Name: 用 MDCK-SIAT1 细胞 Microneutralization 法测定人血清中中和 (H3N2) 病毒的流感中和抗体反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: 学习使用MDCK-SIAT1细胞进行微量中和试验，测定人血清中对H3N2流感病毒的中和抗体反应。该方法可评估疫苗接种后的免疫保护效果，为流感疫苗策略提供重要依据。

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我们感谢美国疾病控制与预防中心流感部门的卢秀华博士、刘峰博士以及阿什利·伯勒斯女士对本文准备工作的审阅与帮助&#160;本手稿。我们感谢流感部门的Adrian Reber博士&#160;美国疾病控制与预防中心（CDC）提供的协助，感谢其在准备图示方面给予的支持 图3最后，我们感谢德国马尔堡的 M. Matrosovich 博士提供 MDCK-SIAT1 细胞。

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</ol>

作者声明无利益冲突。本文的调查结果和结论仅代表作者观点，不一定代表疾病控制与预防中心和资助机构的立场。

微量中和（MN）试验是用于流感血清学的主要试验之一，用于检测流感感染或疫苗接种后的抗体反应。许多流感血清流行病学研究常将MN试验测得的滴度作为主要结局指标。MN试验还广泛用于血清学诊断以及疫苗免疫原性的评估。已有国际多中心实验室研究对在不同实验室中进行的MN试验进行了比较14。
与血凝抑制试验（HI）不同，微量中和试验（MN）旨在直接测定能够在细胞培养中中和病毒感染的功能性抗体。目前全球各地的实验室使用多种形式的微量中和试验。该试验的读出结果（即，中和抗体存在时病毒感染性的降低可通过ELISA定量病毒NP抗体、HA定量病毒，或在抗体存在下感染病毒并在细胞培养中孵育后，对每个孔中的病毒蚀斑进行免疫染色来评估14,15基于荧光的各种形式蚀斑减少中和试验（例如，焦点减少试验和ViroSpot试验常用于大量流感病毒野外分离株的抗原特性分析，部分原因是这些试验所需的病毒量较少<sup clas...

流感病毒每年仍在人类中引起发病和死亡。血凝素（HA）是流感病毒的主要表面糖蛋白。靶向HA的中和抗体是与预防流感感染相关的最主要免疫机制1,2。血凝抑制（HI）试验和中和试验（MN试验）是两种广泛用于检测流感感染或疫苗接种后人血清中抗体反应的方法3。HI试验通过检测抗体对病毒凝集红细胞能力的抑制作用进行评估，被视为一种替代性检测方法。与HI试验不同，MN试验可直接测定人血清中在细胞培养中中和流感病毒感染的抗体水平。MDCK细胞常用于流感病毒的分离及MN试验4。
流感病毒持续发生抗原漂移和抗原转变，其血凝素（HA）蛋白上获得的突变可能改变病毒的受体结合特异性。自2014年以来，新型A(H3N2)病毒簇出现并持续流行至今。根据HA蛋白的系统发育分析，这些病毒大多属于基因型3C.2a和3C.3a。许多流行的3C.2a病毒株对红细胞的血凝能力降低，因此无法通过血凝抑制（HI）试验进行表征。5中和试验必须用于检测针对这些不具有血凝活性病毒的抗体反应6此外，研究表明，与早期的A(H3N2)病毒相比，这些当代A(H3N2)病毒的受体结合特性发生了改变，并且在传代过程中倾向于积累适应培养的突变和多态性 体外 细胞培养7,8,9与传统的MDCK细胞相比，MDCK-SIAT1是由Matrosovich开发的一种细胞系 等 通过将人源α2,6-唾液酸转移酶（SIAT1）的cDNA稳定转染至MDCK细胞中获得。该细胞系表达的α2,6-唾液酸半乳糖基团较亲代MDCK细胞增多，而α2,3-唾液酸基团含量减少10MDCK-SIAT1 细胞相较于 MDCK 细胞可提高 A(H3N2) 病毒的分离率11。最近，Lin 等 有研究报道，对于新出现的3C.2a和3C.3a人A(H3N2)流感病毒，在MDCK-SIAT1细胞系中培养相比在MDCK细胞中培养，可实现更忠实的病毒复制和更高的病毒感染性。7因此，MDCK-SIAT1细胞在微量中和试验（MN assays）中更适用于表征针对近期A(H3N2)病毒变异株的抗体反应。
在此，我们描述了一种利用MDCK-SIAT1细胞进行的微中和（MN）检测方法，用于测定人血清中针对当前流行的3C.2a和3C.3a亚型A(H3N2)病毒的抗体应答。病毒可在鸡胚或细胞中培养。&#160;可用于本实验。含有中和抗体的热灭活血清首先进行系列稀释，然后与100 TCID50将流感A(H3N2)病毒加入孔中，使血清中的抗体与病毒结合。随后将MDCK-SIAT1细胞加入病毒-抗体混合物中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育18–20小时。2 以使A(H3N2)病毒感染MDCK-SIAT1细胞并进行复制。经过过夜孵育后，固定培养板，并使用抗流感病毒A型核蛋白（NP）单克隆抗体通过ELISA定量每孔中的病毒量。NP的检出表明存在病毒感染且无中和抗体存在。中和抗体滴度定义为能够提供≥50%病毒感染抑制率的最高血清稀释度的倒数。

<table><tbody><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;含高糖的达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>生命科学</td><td>11965</td><td>无菌细胞培养、病毒扩增与病毒稀释培养基的关键组分</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）第五组分，无蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117332001</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>生命科学</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>生命科学</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>遗传霉素G-418二硫酸盐&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1720-5G&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>生命科学</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>生命科学</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>VWR</td><td>67-64-1</td><td>以80%的浓度使用</td></tr><tr><td>含过硼酸钠的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBF2806V</td><td></td></tr><tr><td>邻苯二胺二盐酸盐片</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBQ1086V</td><td>每100 ml细胞培养级水中加入1片</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A510-P500</td><td>使用终浓度为 0.5 M</td></tr><tr><td>变性乙醇，4L</td><td>VWR</td><td>EM-AX0422-3</td><td>使用浓度为70%</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>生命科学</td><td>1748048</td><td></td></tr><tr><td>RDE II &quot;Seiken&quot;</td><td>Denka Seiken</td><td>370013</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-500ml</td><td></td></tr><tr><td>抗NP小鼠单克隆抗体</td><td>Millipore 混合液</td><td>MAB 8257 MAB 8258</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG HRP&amp;nbsp;</td><td>KPL</td><td>074-1802</td><td></td></tr><tr><td>96孔平底板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>分子装置</td><td>Spectromax 384 plus</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶 162 cm²/带通气盖</td><td>Corning/VWR</td><td>3151</td><td></td></tr></tbody></table>

利用mdck-siat1细胞通过微量中和试验测定人血清中针对a(h3n2)流感病毒的中和抗体反应

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

针对流感病毒血凝素（HA）的中和抗体被认为是与预防流感感染相关的最主要免疫机制。微量中和（MN）试验常用于检测流感疫苗接种或感染后人血清中的中和抗体反应。Madin-Darby 犬肾（MDCK）细胞是MN试验中常用的细胞基质。然而，目前流行的3C.2a和3C.3a亚型A(H3N2)流感病毒已获得改变的受体结合特异性。表面具有更多α-2,6唾液酸半乳糖基团的MDCK-SIAT1细胞系已被证明可为这些当代A(H3N2)病毒提供更高的感染效率和更真实的复制效果，优于传统的MDCK细胞。本文介绍了一种使用MDCK-SIAT1细胞的MN试验方法，已优化用于定量检测针对这些当代A(H3N2)病毒的中和抗体滴度。在本方案中，首先将含有中和抗体的热灭活血清进行系列稀释，然后与每孔100 TCID50的A(H3N2)流感病毒孵育，使血清中的抗体与病毒结合。随后将MDCK-SIAT1细胞加入病毒-抗体混合物中，在37 °C、5% CO2条件下孵育18–20小时，使A(H3N2)病毒感染MDCK-SIAT1细胞。过夜孵育后，对培养板进行固定，并使用抗流感A核蛋白（NP）单克隆抗体通过酶联免疫吸附试验（ELISA）定量各孔中的病毒量。中和抗体滴度定义为能够提供≥50%病毒感染抑制率的最高血清稀释倍数的倒数。

测定病毒储备液的感染性是中和试验（MN试验）的第一步。图2展示了用于确定病毒储备液TCID50的板式布局。对于感染性未知的病毒储备液，可从多个预稀释度（例如10-2和10-3）开始进行滴定，以获得最佳滴定曲线来计算病毒的感染性。MN试验中使用的病毒量应标准化为每孔100 TCID50（50 µL）。为达到每孔100 TCID50，病毒储备液的最低稀释度为1:100。
 
图3 描述了使用MDCK-SIAT1细胞进行微中和试验的关键步骤。将热灭活血清在96孔板中进行系列稀释，如图所示。 图4. 100 TCID50/50 &#181;L ...

流感中和抗体与预防流感感染的保护作用相关。微量中和试验用于检测人血清中的中和抗体，常用于流感的人体血清学研究。本文描述了一种使用MDCK-SIAT1细胞的微量中和试验，用于检测流感疫苗接种或感染后针对当前流行的3C.2a和3C.3a A(H3N2)病毒的中和抗体滴度。

利用MDCK-SIAT1细胞通过微量中和试验测定人血清中针对A(H3N2)流感病毒的中和抗体反应

针对流感病毒血凝素（HA）的中和抗体被认为是与保护作用相关的主要免疫机制，用于……

本微量中和试验的总体目标是利用MDCK-SIAT1细胞测定人血清中针对当前流行的H3N2流感病毒的中和抗体反应。该方法可用于回答评估流感免疫性的关键问题。例如，可用来确定流感疫苗是否能够诱导产生足够的中和抗体反应，以预防流行H3N2病毒的感染。该技术的主要优势在于利用 MDCK-SIAT1 细胞和微量中和试验来检测针对 H3N2 流感病毒重配抗原簇的抗体反应。在进行微量中和试验前，病毒储备液应扩增至高感染性滴度。请按照文本方案中的详细说明，首先在 MDCK-SIAT1 细胞中扩增 A/H3N2 病毒以启动本实验流程。第一天，在室温下解冻一管病毒，随后立即将病毒置于冰上。为在两种不同起始稀释度下检测病毒，首先将100微升病毒加入99毫升病毒稀释液中，配制10:2预稀释液。然后取1毫升10:2预稀释液加入9毫升病毒稀释液中，配制10:3预稀释液。使用两块微量滴定板，在除96孔微量滴定板第一列之外的所有孔中各加入100微升微量稀释液。接着进行10倍半对数稀释。将146微升病毒起始稀释液加入第一列所有孔中，然后从第一列至第十一列依次逐孔转移46微升。每列之间更换移液器吸头。混合第十一列后，丢弃带有46微升稀释液的吸头。第十二列作为细胞对照，仅含有病毒稀释液。然后在37摄氏度、5%二氧化碳条件下将培养板孵育一小时。按照文本方案中的描述准备MDCK-SIAT1细胞。向微孔板的每孔中加入100 µL稀释后的细胞悬液。盖上培养板，将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育18至20小时。第二天，首先从微量滴定板中移除培养基，然后进行ELISA实验。每孔加入 200 微升 PBS 洗涤后，向每孔中加入 300 微升预冷的 80% 丙酮。于室温孵育 10 分钟。随后，去除固定液。让平板自然风干。接下来，用抗体稀释液将抗流感病毒A核蛋白单克隆抗体稀释至目标浓度。用300 µL洗涤缓冲液洗涤平板三次。然后向每个孔中加入100微升稀释的一抗。在室温下孵育一小时。对于二抗孵育，将辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG抗体用抗体稀释液稀释至目标浓度。用 300 微升洗涤缓冲液将酶标板洗涤三次。每孔加入 100 微升稀释的二抗，然后在室温下孵育酶标板一小时。接着，用 300 微升洗涤缓冲液将酶标板洗涤五次。然后轻触无绒擦拭布。向每孔加入100 µL新配制的底物，并在室温下孵育，直至显色达到饱和，且细胞对照孔的光密度（OD）小于0.2。然后向所有孔中加入100微升终止液。使用酶标仪在490纳米波长下测定各孔的OD值。根据文本方案中所述的Reed-Muench法计算病毒的TCID50。在微中和试验的第一天，将血清置于37摄氏度水浴中解冻，解冻后立即取出。按照文本方案所述，将人血清在56摄氏度水浴中加热活化30分钟。随后将血清置于冰上，并加入病毒稀释液，使血清预稀释至1:10。若使用一种病毒进行检测，在第11和第12列除外的情况下，向B至H行各孔中加入50微升病毒稀释液。然后，向A1至A10列各孔中加入100微升1:10稀释的血清。从A行至H行进行两倍系列稀释，并弃去H行的最后50微升。对于病毒对照，在A12、B12、C12和D12孔中各加入50微升病毒稀释液。对于细胞对照，在 E12、F12、G12 和 H12 孔中各加入 100 微升病毒稀释液。对于对照血清，向 A 列第 11 行孔中加入 100 微升稀释的对照血清，并向 B11 至 H11 孔中各加入 50 微升病毒稀释液。继续进行系列稀释。盖上培养板，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育，直至准备加入病毒。进行病毒添加时，用病毒稀释液将病毒稀释至每50微升中含有100 TCID50。除返滴定板的第11列以及所有板上的细胞对照孔E12、F12、G12和H12外，在其余所有孔中加入50 µL稀释后的病毒。在第11列所有孔中加入50 µL病毒稀释液。然后在第一个孔中加入50 µL含100 TCID50的病毒液（体积为50 µL）。接下来，混匀后取50微升转移至后续孔中，进行两倍系列稀释。每次移液至不同孔时需更换移液器吸头，以避免病毒残留。从H11孔中弃去50微升。然后，向第11列加入50微升病毒稀释液，使最终体积达到100微升。轻敲酶标板以混匀。将酶标板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时，随后于第一天进行MDCK细胞添加，第二天进行ELISA，操作同前。按照文本方案中所述添加一抗和二抗后，进行底物添加和酶标板读数。用300微升洗涤缓冲液将酶标板洗涤五次，并在无绒布上轻拍。向每孔中加入100微升新鲜配制的OPD底物溶液。然后，将培养板在室温下孵育，直至病毒对照孔在490纳米处的光密度值达到0.8至3之间，同时细胞对照孔的背景OD值较低，低于0.2。接着，向所有孔中加入100 µL终止液。使用酶标仪在490纳米处读取各孔的OD值。最后，按照文本方案中所述方法测定每份血清样本的中和抗体滴度。此处展示了微量中和试验的代表性结果。每个孔中的吸光度（OD）值代表在含有系列稀释的中和抗体血清存在下，MDCK-SIAT1细胞中病毒感染与复制的程度。50%中和效价的临界值定义为病毒对照孔的中位OD值与细胞对照孔的中位OD值之和除以2，达到或超过50%中和效应的最高血清稀释度的倒数即被视为该血清样本的抗体滴度。在本示例中，采集自两名患者的配对血清（流感疫苗接种前和接种后）在2016至2017流感季节期间，针对疫苗所含的H3N2病毒进行了检测。患者1的疫苗接种前血清在各个稀释度下均未抑制病毒感染，因此被视为阴性结果。接种疫苗后，该患者的血清显示出中和作用。此血清的第三个稀释度是低于50% cutoff的最高稀释度，因此该患者接种疫苗后的滴度为40。相比之下，第二位患者接种前的血清中已存在中和抗体，滴度为320。接种疫苗后，抗体滴度升高至超过1280。本例中，在血清1:10预稀释条件下，未能达到抗体终点滴度。可对血清进行更高倍数的预稀释后重新检测，以确定终点滴度。使用MDCK-SIAT1细胞的微量中和试验在检测H3N2流感病毒近期抗原簇的中和抗体反应方面具有高度敏感性、特异性和稳健性。通过使用常规MDCK细胞，该方法还可用于检测针对其他H3N2病毒株及其他流感病毒亚型的抗体反应，以评估对流感的保护性免疫。

measuring-influenza-neutralizing-antibody-responses-to-h3n2-viruses

Research

科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

用 MDCK-SIAT1 细胞 Microneutralization 法测定人血清中中和 (H3N2) 病毒的流感中和抗体反应

本视频展示了利用过表达与α2,6连接的唾液酸的人类血清中的Madin-Darby犬肾细胞进行微量中和试验，以检测中和抗体。该试验常用于流感的人类血清学研究。...

一种用于测定人血清中中和抗体滴度的微量中和实验

本视频展示了基于成像的微量中和试验，用于分析甲型与乙型流感病毒之间的抗原关系。该方法可定量且直观地评估抗体或其他治疗方法在预防病毒感染方面的有效性。...

使用基于图像的微量中和试验分析病毒间的抗原关系

本视频展示了一种用于生成中和性流感病毒单克隆抗体逃逸变异株的技术。将抗体中和后的病毒悬液接种至鸡胚中，以选择性扩增逃逸变异株。由此获得的病毒群体主要为逃逸变异株，其存在经测序验证 通过...

生成流感病毒对中和抗体的逃逸变体

本视频展示了一种用于测定血清样本中流感病毒神经氨酸酶（NA）抑制性抗体滴度的检测方法。将含有抗NA抗体的血清样本加入包被有胎球蛋白（fetuin）的微孔板中。加入病毒后，抗体可阻止病毒NA切割胎球蛋白并暴露其半乳糖基团。随后加入辣根过氧化物酶标记的凝集素，该凝集素可结合暴露的半乳糖。通过比色法测定NA抑制性抗体滴度，即固定化的凝集素偶联过氧化物酶催化过氧化物酶底物产生显色反应。...

一种用于测定流感病毒神经氨酸酶抑制抗体滴度的检测方法

来源：Matthew J Murray1, Gary R McLean2,3, Matthew B...

一种用于检测人巨细胞病毒中和作用的免疫荧光方法

我们描述了一种用于测定血清中流感病毒神经氨酸酶（NA）抑制抗体滴度的酶联凝集素检测法（ELLA）。该检测方法利用花生凝集素来定量当神经氨酸酶从包被有胎球蛋白的96孔板上去除唾液酸后暴露出的半乳糖残基。...

通过酶联凝集素法测定流感病毒神经氨酸酶抑制抗体滴度

定量微量中和试验的优化

本文所述实验方案介绍了如何通过血凝抑制试验定量流感疫苗接种者血清样本中针对流感病毒的特异性抗体滴度。第一项试验通过血凝试验确定最佳病毒抗原浓度；第二项试验通过血凝抑制试验定量流感病毒特异性抗体滴度。...

一种优化的血凝抑制（HI）检测法用于定量流感特异性抗体滴度

甲型流感病毒（IAVs）是重要的人类呼吸道病原体。为了理解IAVs的致病性并进行新型疫苗策略的临床前测试，需要采用模拟人类生理特征的动物模型。本文描述了利用小鼠感染模型评估IAV致病机制、体液免疫应答及疫苗效力的技术方法。...

流感A病毒在感染小鼠模型中的研究

我们描述了一种方法，用于鉴定人源或鼠源单克隆抗体结合甲型流感病毒血凝素所必需的关键残基。该方案可适用于其他病毒表面糖蛋白及其相应的中和抗体。...

中和流感病毒单克隆抗体逃逸变异株的生成

本文介绍了一种假病毒包装的实验方案以及抗体中和活性的测定方法。...

利用磷酸钙转染法制备假型H5亚型禽流感病毒及抗体中和活性检测

学习使用MDCK-SIAT1细胞进行微量中和试验，测定人血清中对H3N2流感病毒的中和抗体反应。该方法可评估疫苗接种后的免疫保护效果，为流感疫苗策略提供重要依据。

利用MDCK-SIAT1细胞通过微量中和试验测定人血清中针对A(H3N2)流感病毒的中和抗体反应

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