用高压液相色谱法提取和分析儿茶酚胺神经递质及其代谢物的简便方法
2018年3月1日
我们提出了一种方便的固相萃取与高压液相色谱 (HPLC) 结合电化学检测 (幼儿发展) 同时测定三单胺类神经递质和两个代谢物在婴儿的尿液中。我们还确定代谢物 MHPG 作为早期诊断婴儿脑损伤的潜在生物标志物。
该程序的总体目标是通过方便的固相萃取与高压液相色谱和电化学检测相结合，同时测定婴儿尿液中的三种单胺类神经递质及其两种代谢物。该方法可在短时间内预测和测定完整样品中不稳定的目标化合物，作简单。您的示例可以通过窄纤维填充的实面群体轻松进行预清洁，并且样品中的分析物可以很容易地富集、溶解并在电化学检测系统上进行检测。
当我们意识到生物体液中儿茶酚胺神经递质的提取和分析对于评估耐药功能和相关疾病至关重要时，我们第一次有了这种方法的想法。刚接触这种方法的人会很挣扎，因为必须避免光照，并且预处理时间应尽可能短。我们实验室的两名博士生 Lanlan Wei 和 Qing Han 演示了该程序。
首先，通过将 2 毫克化合物溶解到 1 毫升蒸馏水中，制备每毫升 2 毫克的 DPBA 溶液储备液。将溶液存放在 4 摄氏度的避光中。在制备分析物填充剂时，请记住儿茶酚胺的化学结构和性质是不稳定的，并且由于它们很容易分解，因此填充剂的制备过程必须非常快，并且必须避免暴露在薄薄的阳光下。
在单独的 1.5 毫升微量离心管中称取 1.0 毫克去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、MHPG、DOPAC 和内标 DHBA。加入 1.0 毫升蒸馏水溶解除肾上腺素外的每种化合物，肾上腺素应溶解在 0.01 摩尔/升的盐酸溶液中。在黑暗中高速振荡制备的标准品，直到分析物完全溶解。
这些是初级库存，可以在零下 20 摄氏度下储存长达数周。为了制备去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、DOPAC 和 MHPG 的二级分析物储备液，将 5 μL 的每种初级分析物储备液转移到 4， 975 μL 蒸馏水中，装在单独的 5 mL 离心管中。每天新鲜制备这些溶液，并将溶液在 4 摄氏度的黑暗中储存直至使用。
对于 DHBA，将 5 微升初级原液转移到 5 毫升离心管中的 4， 995 微升蒸馏水中，并在 4 摄氏度下单独避光储存。用二级分析物储备液进一步稀释，形成标准曲线。将溶液储存在 4 摄氏度的黑暗中，并每天准备新鲜的溶液。
接下来，使用适当浓度的标准原液测试 ECD 检测器的最佳电压。改变电压以找到分析物具有最佳峰外观的值。要制备 10 毫升淋洗液溶剂，请使用 5.5 毫升蒸馏水，然后将 1.5 毫升乙腈和 3 毫升磷酸逐滴加入水中。
要制备流动相，请将文本方案中列出的组分测量到一个干净的 1 L 瓶中。将 40 毫升乙腈和蒸馏水加入 1， 000 毫升。用超声波搅拌和振动 15 分钟，直到溶液中的物质全部溶解。
使用带有玻璃电极的 pH 计，用饱和氢氧化钠溶液将流动相的 pH 值调节至 4.21。用 0.45 微米聚偏二氟乙烯微孔膜和真空抽吸装置过滤流动相以去除杂质。每次使用前，使用超声波振动 15 分钟，使流动相脱气。
然后，在室温下以 1， 510 倍 G 的离心力涡旋和离心尿液样品 10 分钟，以去除大多数颗粒干扰物。收集上清液，丢弃沉淀物以进行进一步实验。为了有效提取分析物，离心后立即进行填充纤维固相萃取或 PFSPE 预处理。
为了活化纳米纤维，使用 5 毫升注射器以缓慢的逐滴方式依次压入 100 微升甲醇和 100 微升水通过 PFSPE 柱。尿液样品必须与 DPPA 溶液混合，以提高其疏水性并帮助儿茶酚胺和代谢物吸收到纤维上。还必须添加 DHBA 溶液作为内标。
将 100 微升尿液样品与 100 微升 2 毫克/毫升 DPBA 溶液和 30 微升 100 毫克/毫升 DHBA 内标溶液混合在 0.5 毫升 Eppendorf 管中。然后，利用气压的力量，用 5 mL 气体型塑料注射器将混合样品溶液压入 PFSPE 柱。使用 5 mL 气体型塑料注射器将 100 μL DPBA 溶液加载到 SPE 柱中，将色谱柱浸出 3 次，然后用气压将溶液缓慢推过小柱。
这个冲洗步骤是必要的，因为 DPBA 溶液可以在保留分析物的同时去除杂质，从而提高分析物的灵敏度和选择性。接下来，将 50 μL 洗脱液加载到 PFSPE 柱上，并将其推入色谱柱，用 0.5 mL的 Eppendorf 管收集洗脱液。打开 HPLC 脱气机，对系统中的空气进行脱气。
在进行样品分析之前，系统应在流动相下运行 0.5 小时以上，以平衡和降低基线噪音。使用自动进样器对 20 μL 洗脱液进行采样，然后将其注入 HPLC ECD 系统。运行完成后，使用检测器接口关闭检测器池。
请勿使用检测器背面的开关关闭电解池，因为这可能会损坏仪器。手动将流动相组成更改为 10% 甲醇和 90% 水。运行至少 30 分钟后，手动将流动相更换为 HPLC 级甲醇。
运行系统约 15 分钟，使其在甲醇中保护。如果未按照建议的运行时间运行此步骤，可能会损坏色谱柱和检测器。关闭流，然后关闭脱气机。
按照文本方案中的说明进行儿茶酚胺分析。加标水样品的色谱图与目标样品和内标未提取。在方案的 HPLC 条件下，PFSPE 方法的 5 个目标峰分离良好，显著高于市售苯基酸小柱提取的峰。
此外，PBA 小柱萃取结果中未出现 DOPAC 峰，表明 PBA 色谱柱无法萃取 DOPAC。在提取尿样时，PFSPE 方法不仅可以提取出峰鉴定良好的目标，而且可以消除尿液中的大部分干扰。通过绘制峰面积比来构建每种化合物的校准曲线，在低浓度下显示出良好的线性。
为了用真实尿液样本进行验证，对 28 名高危婴儿和 22 名健康婴儿的尿样进行了检测。虽然高危组和健康组之间的一些儿茶酚胺没有显著差异，但高危婴儿的 MHPG 代谢物量高于对照组。因此，尿 MHPG 水平可能是早期识别高危婴儿的潜在标志物。
一旦掌握，这项技术可以在几分钟内完成。在尝试该程序时，重要的是要记住准备新鲜的煤渣，快速作，并防止暴露在阳光直射下。在吸收和冲洗步骤中，二苯硼酸盐-酸-溶液的添加也很关键。
遵循此程序，作为测量血浆或脑脊液中儿茶酚胺和代谢物缺乏终止。可以进行 Alsliver 以确定该方案在测试其他生物液中的普遍性。开发后，这项技术为研究人员研究神经发育缺陷与儿童样本中尿儿茶酚胺水平之间的关系铺平了道路。
观看此视频后，您应该对如何使用 nair 数字和一个简单的设备进行固相萃取方法有很好的了解，PCE PS 空气纤维法企业废物 DPBA 可以帮助清理尿液样本中的儿茶酚胺神经递质。这项技术延伸到婴儿有脑损伤风险的黑醋栗的早期诊断。因为比较分析显示自闭症儿童一元 MHPG 存在异常差异，表明儿茶酚胺代谢物可能是重要的候选标志物。
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概述
本研究提出了一种固相萃取方法，结合高压液相色谱和电化学检测，用于分析婴儿尿液中的神经递质。该方法旨在识别早期脑损伤的潜在生物标志物。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 临床诊断
背景
- 单胺类神经递质在大脑功能中起着关键作用。
- 评估神经递质水平可以帮助诊断神经系统疾病。
- 婴儿对脑损伤特别敏感，使得早期检测至关重要。
- 现有方法可能无法有效分析生物液体中的这些化合物。
研究目的
- 开发一种可靠的方法用于同时测定神经递质及其代谢物。
- 探索MHPG作为婴儿脑损伤生物标志物的潜力。
- 简化提取和分析过程以用于临床应用。
所用方法
- 固相萃取用于样品制备。
- 高压液相色谱用于分离。
- 电化学检测用于定量分析。
- 过程中小心处理以避免光照。
主要结果
- 成功同时检测到三种神经递质和两种代谢物。
- 确定MHPG为潜在的生物标志物。
- 方法展示了操作简便和快速结果。
- 在诊断婴儿脑损伤方面具有潜在的临床应用。
结论
- 开发的方法有效分析婴儿尿液中的神经递质。
- MHPG显示出作为早期脑损伤检测生物标志物的前景。
- 这种方法可以增强临床环境中的诊断能力。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable quantification of catecholamine neurotransmitters and their metabolites in biological fluids is critical for early-stage biomarker discovery and mechanistic de-risking in neurodevelopmental research. The described HPLC-ECD workflow with packed-fiber solid phase extraction (PFSPE) enables simultaneous, sensitive measurement of multiple analytes in complex matrices, supporting translational biomarker identification and portfolio triage. This capability advances predictive confidence at the interface of discovery and preclinical validation for neurodevelopmental disorder pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of catecholaminergic pathway activity in disease-relevant biological fluids.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying unstable neurotransmitter targets and metabolites.
- Facilitates identification of translational biomarkers for early neurodevelopmental risk assessment.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, reproducible extraction and detection of multiple monoamines and metabolites from urine samples.
- Standardizes sample pretreatment and minimizes analyte loss, improving assay reliability.
- Provides quantitative outputs suitable for comparative analysis and screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns urinary catecholamine metabolite measurement with early biomarker discovery for neurodevelopmental disorders.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical biomarker validation.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative metabolite profiles.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and translational research by enabling high-confidence measurement of neurotransmitters and metabolites in clinical samples, supporting biomarker-driven go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Provides quantitative hypothesis testing for catecholaminergic pathway involvement in neurodevelopmental risk.
- Screening: Establishes reproducible, multiplexed assay conditions for reliable compound or biomarker evaluation.
- Analytics: Generates calibration curves and quantitative readouts for cross-sample comparison and statistical analysis.
- Translational Research: Links urinary metabolite profiles to early disease risk, supporting biomarker continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable workflow for other biological fluids and neurochemical targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodevelopmental biomarker research.
- Operational Value: Streamlines sample preparation, reduces time and cost, and enhances reproducibility.
- Strategic Value: Improves early-stage decision-making and capital efficiency by enabling robust biomarker validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental disorder programs based on quantitative biomarker data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in HPLC-ECD operation and solid-phase extraction techniques.
- Demands careful sample handling to prevent analyte degradation and light exposure.
- Needs standardized protocols for cross-team reproducibility and data comparability.
- Adaptable to other biological matrices with validation of extraction and detection parameters.
- Limited by the instability of catecholamines and the need for rapid, protected sample processing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:27
Preparation of the Columns and Solutions Needed for the Extraction and Determination of Catecholamines
4:44
Preparation of Real Urine Samples and Mobile Phase
6:25
PFSPE Extraction and HPLC Analysis
9:58
Results: Identification and Quantification of Extracted Catecholamines and their Metabolites in Urine
11:43
Conclusion
