小鼠胚胎心脏前体细胞群体的定量整体免疫荧光分析

本方法的总体目标是定量评估心脏发生过程中心脏前体细胞的定位与分布。通过观察正常胚胎发育过程中心脏前体细胞群体的定位，该方法有助于解答心脏发育领域的关键问题。该技术的主要优势在于，体积分层成像可提供有关组织水平动态的定量信息，且分析流程可实现自动化，从而提高实验的可重复性。

尽管该方法可提供有关早期心脏器官发生的信息，但也可应用于早期胚胎发生的常规研究，或其他感兴趣器官的形态发生研究。在胚胎发育第8天早晨，用70%乙醇对怀孕小鼠腹部进行消毒，并切开皮肤和体壁，形成腹部切口。从一侧输卵管上方开始，仔细解剖沿子宫侧缘的脂肪组织，直至宫颈。

在宫颈处做切口，并继续向上切至另一侧输卵管的上端，以完整取出整个子宫。将子宫放入含有新鲜PBS的10厘米培养皿中，清洗去除多余血液，并在每个蜕膜之间剪断子宫系膜。在解剖显微镜下，将胚胎转移至含有新鲜PBS的6厘米培养皿中，并使用5号精细镊子从蜕膜组织上剥离子宫组织。

接下来，小心切开蜕膜中胚胎部分的顶端以暴露胚胎，轻轻捏住蜕膜，仔细推拉将第一个胚胎取出。在不破坏胚胎形态的前提下，尽可能剥离多余的胚外组织，并使用移液器将胚胎转移至含有预冷新鲜PBS的1.5毫升离心管中，置于冰上。当所有胚胎均采集完毕后，吸除各管中的PBS，并用新鲜PBS冲洗胚胎。

将每管中的 PBS 完全吸除后，在室温下用 4% 多聚甲醛固定胚胎 1 小时，随后用新鲜 PBS 洗涤三次，然后将胚胎置于 4 摄氏度保存。开始实验时，加入 1 毫升封闭缓冲液，在室温下封闭 4 小时。封闭结束后，弃去封闭缓冲液，加入适量的一抗混合液与稀释的封闭缓冲液，在 4 摄氏度下孵育过夜。

第二天早上，吸去多余的抗体，用含0.1%Triton的PBS溶液清洗胚胎，每次清洗一小时，共清洗三次。第三次清洗后，向胚胎中加入适当的二抗混合液，在室温下孵育三小时，随后按上述方法进行三次清洗。接着，用DAPI的PBS溶液对胚胎进行复染，染色10分钟，然后进行两次五分钟的清洗，最后将胚胎缓慢悬浮于抗荧光淬灭封片剂中，让胚胎在溶液中平衡至少一小时，并定期轻轻 flick（轻弹）以帮助样本沉入溶液。

在固定胚胎之前，于每张载玻片上用双面胶带制作两组平行的胶带堆，每组由五到六层双面胶带组成，两组之间相距15至20毫米，并在每张载玻片上两胶带堆之间的位置滴加一滴15微升的抗荧光淬灭剂。小心地将一个胚胎转移至每一滴抗荧光淬灭剂中，并使用解剖显微镜和精细镊子将胚胎调整至其腹侧背离载玻片，且其体轴与载玻片的长轴对齐。放置盖玻片时，先将盖玻片的一侧轻轻搭在一组双面胶带堆上，然后用镊子缓慢放下盖玻片，使其轻轻接触另一组胶带堆。

准确放置和固定胚胎尤为重要。位置不正确的胚胎将难以成像，并可能需要额外处理才能获得良好的可量化数据。使用移液器在载玻片和盖玻片之间添加额外的抗荧光淬灭剂，以防止样品在成像过程中干燥，并选择能够在一个视野内完整捕获心脏新月区的最高放大倍数物镜。

然后使用标准的最佳成像实践设置成像参数，并采用奈奎斯特采样率确定每个胚胎的 XYZ 体素尺寸。为分析胚胎图像，将原始图像数据集载入相应的图像分析软件中，并在“surpass”视图中打开第一个文件。数据将以最大强度投影模式在三维视图中加载。

打开显示调节窗口，仅选择参考通道。根据需要调整图像的阈值。如果信噪比过低导致无法分割，可调整伽马值。

在图像采集过程中遵循最佳实践对于获得合适的数据至关重要，具体操作取决于所使用的显微镜系统。如果需要调整伽马值，则这些图像不应用于荧光强度的比较。使用表面算法对话框为参考通道创建新的表面，并勾选“仅分割感兴趣区域”选项。

调整边界框区域，使其包含由参考染色划定的目标区域，并从源通道下拉菜单中选择参考通道。将平滑值设置为Z轴体素尺寸的一半，使用阈值滑块将下限调整至其绝对强度，以确保表面不会超出通道信号范围。通过体素数量或体积对对象进行筛选，剔除算法可能生成的任何背景对象，然后完成算法操作。

接下来，选择新创建的表面，并从编辑窗口中选择“掩膜集”功能。选择感兴趣的实验通道，注意在应用掩膜前勾选“复制通道”复选框，并且仅在显示调整窗口中选择掩膜通道。然后按照刚刚演示的方法创建一个新的表面。

为了获取每个选定表面的体积数据，请在统计选项卡中打开详细信息子选项卡，并从下拉菜单中选择平均值。生成表格的“总和”列中将显示该表面的总体积。此处展示的是一个胚胎第8.25天的小鼠胚胎，其心室心血管前体细胞呈GFP阳性，并使用抗心脏新月体抗体进行标记，如前所示。

选择染色组织的参考通道后，在启动创建表面算法之前，需调整强度和伽马值。选定感兴趣区域，并设置表面细节水平。对初始表面进行阈值处理，以包含表面中的所有真实信号。

随后进行滤波处理，以去除微小的背景碎片，从而获得最终的参考表面。通过选择该参考表面，可复制并遮蔽比较通道。在通过相同的步骤序列生成第二个表面之前，需先调整该通道的强度和伽马值。

随后会自动计算每个表面的总体积，并可进行定量和视觉上的比较。在进行此操作时，需要注意解剖后胚胎的质量、抗体效率、封片方向以及成像设置均会影响最终数据的质量。除了该定量分析流程外，还可采用其他方法（如去卷积）以获得额外的定性数据。

该技术问世后，为心脏发育领域的研究人员探索早期胚胎发生过程中新型心脏前体细胞群体的动态变化奠定了基础。