Name: 用高压液相色谱法提取和分析儿茶酚胺神经递质及其代谢物的简便方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: 学习使用高压液相色谱法提取和分析儿茶酚胺神经递质及其代谢物，该方法结合固相萃取和电化学检测技术，可同时检测婴儿尿液中的多种神经递质，为早期诊断脑损伤提供潜在的生物标志物。

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本研究由国家自然科学基金（No.81172720，No.81673230）、江苏省科技厅社会发展研究计划（No. BE2016741）及科学技术 &amp;中国国家质量监督检验检疫总局科技项目（2015QK055），东南大学教育部儿童发展与学习科学重点实验室开放课题项目（CDLS-2016-04）。我们诚挚感谢袁松（Yuan Song）和刘萍（Ping Liu）在样本采集过程中给予的协助。

已获得所有受试者家长的知情同意，并获得了机构审查委员会对本研究的批准。本研究遵循世界医学协会《涉及人类受试者的医学研究伦理准则》（《赫尔辛基宣言》）的规定进行。所有参与者的监护人均签署了书面同意书，同意其参与本研究。同时，也获得了东南大学附属中大医院伦理委员会的批准。
1. 儿茶酚胺提取与测定所需柱材及溶液的制备
<ol>
	<li>准备PFSPE小柱。将1-2 mg的PCE-PS纳米纤维分成5-6份，使用直径为0.5 mm的细钢棒将每份依次压入200 µL移液枪头的末端。</li>
	<li>配制人工尿液：称取2.427 g尿素、0.034 g尿酸、0.09 g肌酐、0.297 g枸橼酸三钠、0.634 g氯化钠、0.45 g氯化钾、0.161 g氯化铵、0.089 g二水氯化钙、0.1 g七水硫酸镁、0.034 g碳酸氢钠、0.003 g草酸钠、0.258 g硫酸钠、0.1 g磷酸二氢钠和0.011 g磷酸氢二钠，溶于200 mL去离子水中。</li>
	<li>通过将2 mg二苯基硼酸（DPBA）溶解于1 mL蒸馏水中，配制成2 mg/mL的储备溶液。将该溶液避光保存于4 °C。</li>
	<li>分析物标准品 
	注意：儿茶酚胺类化合物的化学结构和性质不稳定，易分解。标准品的配制过程必须迅速，并避免暴露于直射阳光下。
	<ol>
		<li>分别称取1.0 mg去甲肾上腺素（NE）、肾上腺素（E）、多巴胺（DA）、3-甲氧基-4-羟基苯基甘油（MHPG）、3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC）以及内标物3,4-二羟基苄胺氢溴酸盐（DHBA），置于不同的1.5 mL微量离心管中。使用前将DHBA溶液用水稀释至100 ng/mL。</li>
		<li>将配制好的标准品在避光条件下高速振荡，直至分析物完全溶解。此为初级储备液，可于-20 °C保存数周。</li>
		<li>配制次级1,000 ng/mL分析物储备液。对于NE、E、DA、DOPAC和MHPG，取各初级储备液5 µL，加入5 mL离心管中的4,975 µL蒸馏水中，混匀后避光保存于4 °C，每日新鲜配制。对于DHBA，取5 µL初级储备液加入4,995 µL蒸馏水中，于5 mL离心管中混匀后单独避光保存于4 °C。</li>
		<li>使用次级分析物储备液进行进一步稀释，以建立标准曲线（例如，补充表2）。溶液避光保存于4 °C，并每日新鲜配制。</li>
		<li>使用适当浓度的标准储备液测试ECD检测器的最佳电压。调节电压，使各分析物的色谱峰形达到最佳。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制含30%磷酸、15%乙腈和55%蒸馏水的洗脱液。配制10 mL洗脱液时，先取5.5 mL蒸馏水，再逐滴加入1.5 mL乙腈和3 mL磷酸。</li>
</ol>
2. 真实尿液样本和流动相的制备
<ol>
	<li>让母亲使用无菌尿杯收集婴儿的晨尿。将样本转移至聚丙烯管中，并立即标记。随后，将样本储存在 -20 °C 冰箱中。</li>
	<li>将尿液样本涡旋混匀，并在室温（RT）下以 1,510 × g 离心 10 分钟，以去除大部分颗粒物干扰。弃去沉淀，收集上清液用于后续实验。为了有效提取分析物，离心后应立即进行 PFSPE 预处理（步骤 3）。</li>
	<li>配制流动相
	<ol>
		<li>准备一个洁净的瓶子，容量至少为 1 L。流动相的组成见补充表 1；配制 1 L 流动相时，称取 6.7242 g 柠檬酸、93.06 mg 乙二胺四乙酸（EDTA）二钠盐、7.02 g 磷酸一钠、404.5 mg 庚烷磺酸钠和 3.5 g 氢氧化钠加入瓶中。加入 40 mL 乙腈，并用蒸馏水定容至 1,000 mL。振荡并超声处理 15 分钟，直至溶液中所有物质完全溶解。</li>
		<li>使用玻璃电极 pH 计，用饱和氢氧化钠溶液将流动相的 pH 值调节至 4.21。</li>
		<li>使用 0.45 µm 聚偏二氟乙烯微孔滤膜和真空抽滤装置过滤流动相，以去除杂质。</li>
		<li>每次使用前，均需进行 15 分钟超声脱气处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. PFSPE 萃取与 HPLC 分析
<ol>
	<li>活化纳米纤维。使用5 mL注射器，以缓慢滴加的方式依次将100 µL甲醇和100 µL水通过PFSPE小柱。</li>
	<li>在0.5 mL EP管中混合100 µL尿液样品、100 µL 2 mg/mL DPBA溶液和30 µL 100 ng/mL DHBA溶液（IS，内标），然后将混合溶液转移至PFSPE小柱。使用5 mL气密性塑料注射器，借助气压将混合样品溶液缓慢推过PFSPE小柱。</li>
	<li>向固相萃取小柱中加入100 µL DPBA溶液（2 mg/mL），重复此步骤三次，以淋洗小柱；每次均使用5 mL气密性塑料注射器通过气压缓慢推动溶液穿过小柱。</li>
	<li>将50 µL洗脱液加载到PFSPE小柱上，推动其通过小柱，并用0.5 mL EP管收集洗脱液。</li>
	<li>开启高效液相色谱（HPLC）脱气装置以去除系统中的气体。在样品分析前，系统应使用流动相运行超过0.5小时，以达到平衡并降低基线噪声。参见补充表1，其中列出了HPLC系统的设置参数。</li>
	<li>使用自动进样器吸取20 µL洗脱液，然后将其注入HPLC-ECD系统中。</li>
	<li>运行结束后，通过检测器界面关闭检测器流通池。切勿使用检测器背面的开关关闭流通池，否则可能损坏仪器。</li>
	<li>手动将流动相组成调整为10%甲醇和90%水，运行至少30分钟。随后，手动将流动相更换为HPLC级甲醇，运行约15分钟，使系统保存在甲醇中。若未按推荐时间执行此步骤，可能导致色谱柱和检测器损坏。关闭流速后，再关闭脱气装置。</li>
</ol>
4. 苯硼酸柱（PBA）提取
PBA柱提取步骤与Kumar et al. (2011)25中的方案类似。所有溶液均通过注射器加压空气推动，使其流经PBA柱（100 mg，1 mL）。
<ol>
	<li>依次用 1 mL 含 1% 甲酸的 80:20 乙腈-水（v/v）和 1 mL 50 mM 磷酸盐缓冲液（pH 10）对萃取柱进行预处理。</li>
	<li>将缓冲后的尿液样品（1 mL 尿液和 2 mL 磷酸盐缓冲液，pH 8.5）通过 PBA 萃取柱。</li>
	<li>用 1 mL 50:50 v/v 乙腈-磷酸盐缓冲液（10 mM，pH 8.5）洗涤萃取柱。</li>
	<li>用 1 mL 含 1% 甲酸的乙腈-水（80:20 v/v）对萃取柱进行洗脱。</li>
</ol>
5. 儿茶酚胺的鉴定与定量
<ol>
	<li>线性关系
	<ol>
		<li>用人工尿液将次级分析物储备液稀释为六个浓度（1.5、3、12、25、50 和 100 ng/mL）；人工尿液的稀释体积参见补充表2。每个浓度制备三个平行样品，共得到18个分析物实验溶液，用于构建校准曲线。</li>
		<li>用人工尿液将DHBA次级储备液稀释10倍，得到100 ng/mL的实验溶液。</li>
		<li>按照步骤3（PFSPE萃取程序）对5.1.1中所有分析物溶液进行前处理。与步骤3相同，将每种相应洗脱液各20 µL注入HPLC-ECD系统，获得HPLC色谱图。</li>
		<li>通过绘制峰面积比值（目标物/内标）作为Y轴，浓度比值（目标物/内标）作为X轴，构建五种分析物的校准曲线，如补充图1所示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灵敏度的检出限（LOD）和定量限（LOQ）值
	<ol>
		<li>将20 µL空白人工尿液注入HPLC-ECD系统（同步骤3），获得样品的HPLC色谱图。</li>
		<li>在5.2.1所得色谱图中，收集11个空白信号值，计算其平均值Xb和标准偏差Sb。计算在特定置信水平下可检测到物质的最小信号XL，公式为XL = Xb+K*Sb（K为由置信水平决定的系数，Sb反映测定方法的噪声水平及仪器噪声水平）。因此，LOD = (XL-Xb)/S = (K*Sb)/S（S表示工作曲线的斜率）。</li>
		<li>定义信噪比（S/N）为3:1（K=3）时为检出限（LOD），信噪比为10:1（K=10）时为定量限（LOQ）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>回收率评估
	<ol>
		<li>制备真实尿液和加标尿液样品。用真实尿液将次级分析物储备液稀释为三个浓度（5、50、100 ng/mL），得到加标尿液样品。每种分析物溶液制备三个平行样品。将加标浓度记为加入尿液样品中的目标化合物量，定义该值为As。</li>
		<li>将DHBA储备液稀释至100 ng/mL，方法同步骤5.1.2。</li>
		<li>按照步骤3（PFSPE萃取程序）处理5.3.1中的各样品溶液，并将每种相应洗脱液20 µL注入HPLC-ECD系统，获得色谱图结果。分析物的数值记为在加标尿液样品中定量得到的目标化合物量，定义该值为At。</li>
		<li>将20 µL尿液样品注入HPLC-ECD系统（同步骤3），获得色谱图结果。分析物的数值记为尿液样品中初始定量得到的目标化合物量，定义该值为Ai。</li>
		<li>根据标准曲线方程计算样品中目标化合物的含量。回收率百分比按以下公式估算：方法回收率% = (At - Ai) × 100/(As)。平均值见表1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>精密度评估
	<ol>
		<li>按照步骤5.3.1的方法，制备浓度为5、50和100 ng/mL的加标人工尿液样品。每种分析物溶液制备六个平行样品。每天新鲜配制实验样品。</li>
		<li>将DHBA储备液稀释至100 ng/mL，方法同步骤5.1.2。</li>
		<li>评估日内精密度（n=6）。按照步骤3处理5.4.1中的各样品溶液，并将每种相应洗脱液20 µL注入HPLC-ECD系统以获得色谱图。在同一日内重复操作六次。</li>
		<li>根据标准曲线方程计算样品中目标化合物的含量。在同一化合物相同浓度下，单日内六次测定结果的相对标准偏差（RSD）定义为日内精密度。平均值见表1。</li>
		<li>评估日间精密度（n=6）。在连续六天的每天同一时间，按照5.4.1和5.4.2的方法制备浓度为5、50、100 ng/mL的加标人工尿液样品，并按照步骤3处理各分析物样品溶液。</li>
		<li>将5.4.5中每种相应洗脱液20 µL每日注入HPLC-ECD系统，获得色谱图结果。根据标准曲线方程计算样品中目标化合物的含量。日间精密度以连续六天在三个浓度水平下加标人工尿液样品测定结果的RSD表示。平均值见表1。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明，本文讨论的内容与任何金融机构不存在利益冲突。

本文提出的PFSPE方法在快速性、简便性和便捷性方面可能具有重要意义。该方法所用吸附剂为电纺纳米纤维，具有较高的比表面积，能够高效吸附待测物。该过程仅需数毫克纳米纤维和少量洗脱溶剂，且无需蒸发浓缩步骤。本文详细介绍了基于高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ECD）的实验方案，可帮助新用户建立有效的方法，用于检测和定量三种儿茶酚胺及其两种代谢物（NE、E、DA、MHPG、DOPAC）。
该方案的优越性主要源于实验过程中的四个关键步骤，如图1所示：使用PCE-PS纳米纤维捕获目标化合物，将吸附剂用量减少至几毫克，从而实现快速吸附/解吸，并仅需少量洗脱液（1）；向尿液中加入DPBA，使其与分析物形成络合物以增强其疏水性（2）；用含DPBA的溶液冲洗纳米纤维，以保留分析物并去除杂质（3）；优化萃取和分析条件，以获得对分析物的良好灵敏度和选择性（4）。
对于步骤（1），PCE-PS 吸附能力表现出优异性能的机制可能归因于多种因素。掺杂在纳米纤维中的冠醚聚合物可通过氢键与含有氨基...

体液中儿茶酚胺类神经递质及其代谢物的含量可在很大程度上影响神经功能以及机体对刺激反应状态的平衡1。其异常可能引发多种疾病，如嗜铬细胞瘤、节细胞神经瘤、神经母细胞瘤以及神经系统疾病1,2。因此，对体液中儿茶酚胺的提取与测定在相关疾病的诊断中具有重要意义。然而，生物样本中的儿茶酚胺浓度较低，且易被氧化；此外，由于基质中存在大量干扰物质，其洗脱也极为困难3。因此，实现生物体液中儿茶酚胺的同步检测仍是一项挑战。
已有综述表明，尿液儿茶酚胺可作为应激反应的衡量指标，其水平是响应新生儿触觉刺激处理的重要生物学标志物5。研究表明，所有经历过早产事件的婴儿均存在脑损伤风险4,5,6，而脑损伤可能导致儿茶酚胺及其相关物质在体液中异常释放。目前确实存在先进的磁共振技术，可在早期阶段检测出脑损伤7,8。然而，在出生后最初48小时内，异常的神经发育过程可能已造成永久性脑损伤，而这种损伤在医学影像中尚不明显11。此外，由于高昂的成本、仪器资源稀缺以及其他因素，使得并非所有新生儿病房都能配备这些专业的神经影像技术。相比之下，采用一种易于获取且实用的生物标志物（如儿茶酚胺及其代谢物）可能克服上述局限性，对体液中生物标志物的筛查有助于脑损伤的早期诊断，并及时识别出需要神经保护的新生儿9。尿液中的儿茶酚胺可作为一种简便且明显的指标，因其释放量与神经功能活动之间存在直接相关性。
在生物体液中，脑脊液（CSF）和血浆样本难以通过现有的创伤性手段获取，且很难消除黏附蛋白及其他杂质带来的干扰，导致采样过程繁琐耗时，不适合重复检测。此外，对于儿童而言，几乎无法通过创伤性方式获取样本。因此，尿液采样优于其他采样方式，因其具有无创性、操作简便，并可反复进行。尿液样本量充足、易于保存，在各类生物样本中具有显著优势。
定量生物流体中儿茶酚胺的主要方法包括放射酶法测定10、酶联免疫吸附测定11、伏安法12和热透镜光谱法13。但这些方法存在操作复杂、难以同时检测多个目标物等缺点。目前，主流的分析技术是高效液相色谱法（HPLC）14，因其具有高灵敏度和良好的选择性，通常结合高灵敏的电化学检测15或荧光检测16使用。随着串联质谱技术的发展，如液相色谱/质谱（LC/MS）和液相色谱/质谱/质谱（LC/MS/MS），神经递质的分析与定量可实现更高的准确性和特异性17,18。然而，质谱技术需要昂贵的仪器设备以及高度专业化的技术人员，限制了其在大多数常规实验室中的广泛应用。相比之下，HPLC-ECD系统在大多数常规和临床实验室中较为常见，因此已成为科研团队进行化学测定的常用且理想选择，但该方法要求进入系统的样品必须洁净且体积为微升级别19。因此，在分析前对样品进行纯化和浓缩显得尤为重要。经典的纯化方法包括液-液萃取14,15,20以及离线固相萃取，后者包括活化氧化铝柱21,22和二苯基硼酸（DPBA）络合技术23,24,25,26。
Myeongho Lee 等 自2007年以来一直使用经冠醚化学修饰的聚合物树脂作为吸附剂，选择性地从人尿液中提取儿茶酚胺27。此外，Haibo He 等 在2006年展示了一种简便的合成方法，通过利用可功能化的纳米磁性多面体低聚倍半硅氧烷（POSS）基纳米磁性复合材料制备硼酸亲和萃取吸附剂，并将其应用于人尿液中儿茶酚胺（去甲肾上腺素、肾上腺素和异丙肾上腺素）的富集28。他们还利用纳米材料完成该工作，采用一种称为纳米电纺丝的技术，在纳米尺度上形成聚合物纤维材料。通过控制工作电压、改变纺丝液组成以及其他参数，电纺丝工艺可调节产物的直径、形貌和空间取向29。与传统的固相萃取（SPE）小柱相比，电纺纳米纤维因其具有极高的比表面积，能够高效吸附目标分析物，且表面化学性质更易于调控，便于目标化合物的便捷结合，因此非常适用于从复杂基质中提取和富集目标分析物。这些特性使其成为理想的SPE吸附剂，显著减少了固相材料和洗脱溶剂的用量30,31,32,33。针对尿液样品中的儿茶酚胺，已有研究采用由聚苯乙烯基冠醚聚合物（PCE-PS）构成的电纺纳米纤维，选择性地提取三种儿茶酚胺（NE、E和DA）34。该论文指出，这种具有特定几何结构的冠醚可通过形成氢键与NE、E和DA特异性结合，从而实现选择性吸附。实验结果表明，该冠醚材料能有效去除生物样品中存在的其他干扰化合物。受此研究启发，本研究开发了一种基于PCE-PS复合电纺纳米纤维的新方法，用于儿茶酚胺的选择性提取。
本文在先前报道的方法34&#160;基础上进行了改进，不仅成功用于尿液中肾上腺素（E）、去甲肾上腺素（NE）和多巴胺（DA）的分析，还实现了对其代谢物MHPG和DOPAC的测定。我们还探讨了吸附过程机理的新可能性。该方法对五种待测物表现出良好的萃取效率和选择性，并已应用于围产期脑损伤高危婴儿及健康对照者的尿液分析，验证了方法的可行性。

<table><tbody><tr><td>200 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td></td><td></td><td>用于装载纳米纤维的柱</td></tr><tr><td>PCE-PS 纳米纤维</td><td></td><td></td><td>PFSPE 萃取材料</td></tr><tr><td>钢棒（直径约 0.5 mm）</td><td></td><td></td><td>将纳米纤维填充入柱中</td></tr><tr><td>气密塑料注射器（5 ml）</td><td></td><td></td><td>将溶液压入吸头末端</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>二苯基硼酸-2-氨基乙酯（DPBA）</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>A-106408</td><td>络合试剂</td></tr><tr><td>去甲肾上腺素（NE）</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>A-9512</td><td>分析物</td></tr><tr><td>3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇（MHPG）</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>H1377</td><td>分析物</td></tr><tr><td>肾上腺素（E）</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>100154-200503</td><td>分析物</td></tr><tr><td>3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC）</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>D-9128</td><td>分析物</td></tr><tr><td>多巴胺（DA）</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>H-8502</td><td>分析物</td></tr><tr><td>3,4-二羟基苄胺氢溴酸盐（DHBA）</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>858781</td><td>内标物</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>75-05-8</td><td>洗脱剂和流动相</td></tr><tr><td>磷酸</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>7664-38-2</td><td>洗脱剂</td></tr><tr><td>尿酸</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>69-93-2</td><td>人工尿液</td></tr><tr><td>肌酐</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>60-27-5</td><td>人工尿液</td></tr><tr><td>柠檬酸三钠</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>6132-04-3</td><td>人工尿液</td></tr><tr><td>KCl</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>7447-40-7</td><td>人工尿液</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>12125-02-9</td><td>人工尿液</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>SWC0140326</td><td>人工尿液</td></tr><tr><td>C2Na2O4</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>62-76-0</td><td>人工尿液</td></tr><tr><td>NaSO4</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>7757-82-6</td><td>人工尿液</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10039-32-4</td><td>人工尿液</td></tr><tr><td>尿素</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>57-13-6</td><td>人工尿液</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>7647-14-5</td><td>人工尿液</td></tr><tr><td>MgSO4·7H2O</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10034-99-8</td><td>人工尿液</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10035-04-8</td><td>人工尿液</td></tr><tr><td>HCl</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>7647-01-0</td><td>人工尿液</td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>77-92-9</td><td>人工尿液和流动相</td></tr><tr><td>EDTA 二钠盐</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>34124-14-6</td><td>流动相</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>7558-80-7</td><td>人工尿液和流动相</td></tr><tr><td>庚烷磺酸钠</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>22767-50-6</td><td>流动相</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>1310-73-2</td><td>流动相</td></tr><tr><td>苯基硼酸柱（PBA 柱）</td><td>Aglilent</td><td>12102018</td><td>PBA 萃取</td></tr><tr><td>Inertsil&amp;reg; ODS-3 5 &amp;micro;m 4.6&amp;times;150 mm 柱</td><td>Dikma</td><td>5020-06731</td><td>用于分离的高效液相色谱柱</td></tr><tr><td>SHIMADZU SIL-20AC prominence 自动进样器</td><td>岛津公司，日本</td><td>SIL-20AC</td><td>洗脱剂自动进样</td></tr><tr><td>SHIMADZU LC-20AD 高效液相色谱仪</td><td>岛津公司，日本</td><td>LC-20AD</td><td>高效液相色谱泵</td></tr><tr><td>SHIMADZU L-ECD-60A 电化学检测器</td><td>岛津公司，日本</td><td>L-ECD-60A</td><td>分析物检测器</td></tr><tr><td>ASAP 2020 加速比表面积与孔隙率分析系统</td><td>Micromeritics，美国</td><td></td><td>表面与孔隙分析仪&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

一种便捷的儿茶酚胺类神经递质及其代谢物的提取与高效液相色谱分析方法

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

儿茶酚胺类神经递质在生物体液中的提取与分析对于评估神经系统功能及相关疾病具有重要意义，但其精确定量仍具挑战性。已有多种检测神经递质的实验方案被报道，所用仪器包括高效液相色谱（HPLC）等。然而，现有方法仍存在操作复杂或难以同时检测多个目标物等不足之处。目前，由于具有高灵敏度和良好选择性，高效液相色谱结合电化学或荧光检测仍是主流分析技术。本文详细描述了一种采用电纺复合纳米纤维（以聚合冠醚与聚苯乙烯作为吸附材料）作为吸附剂，通过填充纤维固相萃取（PFSPE）方法，结合高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ECD）对婴儿实际尿液样本中儿茶酚胺进行前处理与检测的实验方案。我们展示了如何利用纳米纤维填充的固相萃取柱对尿液样本进行简便的预净化处理，以及如何在电化学检测系统上快速实现样本中分析物的富集、解吸和检测。PFSPE显著简化了生物样本的前处理流程，有效缩短了操作时间，降低了成本，并减少了目标物的损失。
总体而言，本研究展示了一种简便、便捷的固相萃取联合高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ECD）系统的方法，用于同时测定婴儿尿液中三种单胺类神经递质（去甲肾上腺素（NE）、肾上腺素（E）、多巴胺（DA））及其两种代谢物（3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇（MHPG）和3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC））。该建立的方法被应用于评估围产期脑损伤高危婴儿与健康对照组之间尿液儿茶酚胺及其代谢物的差异。比较分析显示，两组婴儿尿液中MHPG水平存在显著差异，提示儿茶酚胺代谢物可能是早期识别婴儿脑损伤高危病例的重要候选标志物。

本方案是一种简单、便捷的PFSPE方法，用于预处理尿液样品并富集五种儿茶酚胺，随后通过高效液相色谱-电化学检测器（HPLC-ECD）系统进行检测；该流程示意图见图1。该方案主要包括四个步骤——活化、上样、淋洗和洗脱，结合少量PCE-PS纳米纤维及简易固相萃取装置完成。采用表面与孔隙分析仪对PCE-PS纳米纤维的形貌进行表征（见材料表）。其结构特性参数——BET（Brunauer, Emmett和Teller）比表面积、孔体积和孔径分别为2.8297 m2 g-1、0.009 cm3 g-1和12.76 nm。这些数据表明，本方案所用材料表面具有纳米级孔隙，可能有助于提高吸附效率并降低结合过程中的pH要求。
本方案采用优化的体积、样品成分、浸提液和洗脱液 等等。</e...

我们提出了一种便捷的固相萃取联合高效液相色谱（HPLC）电化学检测（ECD）方法，用于同时测定婴儿尿液中三种单胺类神经递质及其两种代谢物。我们还鉴定出代谢物MHPG可作为婴儿脑损伤早期诊断的潜在生物标志物。

生物流体中儿茶酚胺类神经递质的提取与分析对于评估神经系统功能具有重要意义

本实验的总体目标是通过简便的固相萃取结合高效液相色谱-电化学检测法，同时测定婴儿尿液中的三种单胺类神经递质及其两种代谢产物。该方法可在短时间内通过简单操作，对完整样品中的不稳定目标化合物进行预测和测定。样品可通过填充细纤维的固相萃取小柱进行快速前处理净化，样品中的待测物可被有效富集、溶解，并在电化学检测系统上进行检测。我们最初想到这一方法，是因为意识到儿茶酚胺类神经递质在生物体液中的提取与分析对于评估机体应激功能及相关疾病至关重要。由于操作过程中必须避免光照，且前处理时间应尽可能短，因此初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难。本次实验操作由本实验室的两位博士研究生魏兰兰和Qing Han进行示范。首先，通过将2毫克化合物溶解于1毫升蒸馏水中，配制浓度为2毫克/毫升的DPBA储备液。将溶液置于4摄氏度避光保存。在配制分析物扩增子时，需注意儿茶酚胺的化学结构和性质不稳定，容易分解，因此扩增子的制备过程必须迅速，并避免暴露于微弱阳光下。分别称取1.0毫克去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、MHPG、DOPAC以及内标物DHBA，置于不同的1.5毫升微量离心管中。除肾上腺素外，其余各化合物均加入1.0毫升蒸馏水溶解；肾上腺素则应溶于0.01摩尔/升盐酸溶液中。将配制好的标准品在避光条件下高速振荡，直至各分析物完全溶解。这些是初级标准品溶液，可在零下20摄氏度保存数周。为配制去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、DOPAC和MHPG的次级分析物标准品溶液，分别取5微升每种初级分析物标准品溶液，加入装有4,975微升去离子水的5毫升离心管中。这些溶液需每日新鲜配制，并避光保存于4摄氏度，直至使用。对于DHBA，取5微升初级储备液加入5毫升离心管中的4,995微升蒸馏水中，混匀后于4摄氏度避光单独保存。使用次级分析物储备液进一步稀释，以制备标准曲线。溶液需避光保存于4摄氏度，并每日新鲜配制。接下来，使用适当浓度的标准储备液测试ECD检测器的最佳电压。调节电压，找到使分析物色谱峰形最佳的电压值。配制10毫升洗脱溶剂时，先量取5.5毫升蒸馏水，然后加入1.5毫升乙腈，并逐滴加入3毫升磷酸至水中。配制流动相时，将文本方案中列出的组分量取至一个洁净的1升瓶中。加入40毫升乙腈和蒸馏水至1,000毫升。振摇并超声振荡15分钟，直至溶液中的物质完全溶解。使用带有玻璃电极的pH计，用饱和氢氧化钠溶液将流动相的pH值调节至4.21。使用0.45微米的聚偏二氟乙烯微孔膜和真空抽滤装置过滤流动相，以去除杂质。每次使用前，采用超声振荡脱气15分钟。然后，将尿液样本在室温下涡旋并以 1,510 × g 离心 10 分钟，以去除大部分颗粒物干扰。收集上清液，弃去沉淀物用于后续实验。为了有效提取待测物，在离心后应立即进行填充纤维固相萃取（PFSPE）前处理。为活化纳米纤维，使用5毫升注射器将100微升甲醇和100微升水依次缓慢逐滴通过PFSPE柱。尿液样品必须与DPPA溶液混合，以提高其疏水性，促进儿茶酚胺及其代谢物在纤维上的吸附。同时需加入DHBA溶液作为内标物。在0.5毫升离心管中，将100微升尿液样本与100微升浓度为2毫克/毫升的DPBA溶液以及30微升浓度为100纳克/毫升的DHBA内标溶液混合。然后使用5毫升气压式塑料注射器，借助气压将混合后的样品溶液压过PFSPE柱。使用5毫升气压式塑料注射器向固相萃取柱中加入100微升DPBA溶液，通过气压缓慢推动溶液流过柱体，重复此步骤三次以洗涤柱子。此洗涤步骤是必要的，因为DPBA溶液可去除杂质，同时保留待测物，从而提高对待测物的灵敏度和选择性。接下来，将50 µL洗脱液上样至PFSPE柱，推动液体通过色谱柱，并用0.5 mL离心管收集洗脱液。开启高效液相色谱脱气机，以去除系统中的空气。在进行样品分析之前，系统应使用流动相运行超过0.5小时，以达到平衡并降低基线噪声。使用自动进样器吸取20微升洗脱液，然后将其注入高效液相色谱电化学检测（HPLC ECD）系统。运行结束后，通过检测器界面关闭检测池。请勿通过检测器背面的开关关闭设备，否则可能损坏仪器。手动将流动相组成调整为10%甲醇和90%水。运行至少30分钟后，手动将流动相更换为HPLC级甲醇。运行系统约15分钟，以甲醇保护系统。若未按照推荐的运行时间执行此步骤，可能导致色谱柱和检测器损坏。关闭流速，然后关闭脱气机。按照文中的实验方案进行儿茶酚胺分析。图中显示了添加目标物和内标物的水样在未经萃取情况下的色谱图。在本方案所述的高效液相色谱条件下，PFSPE 方法的五个目标峰均得到良好分离，且峰高显著高于商用苯硼酸柱萃取所得结果。此外，DOPAC 峰未在 PBA 小柱的提取结果中出现，表明 PBA 柱无法有效提取 DOPAC。在对尿液样本进行提取时，PFSPE 方法不仅能够良好地提取目标物并实现清晰的色谱峰识别，还能去除尿液中的大部分干扰物质。通过绘制各化合物的峰面积比值曲线构建校准曲线，显示出在低浓度下具有良好的线性关系。为验证真实尿液样本，检测了28例高危婴儿和22例健康婴儿的尿液样本。尽管某些儿茶酚胺在高危组与健康组之间无显著差异，但高危婴儿的MHPG代谢物含量高于对照组。因此，尿液中MHPG的水平可能是早期识别高危婴儿的潜在标志物。一旦掌握，该技术可在数分钟内完成。在操作过程中，务必记住要新鲜制备灰烬，快速操作，并避免暴露于直射阳光下。在吸收和洗涤步骤中，二苯基硼酸溶液的添加也十分关键。采用该方法后，由于缺乏对血浆或脑脊液中儿茶酚胺及其代谢物终止的检测手段，因此尚存局限性。此外，还可通过该方法测定本方案在检测其他生物体液时的普适性。该技术建立后，为研究人员探索儿童样本中尿液儿茶酚胺水平与神经发育缺陷之间的关系奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用带有毛发样本和简易装置的固相萃取方法；PCE PS空气纤维素协同废物DPBA可用于清除尿液样本中的儿茶酚胺类神经递质。该技术有助于对存在脑损伤风险的婴儿进行早期诊断。因为比较分析显示自闭症儿童的单胺代谢产物MHPG存在异常差异，提示儿茶酚胺代谢物可能是重要的候选生物标志物。

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一种便捷的儿茶酚胺类神经递质及其代谢物的提取与高效液相色谱分析方法

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