用 MDCK-SIAT1 细胞 Microneutralization 法测定人血清中中和 (H3N2) 病毒的流感中和抗体反应
2017年11月22日
流感中和抗体与流感感染的保护相关。Microneutralization 测定检测人血清中和抗体, 通常用于流感人血清学。我们描述了一个 microneutralization 的方法, 使用 MDCK-SIAT1 细胞测量中和抗体滴的当代 3 c. 2 a 和 3 c. 3 a a (H3N2) 病毒在流感疫苗接种或感染后。
该微量中和试验的总体目标是使用 MDCK-SIAT1 细胞测量人血清中对当代 H3N2 流感病毒的中和抗体反应。该方法可用于回答评估流感免疫力的关键问题。例如，它可以确定流感疫苗接种是否诱导对循环的 H3N2 病毒产生足够的中和抗体反应，以防止感染。
该技术的主要优点是它利用 MDCK-SIAT1 细胞和微量中和试验来检测抗体对 H3N2 流感病毒抗原簇复位的反应。在用于微量中和测定之前，应将病毒原液增殖至高感染滴度。从 AH3N2 病毒在 MDCK-SIAT1 细胞中繁殖开始此过程，如文本方案中所述。
第一天，在室温下解冻一小瓶病毒，并立即将病毒放在冰上。要在两种不同的起始稀释度下检测病毒，首先将 100 μL 病毒添加到 99 mL病毒稀释剂中，以实现 10：2 的预稀释度。然后将 1 mL 的 10：2 预稀释液加入 9 mL 的病毒稀释液中，进行 10：3 的预稀释。
使用两个微量滴定板，向所有孔中加入 100 μL 微量稀释剂，但 96 孔微量滴定板的第一列除外。接下来，进行半对数 10 稀释。向第 1 列的所有孔中加入 146 μL 病毒起始稀释液，并将 46 μL 从第 1 列连续转移到第 11 列。
在色谱柱之间更换移液器吸头。混合第 11 列后，丢弃稀释液为 46 μL 的吸头。使用第 12 列作为细胞对照，其中仅包含病毒稀释剂。
然后将板在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下孵育 1 小时。按照文本方案中的说明准备 MDCK-SIAT1 细胞。向微量滴定板的每个孔中加入 100 微升稀释的细胞。
并盖上盘子。将细胞在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下孵育 18 至 20 小时。第 2 天，首先从微量滴定板中取出培养基，进行 ELISA。
用 200 微升 PBS 洗涤每个孔后，向每个孔中加入 300 微升冷的 80% 丙酮。并在室温下孵育 10 分钟。然后，去除固定剂。
并让盘子风干。接下来，在抗体稀释剂中将抗 A 型流感蛋白单克隆抗体稀释至目标浓度。用 300 微升洗涤缓冲液洗涤板 3 次。
然后向每个孔中加入 100 μL 稀释的一抗。将板在室温下孵育 1 小时。对于二抗添加，将 HRP 抗体偶联的山羊抗小鼠 IgG 稀释至抗体稀释剂中的靶标浓度。
用 300 微升洗涤缓冲液洗涤板 3 次。向每个孔中加入 100 μL 稀释的二抗，然后在室温下孵育板 1 小时。接下来，用 300 微升洗涤缓冲液洗涤板五次。
然后点击无绒擦拭。向每个孔中加入 100 微升新鲜制备的底物。并在室温下孵育，直到显色饱和并且细胞对照孔的光密度或 OD 小于 0.2。
然后向所有孔中加入 100 微升终止液。使用微孔板分光光度计读取 490 纳米处孔的 OD。如文本协议中所述，使用 Reed-Muench 方法计算病毒的 TCID50。
在 MN 测定的第一天，在 37 摄氏度的水浴中解冻血清，并在解冻后立即取出。如 Text Protocol 中所述，在 56 摄氏度的水浴中加热并激活人血清 30 分钟。然后将血清置于冰上，将病毒稀释剂加入血清中，以达到 1：10 的预稀释度。
要使用一种病毒进行测试，请在 B 行到 H 行（第 11 列和第 12 列除外）添加 50 微升病毒稀释剂。然后，向 A1 至 A10 列中加入 100 μL 1：10 稀释血清。从 A 行到 H 行进行两次连续稀释，并丢弃 H 行的最后 50 μL。为了控制病毒，向 A12、B12、C12 和 D12 孔中加入 50 μL 病毒稀释剂。
对于细胞对照，向 E12、F12、G12 和 H12 孔中加入 100 微升病毒稀释剂。对于对照血清，向 A 孔第 11 列中加入 100 μL 稀释的对照血清。并向 B11 至 H11 孔中加入 50 微升病毒稀释剂。
继续连续稀释。盖上板子，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下孵育，直到准备好添加病毒。对于病毒添加，用病毒稀释剂将病毒稀释至 100 TCID50 在 50 μL 中。
向所有孔中加入 50 微升稀释的病毒，但背滴定板和细胞对照孔上的第 11 列、所有板上的 E12、F12、G12 和 H12 除外。向第 11 列的所有孔中加入 50 μL 病毒稀释剂。然后将 50 微升的 100 TCID50 病毒以 50 微升的形式加入到第一个孔中。
接下来，混合并将 50 μL 转移到连续的孔中，以进行两次连续稀释。更换孔之间的移液器吸头以避免病毒携带。从 H11 孔中丢弃 50 微升。
然后，向第 11 列加入 50 μL 病毒稀释剂，使最终体积达到 100 μL。轻敲板子进行混合。将板在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下孵育 1 小时，然后像以前一样在第 1 天进行 MDCK 细胞添加，在第 2 天进行 ELISA。
如文本实验步骤中所述，添加一抗和二抗后，进行底物添加和板读数。用 300 微升洗涤缓冲液清洗板五次，然后轻拍无绒湿巾。向每个孔中加入 100 微升新鲜制备的 OPD 底物。
然后，在室温下孵育板，直到病毒对照孔达到 0.8 至 3 之间的 490 纳米光密度，细胞对照处于低于 0.2 的低背景 OD。接下来，向所有孔中加入 100 微升终止液。使用微孔板分光光度计读取 490 纳米处孔的 OD。
最后，确定每个血清样品的中和抗体滴度，如文本方案中所述。微中和测定的代表性结果如下所示。每个孔中的 OD 代表在含有中和抗体的连续稀释血清存在的情况下，MDCK-SIAT1 细胞中病毒感染和复制的量。
50% 中和临界值定义为病毒对照孔的中位 OD 加上细胞对照孔的中位 OD 除以 2，达到等于或大于 50% 中和的最高血清稀释度的倒数被认为是血清样品的抗体滴度。在这个例子中，在 2016 年至 2017 年流感季节，对两名患者接种流感前后收集的配对血清进行了疫苗中使用的 H3N2 病毒检测。对于患者 1 的疫苗接种前血清，没有任何血清稀释液抑制病毒感染，因此被认为是阴性的。
接种疫苗后，该患者的血清显示中和作用。该血清的第三次稀释是低于 50% 临界值的最高稀释度，因此该患者的疫苗接种后滴度为 40。相比之下，来自第二名患者预接种的血清含有滴度为 320 的预先存在的中和抗体。
接种疫苗后，滴度增加到大于 1280。在这种情况下，在 1：10 的血清预稀释液中，未达到抗体末端滴度。血清可以在更高的预稀释度下重新测试，以达到最终滴度。
使用 MDCK-SIAT1 细胞的微量中和试验在检测 H3N2 流感病毒近期抗原簇的中和抗体反应方面具有高度的灵敏度、特异性和稳健性。通过使用常规 MDCK 细胞，该程序还可用于检测对 H3N2 病毒其他毒株和流感病毒其他亚型的抗体反应，以评估对流感的保护性免疫。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本文描述了一种使用MDCK-SIAT1细胞进行的微中和测定法，用于测量现代H3N2流感病毒的中和抗体反应。该测定法对于评估疫苗接种或感染后的流感免疫至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 病毒学
- 血清学
背景
- 流感中和抗体对于防御感染至关重要。
- 微中和测定法常用于评估人类血清中的这些抗体。
- MDCK-SIAT1细胞被用于检测抗体反应的有效性。
- 了解抗体反应有助于评估流感疫苗的效力。
研究目的
- 测量H3N2流感病毒的中和抗体滴度。
- 确定流感疫苗在诱导保护性抗体反应方面的有效性。
- 评估该测定法检测对流行H3N2毒株反应的能力。
使用的方法
- 在MDCK-SIAT1细胞中培养H3N2病毒。
- 微中和测定法测量抗体反应。
- 评估人类血清中中和抗体滴度。
- 比较疫苗接种后和感染后的反应。
主要结果
- 该测定法成功测量了中和抗体反应。
- 疫苗接种诱导了针对流行毒株的足够抗体反应。
- MDCK-SIAT1细胞为这些测定法提供了可靠的平台。
- 结果有助于了解流感免疫。
结论
- 微中和测定法对于评估流感免疫有效。
- 它可以帮助制定针对H3N2流感病毒的疫苗策略。
- 进一步的研究可能会增强对抗体反应随时间变化的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate measurement of neutralizing antibody titers is essential for evaluating influenza vaccine efficacy and informing strain selection in biopharma R&D. The use of MDCK-SIAT1 cells improves assay sensitivity for contemporary A(H3N2) viruses with altered receptor binding, enhancing predictive confidence in immunogenicity data. This supports go/no-go decisions in preclinical and clinical vaccine development by providing quantitative, reproducible readouts of functional immunity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of hemagglutinin as a target by measuring antibody-mediated neutralization of viral infectivity.
- Operational Value: Provides a quantitative assay format to compare immune responses across vaccine candidates or viral strains.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dose-response data from serial serum dilutions to calculate IC50-equivalent neutralizing titers.
- Operational Value: Standardizes virus-antibody incubation and infection steps using MDCK-SIAT1 cells for improved assay robustness with drifted H3N2 strains.
- Scientific Value: ELISA-based detection of viral nucleoprotein offers a specific, quantitative readout of infection levels post-neutralization.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational bridge from human serology to preclinical models by defining protective titer thresholds.
- Operational Value: Enables longitudinal assessment of antibody responses in vaccine studies to inform dosing and schedule optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the immunogenicity evaluation workflow following antigen expression and purification, serving as a functional readout prior to challenge models or clinical correlation studies.
- Discovery Biology: Measures functional antibody activity to validate immunological relevance of HA-targeted vaccine candidates.
- Screening: Delivers reproducible neutralization titers to rank immunogenicity of vaccine formulations against drifted H3N2 strains.
- Analytics: Outputs OD-based infection metrics analyzed via Reed-Muench to derive TCID50 and neutralizing titers with defined 50% cutoff criteria.
- Translational Research: Connects in vitro neutralization data to clinical protection estimates through established correlates of immunity.
- Enterprise Reuse: Platform can be adapted for other influenza subtypes by updating virus strain and maintaining MDCK-SIAT1 cell substrate for sialic acid-dependent strains.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces false-negative results in antibody screening by improving viral infectivity in assay systems for antigenically drifted H3N2.
- Operational Value: Increases assay consistency through standardized virus titration (100 TCID50/well) and defined incubation parameters (18–20 h, 37°C, 5% CO2).
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement of vaccine candidates by providing early, quantitative immunogenicity data linked to protection.
- Portfolio Impact: Enables cross-strain comparison of vaccine-induced responses to guide strain selection in multivalent or updated vaccine design.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology for safe handling and titration of influenza virus stocks.
- Dependent on access to MDCK-SIAT1 cells and biosafety level 2 infrastructure for virus propagation and assay execution.
- Necessitates standardized reagents including anti-NP monoclonal antibodies and substrate systems for ELISA detection.
- Requires optimization when extending to influenza subtypes with differing receptor binding preferences.
- Subject to variability in serum heat inactivation and pre-dilution steps that must be controlled for reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:09
Determination of Tissue-culture Infectious Dose (TCID) of the Virus
5:44
Microneutralization (MN) Assay Using MDCK-SIAT1 Cells
9:44
Results: Microneutralization Assay Results of Human Sera tested Against A/HongKong/4801/2014 A(H3N2) Virus Using MDCK-SIAT1 Cells
11:25
Conclusion
