结合信号中由衣壳序列贡献的部分，先从初始吸光度中减去&#34;无衣壳&#34;阴性对照的吸光度，再获取变性衣壳的校正后吸光度值。将该值除以阳性对照信号的校正后吸光度，再乘以 100。此结果表示配体与变性衣壳/衣壳序列结合所产生的表观信号百分比。</li>
</ol>
3. 热处理后利用动态光散射检测病毒聚集
注意：以下步骤可能特定于所使用的软件和仪器，但可进行调整并适用于类似设备。
<ol>
	<li>在DLS仪器软件中使用以下参数创建一个新的尺寸SOP：材料 = 蛋白质，分散剂 = PBS，温度 = 25 °C，平衡时间 = 0 秒，比色皿类型 = 一次性比色皿（小体积，ZEN0040），测量角度 = 173°背向散射，测量时长 = 自动，测量次数 = 3次，测量间延迟 = 0 秒，数据处理：分析模型 = 通用模式（正常分辨率）。其余所有参数采用默认设置。</li>
	<li>在软件中点击绿色运行箭头，并为样品命名。</li>
	<li>按照步骤1.1.1至1.1.4对VLPs进行热处理。</li>
	<li>将热处理后的VLPs用1×PBS稀释10倍，终浓度为5 µg/mL。（可选）使用孔径1 µm的滤膜过滤样品以去除灰尘颗粒；DLS对灰尘非常敏感，因为大颗粒散射的光远强于小颗粒。</li>
	<li>将50 µL稀释后的VLPs转移至小体积一次性比色皿中。将比色皿插入仪器的样品室。</li>
	<li>开始运行，并使用“相关图”、“累积量拟合”和“专家建议”标签页评估数据质量。
	<ol>
		<li>运行过程中，检查多分散指数值是否小于0.3，该值表示测量质量良好。&#160; 在“多视图”标签页中，确保相关系数在短时间接近但不超过1，并在较长时间迅速下降至0，这是颗粒尺寸的典型特征。使用“专家建议”标签页在测量过程中获取数据质量反馈。</li>
		<li>测量完成后，再次确认多分散指数值小于0.3。在“累积量拟合”标签页中，确保累积量拟合曲线与数据点高度吻合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取每次测量报告的Z平均粒径的平均值作为各样品的颗粒尺寸。绘制粒径（nm）随温度（°C）变化的曲线图。</li>
</ol>
4. 实时检测病毒聚集的动态光散射技术
注意：以下步骤可能特定于所使用的软件和仪器，但可进行调整并适用于类似设备。
<ol>
	<li>在DLS仪器软件中使用以下参数创建新的尺寸SOP：材料 = 蛋白质，分散剂 = PBS，温度 = 按需设定，平衡时间 = 0秒，样品池类型 = 石英比色皿，测量角度 = 173°背向散射，测量时长 = 自动，测量次数 = 50（可根据聚集速率适当增加或减少），测量间延迟 = 0秒，数据处理：分析模型 = 多个窄峰模式（高分辨率）。其余参数均采用默认设置。</li>
	<li>在软件中点击运行箭头以打开并命名新样品，并让仪器达到温度平衡。</li>
	<li>在微量离心管中将VLPs悬浮于1X&#160;PBS中，浓度为5 µg/mL，体积介于200 - 500 µL之间。涡旋混匀悬浮液。</li>
	<li>将VLPs悬浮液在台式离心机中离心5 - 10秒以脱气。此步骤有助于防止在加热处理过程中产生气泡，从而干扰尺寸测量。</li>
	<li>将VLPs悬浮液转移至小体积石英比色皿中——避免产生气泡，并沿比色皿壁缓慢移液。待仪器达到温度平衡后，将比色皿插入样品室。</li>
	<li>等待10秒使样品温度平衡，然后开始运行。在运行开始时启动计时器，并在第一次测量结束时停止计时。将该时间记为第一个时间点。后续时间点根据软件记录的测量时间确定。</li>
	<li>开始运行，并监控相关函数图、分布拟合曲线及专家建议，以评估数据质量。 
	注意：由于样品在聚集过程中预期为多分散体系，因此PDI值不一定小于0.3。
	<ol>
		<li>确保相关系数在短时间范围内恒定且接近但不超过1，并在一个或多个较晚时间点迅速下降，这是颗粒尺寸的典型特征。</li>
		<li>确保分布拟合曲线与数据点高度吻合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析尺寸数据。
	<ol>
		<li>根据每次测量与初始时间点之间的时间差确定各个时间点。各次测量的持续时间并不完全相同。</li>
		<li>基于强度分布，记录每次测量/时间点中面积最大的峰所对应的尺寸。</li>
		<li>绘制峰直径（nm）随时间（min）变化的曲线图。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 透射电镜样品制备
<ol>
	<li>获取专为透射电子显微镜（TEM）设计的碳支持膜（镍）载网。 
	注意：请咨询核心设施，了解推荐使用的试剂及其在该设施显微镜下的操作规范。务必将来载网存放在含有干燥剂的盒子或真空容器中，以尽量减少暴露于湿气。</li>
	<li>撕取约 5 cm × 5 cm 的滤纸片。准备玻璃培养皿和专用于显微镜操作的自闭合反向镊子。</li>
	<li>剪取约 2.5 cm × 5 cm 的石蜡膜，平铺于实验台面上。</li>
	<li>诺如病毒 GII.4 Sydney 衣壳的热处理
	<ol>
		<li>除以下修改外，其余步骤严格按照上文 1.1.1–1.1.5 所述操作：使用 10 mM HEPES（pH 7.4）代替 PBS 进行处理，处理后不再稀释衣壳（保持溶液浓度为 50 µg/mL）。将处理后的全部约 15 µL 液滴转移至石蜡膜上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用镊子夹住载网边缘，使其闭合并固定载网，将载网碳膜面向下放置于处理液滴上。孵育 10 分钟，使衣壳吸附至载网。
	<ol>
		<li>根据衣壳制备物的纯度，如有需要，可在处理后的液滴后方依次添加 10–15 µL 的 10 mM HEPES 溶液进行洗涤。</li>
		<li>10 分钟后，用镊子夹起带有液滴的载网，将其近乎垂直地接触滤纸，以吸除液滴。随后用载网吸取 10–15 µL HEPES 缓冲液，保持 30 秒，再用另一张滤纸吸除，完成洗涤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在石蜡膜的空白区域放置 15 µL 的 2% 醋酸铀酰溶液液滴。
	<ol>
		<li>用载网吸取醋酸铀酰液滴，保持 45 秒。吸除醋酸铀酰溶液，确保大部分液体被去除。将载网碳膜面向上放置于滤纸上，操作时需小心，避免载网因镊子上的湿气而&#34;粘连&#34;。将带有载网的滤纸放入敞口的玻璃培养皿中。 
		注意：请勿使用塑料培养皿，因为载网会因静电吸附而粘附在塑料皿上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对所有处理组重复上述步骤。将放置载网的培养皿半片置于干燥器中过夜干燥，随后用于 TEM 观察。</li>
	<li>请咨询所在机构的显微镜设施，了解已制备载网的观察流程。部分设施允许用户接受其仪器操作培训。具体显微镜的设置与观察细节不在本文讨论范围内。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的方案与技术可用于评估人诺如病毒衣壳的完整性与功能。这些方法有助于深入理解灭活处理对病毒的作用机制，并有望补充传统的灭活评估手段，如逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）或蚀斑试验。例如，仅通过蚀斑试验评估化学或物理灭活效果时，虽可反映病毒灭活程度，但无法揭示其灭活的具体机制。此外，病毒聚集可能导致滴度被低估，从而高估处理方法的有效性。30这些方法可通过提供有关治疗对诺如病毒衣壳完整性的效应信息，进一步为这类研究提供参考。最近，两项 体外 已报道了人诺如病毒的细胞培养方法5,6；这些方法仍然依赖 PCR 进行病毒计数，尽管从理论上讲，所提出的类器官模型可通过抗体染色用于测定相对减少量的 TCID50。本文所述方法可能有助于理解多种不同处理方式（而不仅仅是热处理）下病毒灭活的完整机制。例如，在确定诺如病毒在铜表面灭活机制时，已将基于平板的配体结合实验和透射电子显微镜（TEM）作为补充工具，与 RT-qPCR 和蚀斑实验数据结合使用。<sup cl...

全球范围内，人诺如病毒造成了重大的公共卫生负担，每年导致约6.85亿例疾病和21.2万例死亡1，经济损失达数十亿美元2,3。目前，诺如病毒的检测与定量主要依赖基因组扩增和/或基于配体的检测平台。其中，基因组扩增方法通常更受青睐，因其灵敏度更高，可提供定量信息，且假阳性结果的风险总体较低4。最常用的人诺如病毒检测与定量基因组扩增技术是逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）。由于该技术仅针对并扩增人诺如病毒基因组的一小段区域，单独使用RT-qPCR无法区分具有感染性的病毒颗粒与无感染性的病毒颗粒，因为游离的基因组RNA、含有完整基因组但衣壳受损的颗粒，以及基因组发生致死性突变或截短的衣壳仍可被RT-qPCR扩增。尽管近期已报道两种新型的人诺如病毒in vitro培养技术5,6，但二者仍依赖RT-qPCR进行病毒定量，目前尚不具备在临床或环境样本中常规检测人诺如病毒的可行性。因此，RT-qPCR仍是临床和环境检测的金标准。
其他 体外 已开发出多种方法以更准确地评估诺如病毒颗粒的感染性状态。这些方法通常可分为针对诺如病毒衣壳完整性的方法和评估基因组完整性的方法，其中前一类方法更为常用。一种常用的技术是在提取病毒基因组RNA之前进行RNase预处理，但该方法无法识别那些虽保持完整却丧失了结合宿主受体/辅因子能力的病毒颗粒，也无法检测基因组发生致死性突变、截短或轻微损伤的病毒颗粒。7衣壳完整性还可通过病毒与人诺如病毒共受体/辅助因子结合的能力来评估，这些共受体/辅助因子是称为组织血型抗原（HBGAs）的碳水化合物。HBGAs 作为糖蛋白或糖脂的组成部分存在于宿主肠上皮细胞中（也存在于多种其他组织中），并可能分泌于唾液等体液中。已有研究表明，表面含有类似 HBGA 物质的肠道细菌也可与人诺如病毒结合。8,9,10，此类相互作用可能促进诺如病毒感染5利用HBGA结合的基本概念在于，只有能够结合假定受体/共因子的病毒颗粒才具备感染细胞的能力。多项研究表明，在核酸扩增之前采用基于磁珠的HBGA结合方法，是一种具有前景的病毒传染性鉴别手段11,12,13,14,15,16关于HBGAs的一个主要挑战是，单一类型的HBGA无法结合所有人诺如病毒基因型。为解决这一问题，出于合成简便性、一致性和降低成本的考虑，已使用含有HBGAs的猪胃黏蛋白替代纯化的HBGA碳水化合物。
摩尔近期发表的一篇论文 等17 引入了一组用于评估人诺如病毒衣壳完整性的新技术。取代HBGAs，摩尔 等17 研究了广谱反应性核酸适配体（M6-2）的结合特性18 广谱反应性单克隆抗体（NS14）19 对热处理的GII.4 Sydney诺如病毒衣壳（病毒样颗粒或VLPs）进行结合，并将其与合成的HBGAs结合情况进行比较。核酸适配体是一类短的（约20–80 nt）单链核酸（ssDNA或RNA），其序列可折叠形成独特的三维结构，从而与特定靶标结合。由于适配体本质上是核酸，因此成本较低，易于化学合成、纯化和修饰，并且具有良好的热稳定性。目前已有多项针对诺如病毒开发的适配体研究报道，其中部分适配体显示出对多种毒株的广谱反应性18,20,21,22例如，Moore 等17 证明了适配体M6-2能够结合纯化的人诺如病毒衣壳（VLPs），并在依赖病毒衣壳维持高级结构方面表现出与HBGA相似的行为例如， 二级和三级）蛋白质结构才能发生结合。另一方面，在衣壳完全变性后，仍有相当比例的诺如病毒VLP与抗体NS14保持结合。Moore等在研究中对诺如病毒结合能力的评估 等17 采用一种基于微孔板的简单方法进行检测，该方法类似于ELISA，不同之处在于使用适配体（aptamers）替代抗体（因此该方法被称为ELASA）。这种高通量实验方法被用于评估不同处理方式对诺如病毒衣壳的影响，相关研究对于理解病毒在物理或化学应激因素作用下的失活机制具有重要价值。然而，该方法的一个缺点是灵敏度较低，且对基质中较高浓度的污染物耐受性差，这些污染物可导致适配体发生非特异性结合。
Moore et al.17 采用另一种方法——动态光散射（DLS）来监测病毒颗粒在热处理下的聚集情况。DLS 通常用于评估纳米颗粒悬浮液的尺寸，并已扩展应用于蛋白质23,24 和病毒25,26,27。溶液中颗粒散射光的强度随颗粒尺寸变化而波动，从而可通过已建立的公式计算扩散系数，进而推导出颗粒直径。DLS 技术可分辨分散颗粒的流体动力学直径，精度可达纳米级，因此可根据尺寸检测分散的病毒、单个衣壳蛋白或二聚体以及病毒聚集体27。病毒聚集表现为颗粒尺寸增大，提示衣壳完整性丧失。当衣壳发生变性且其结构被破坏时，疏水残基暴露，导致颗粒相互黏附并形成聚集体。DLS 可用于测定特定处理后的颗粒尺寸，或实时监测聚集动力学17,28。该方法的优势在于可观察衣壳在溶液中的行为，但需要高浓度的纯化衣壳，这可能无法完全代表病毒在天然状态下的情况。
Moore 等17 采用的最后一种方法是透射电子显微镜（TEM）。尽管该方法灵敏度较低，且无法提供定量数据，但它能够直观显示不同处理对病毒衣壳结构的影响。虽然这些方法目前尚不适用于临床或环境场景，但联合使用这些方法对于理解人诺如病毒的灭活机制具有重要价值。本文旨在提供基于平板的结合分析法（ELASA）、动态光散射（DLS）以及TEM样品制备方法的详细实验方案，用于研究热处理对诺如病毒衣壳的影响，特别是这些处理对衣壳完整性的效应，如Moore 等17 所述。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;用于评估诺如病毒衣壳高级结构丧失的基于平板的结合实验&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔中等结合力聚苯乙烯EIA板</td><td>Fisher (Costar)</td><td>07-200-36</td><td></td></tr><tr><td>96孔板盖</td><td>Thermo Fisher</td><td>3098</td><td></td></tr><tr><td>石蜡膜（Parafilm）</td><td>Thermo Fisher</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>1× PBS（pH 7.2）</td><td>Life Technologies</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>聚山梨酯20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>1× PBS（pH 7.2）+ 0.05% 聚山梨酯20</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>纯化并组装的人诺如病毒GII.4衣壳</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>单个0.2 ml PCR管</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-154G</td><td></td></tr><tr><td>2台热循环仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>台式迷你离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-006-901</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉固体成分</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0031B</td><td></td></tr><tr><td>合成组-血型A二糖（生物素标记）</td><td>Glycotech</td><td>01-017</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的适配体M6-2（储存浓度100 &amp;micro;M，溶于无核酸酶水）：5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物（ELISA级），我们使用Life Technologies SNN2004</td><td>Life Technologies</td><td>SNN2004</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;,5,5&amp;rsquo;-四甲基联苯胺（TMB）底物，室温</td><td>Thermo Fisher</td><td>50-76-00</td><td></td></tr><tr><td>1 M磷酸</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>可读取450 nm吸光度的微孔板读数仪</td><td>Tecan</td><td>Infinite m200 Pro</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;基于平板实验结果的分析&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel或类似软件</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;动态光散射实验&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer ZSP，或类似的粒径分析仪器</td><td>Malvern Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Fisher Scientifc</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>石英比色皿</td><td>Hellma</td><td>104-002-10-40</td><td></td></tr><tr><td>小体积一次性比色皿（以减少VLP使用量）</td><td>Malvern Instruments</td><td>ZEN0040</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;透射电子显微镜样品制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带碳支持膜的镍质电子显微镜载网</td><td>Ladd Research</td><td>10880-100</td><td></td></tr><tr><td>自闭式反向电子显微镜镊子</td><td>Ted Pella</td><td>5372-NM</td><td></td></tr><tr><td>定性滤纸</td><td>Sigma-Aldrich (Whatman)</td><td>WHA1002055</td><td></td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455743</td><td></td></tr><tr><td>100 mM HEPES储备液（pH 7.2）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2% 醋酸铀</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

替代方法 体外 病毒衣壳结构完整性的测定方法

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

人类诺如病毒在全球范围内造成了重大的公共卫生和经济损失。新兴 体外 培养技术的进步目前尚不能用于病毒的常规检测。现有的检测与定量技术主要依赖核酸扩增，无法区分具有感染性的与无感染性的病毒颗粒。本文旨在详细介绍近年来多种技术联合应用的最新进展，以获取有关病毒颗粒感染状态的更多信息。其中一种技术是评估诺如病毒单链DNA适配体与衣壳的结合情况。适配体具有易于合成和修饰、成本低且稳定性好的优点。另一种技术是动态光散射（DLS），其优势在于可观察衣壳在溶液中的行为。电子显微镜则可用于观察病毒衣壳结构完整性的可视化。尽管这些技术前景良好，但各自仍存在局限性，例如适配体可能非特异性地结合样品基质中带正电荷的分子，DLS需要纯化的衣壳，而电子显微镜的灵敏度较低。然而，当这些技术联合使用时，所产生的综合数据可更全面地反映诺如病毒衣壳的完整性，进而推断其感染性，这对于准确评估病毒灭活方法或解读病毒检测结果至关重要。本文提供了利用这些方法区分感染性人诺如病毒颗粒的实验方案。

关键词：诺如病毒，衣壳完整性，感染性，适配体，动态光散射，电子显微镜，检测，灭活评估

人类诺如病毒GII.4悉尼株衣壳（VLPs）的结构完整性通过多种新方法进行了评估，如Moore et al.17所介绍。首先进行了一项实验，比较了衣壳结合潜在受体/辅因子（HBGA）或单链DNA适配体（M6-2）的能力随其结构完整性的变化情况（图1）。所展示的结果此前已由Moore et al.17报道，表明在68 °C热处理不同时间后，适配体M6-2与衣壳的结合行为与病毒与HBGA的结合行为相似。尽管HBGA结合信号的丧失略早于适配体M6-2，但在将VLPs暴露于65 °C和68 °C不同时间点后计算得出，M6-2的信号衰减速率与HBGA相似（表1）17。这表明HBGA和适配体M6-2的结合均以类似的方式被消除。
<p class="jove_content" fo:keep-together...

利用病毒基因组扩增的常规检测方法受限于无法区分具有感染性与非感染性的病毒颗粒。本文旨在提供详细的实验方案，介绍利用适配体结合、动态光散射和透射电子显微镜等替代方法，以辅助区分具有感染性的诺如病毒颗粒。

人类诺如病毒在全球范围内造成了重大的公共卫生和经济损失。尽管体外培养技术取得了新进展，但目前尚无法用于常规……

这些方法的总体目标是进一步深入了解治疗对人诺如病毒衣壳感染性或完整性的效应。该方法有助于回答非包膜病毒灭活领域中的关键问题，例如，在特定处理后，病毒衣壳感染细胞的能力发生了何种变化。这些方法的主要优势在于能够进一步揭示任何特定治疗手段对病毒作用的机制。尽管该方法可为人类诺如病毒的灭活策略提供见解，但也有可能应用于其他无包膜病毒，例如鼻病毒或甲型肝炎病毒。首先，将纯化的人诺如病毒主要衣壳蛋白（在衣壳中组装）用1×磷酸盐缓冲液稀释至每毫升50微克。每个带盖的PCR管中加入的最大体积为15微升。确保试管中含有至少600纳克的衣壳蛋白，并且每种处理配体组合对应600纳克的衣壳蛋白。接下来，将PCR仪预热至所需的加热处理温度。然后，将另一台PCR仪预热至4°C，用于立即冷却。将装有衣壳溶液的带盖离心管放入热循环仪中，孵育所需时间。加热结束后，立即将离心管转移至预冷至4摄氏度的循环仪中，孵育5分钟。在离心机中短暂离心，使管壁上的所有液滴沉降至管底。将处理后的衣壳溶液和 PBS 稀释至每毫升含三微克。确保稀释后的处理衣壳溶液至少有 200 微升。接下来，向每个孔中加入 100 微升衣壳溶液，每种处理至少设置两个孔。此外，每种配体分别设置两个对照孔，每孔加入 100 微升 PBS，用于测定实验的背景吸光度。用板盖盖住板子，并用石蜡膜密封边缘以减少蒸发。将板子置于摇床孵育器中，4 摄氏度过夜，或室温孵育两小时。孵育结束后，从孔板中移除处理过的衣壳溶液。然后每孔加入200 µL封闭缓冲液，在室温下孵育2小时，或在4°C下密封过夜。 同时，用无核酸酶的水将生物素标记的适配体稀释至一微摩尔。确保每种处理所需的总体积为200微升，且溶液量充足。此外，将选定的生物素化HPGA用封闭缓冲液稀释至每毫升30微升。同样，确保每种处理所需的总体积为200微升，并准备足够的溶液量。 孵育结束后，移除封闭缓冲液，并用200微升/孔的PBST洗涤平板三次。将平板倒置在无菌纸巾上轻拍，以吸干残留水分。随后，每孔加入100微升配体结合溶液，确保每种热处理-配体组合对应两个孔，在室温下将平板盖好后置于旋转摇床上，以约60 RPM振荡孵育一小时。 按照文本方案中所述清洗各孔后，每孔加入100微升PBS中的0.2微克/毫升链霉亲和素-辣根过氧化物酶。在室温下，于轨道摇床上轻轻振荡孵育15分钟，然后再次洗涤各孔。随后，再进行一次洗涤，每孔加入100 µL TMB底物，显色5至15分钟。观察各孔颜色变化。确保在重复实验的各块板之间保持一致的显色时间，并注意所用酶标仪的吸光度检测范围。每孔加入100 µL 1 M磷酸停止反应，随后立即在450 nm波长下读取吸光值。按照文本方案中的详细说明，在DLS仪器软件中创建一个新的尺寸标准操作程序。然后，在软件中选择绿色运行箭头，并为样品命名。将热处理后的病毒样颗粒（VLPs）在1×PBS中按1至10倍稀释，使其终浓度为每毫升5微克。然后使用孔径为1微米的滤膜过滤样品，以去除灰尘颗粒。动态光散射（DLS）对灰尘非常敏感，因为大颗粒散射的光远多于小颗粒。将50微升稀释后的VLPs转移至一次性微量比色皿中。将比色皿插入仪器的样品室。开始运行，并使用相关图累积量拟合和专家建议选项卡评估数据质量。在运行过程中，检查多分散指数值是否小于0.3，以确保测量质量合格。在多视角标签页中，确保相关系数在短时间内保持恒定且接近但不超过1，而在较晚时间迅速降至零，这是粒径的特征。在测量过程中，使用专家建议标签页获取数据质量的反馈。测量完成后，再次检查多分散指数值小于0.3。确保在累积量拟合标签页中，累积量拟合曲线与数据点高度吻合。按照文本方案中的说明，在DLS仪器软件中创建新的粒径标准操作程序。在软件中选择运行箭头，以打开并命名新样品，并让仪器达到温度平衡。将VLP悬液转移至小体积石英比色皿中，避免产生气泡，并沿比色皿壁缓慢移液。待仪器达到温度平衡后，将比色皿插入样品室。等待10秒使样品温度平衡后，启动测量并同时开始计时。在第一次测量结束时停止计时器。将此时间作为第一个时间点。后续时间点从软件记录的测量时间中获取。进行热处理操作，步骤同前，但以 PBS 替代 10 毫摩尔 HEPES（pH 7.4），处理后不再稀释衣壳。接着，用移液器将全部 15 微升处理后的衣壳溶液滴加到石蜡膜上。用镊子夹住载网边缘，使镊子闭合并固定载网，将载网碳膜面朝下放置于处理后溶液液滴的上方。将载网孵育10分钟，使衣壳结合到载网上。根据衣壳制备物的纯度，在处理过的衣壳液滴后，依次加入10至15微升的HEPES溶液液滴进行洗涤。孵育10分钟后，用载网拾取液滴。将载网几乎垂直地接触一片滤纸，以吸去液滴。然后用载网蘸取10至15微升HEPES缓冲液液滴，保持30秒。经过30秒洗涤后，用另一片滤纸吸去液滴。接下来，在空的石蜡膜上放置一滴15微升的2%醋酸铀酰溶液。用载网吸取醋酸铀酰液滴，静置45秒。然后用滤纸吸去醋酸铀酰溶液，确保去除大部分液体。将网格的碳面朝上放置在一张滤纸上，注意避免网格粘附在镊子上的湿气。然后，将带有网格的滤纸放入敞口的玻璃培养皿中。对所有处理组重复此步骤后，将装有网格的培养皿半部置于干燥器中过夜干燥，以便后续使用透射电子显微镜（TEM）观察。下图显示了人诺如病毒衣壳在68摄氏度处理下随时间推移其结合能力的降低情况。可以看出，HPGA结合信号是第一个完全消失的信号。此时可认为溶液中绝大多数衣壳已失去结合宿主细胞HPGA的能力，因而无法被细胞内化。适体的结合方式与HBGA相似，尽管需要稍多的加热处理才能消除信号。此处显示的是代表高质量数据的DLS相关系数曲线。在接近零的时间点，相关图的值恒定在接近但低于1的水平。随后，该值会急剧下降至零，其下降时间特征与颗粒大小相关。本实验所得的粒径结果可信度较高。相反，此相关系数曲线则代表了质量较差的数据。相关图从高于1的值开始，逐渐下降至零。本实验的结果不应被采用。此处，粒径数据显示，在68摄氏度处理的衣壳呈现出明显的聚集特征，约20分钟后形成超大聚集体。超级聚集发生的时间是VLPs对该处理方式敏感性的特征性指标。该图展示了人诺如病毒衣壳经加热处理后的透射电子显微镜（TEM）结果。此处，衣壳从左至右分别在60至80摄氏度下进行处理。可以看出，随着衣壳发生聚集和变性，其形态随处理方式发生明显变化。在68摄氏度下处理0至25分钟的衣壳也观察到类似现象。 一旦掌握，这些技术若操作得当，可在1至24小时内完成。该技术建立后，为食源性病毒学领域的研究人员探索人诺如病毒衣壳失活机制及其效应提供了新的途径。在完成本实验步骤后，还可进一步采用其他方法，如加或不加RNase预处理的实时RT-PCR、病毒衣壳的SDS-PAGE分析，以及利用可培养的替代病毒进行蚀斑实验，以更全面地评估特定处理后的病毒减量效果。观看本视频后，您应能够充分掌握如何运用配体结合实验、动态光散射技术和透射电子显微镜，深入揭示灭活处理对人诺如病毒衣壳作用的分子机制。请注意，使用某些试剂可能存在危险，因此在进行本实验操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护装备并遵守实验室安全最佳实践。

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