使用三维基质的侵袭实验

科学家已开发出三维（3D）模型，以更准确地研究细胞侵袭和迁移过程。尽管大多数传统的细胞培养系统为二维（2D），但人体组织中的细胞存在于一种被称为细胞外基质（ECM）的分子三维网络中。虽然细胞在二维和三维环境中运动所需的许多机制过程相似，但ECM相对于塑料表面较低的刚度、迁移过程中增加的第三维度，以及细胞在ECM长链聚合物网格中穿行时所面临的物理阻碍，均使其面临与二维迁移不同的挑战。

本视频将简要介绍ECM的基本功能与结构，以及细胞对其调节和迁移的机制。接下来，我们将讨论用于研究内皮细胞侵袭的一般性实验方案。最后，我们将重点介绍三维基质在研究不同生物学问题中的若干应用。

首先让我们探讨细胞外基质（ECM）的组成，以及细胞如何与之相互作用。

细胞外基质具有多种功能，例如为细胞提供支持、促进细胞间通讯以及分隔不同组织。ECM的组成在不同组织中各不相同，具有不同的生物学特性，但大致可分为两类：基底膜用于锚定和分隔组织，而间质基质则包围并支持组织内的细胞。间质基质主要由纤维状蛋白胶原（collagen）构成，同时也包含弹性蛋白（elastin）和纤连蛋白（fibronectin）。

细胞在ECM中迁移需要发生多个生物学过程。第一个过程是细胞-基质黏附，该过程涉及一类称为整合素（integrins）的跨膜蛋白，它们将ECM与细胞内部的骨架结构——即细胞骨架——连接起来。

第二个过程是细胞骨架的结构重排，这会导致形成一种称为侵袭伪足（invadopodia）的特化结构，即细胞向周围基质延伸的突起。最后一步是ECM的调控，通常涉及一类称为基质金属蛋白酶（matrix metalloproteases，MMPs）的降解性分子。这些分子在侵袭伪足中聚集并降解周围的ECM，从而促进细胞侵袭。三维基质侵袭实验使科学家能够可视化并研究这一复杂过程。

现在您已经熟悉了细胞外基质（ECM）及其与细胞的相互作用，接下来我们将逐步介绍一种用于研究内皮细胞侵袭ECM并形成管状结构的实验方案。通过在三维环境中培养内皮细胞，可以模拟血管生成（即血管生长）这一生物学过程，该过程在正常发育和癌症发展中均具有重要意义。

首先，培养内皮细胞，并通过蛋白酶（如胰蛋白酶）处理并经筛网过滤，制备单细胞悬液以分散细胞团块。然后将三维基质（通常由胶原蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白或这些成分的更复杂组合构成，可由实验室自行制备或从商业供应商处购买）置于冰上解冻。由于大多数ECM在较高温度下会发生聚合，因此建议将其他实验设备和试剂也保持低温。将细胞悬液与解冻后的基质溶液混合，使细胞嵌入基质中，随后将混合物放入细胞培养孵育箱中，在较高温度下诱导基质聚合。

待含细胞的基质凝固后，向基质培养皿中加入含有促血管生成因子的培养基。利用延时显微成像软件，可追踪单个细胞在基质中的迁移行为。对获得的图像进行分析，根据细胞位置计算其迁移方向和以微米为单位的迁移距离。这些数值可用于绘图，以确定细胞的运动活性——即细胞的平均迁移速率。最后，通过可视化分析软件观察并分析管状网络的形成，识别节点、管状结构和环状结构等特征。

现在，让我们探讨三维基质在特定实验中的一些应用。

细胞迁移由细胞骨架的主动调节介导。在此实验中，制备胶原基质并混入含红色荧光蛋白的染料，以便进行可视化观察。分离出单个细胞球体（即悬浮的细胞簇），并将其嵌入胶原基质中。孵育后，对嵌入的细胞进行特定细胞骨架组分的染色，并通过荧光显微镜成像。研究人员观察到细胞在穿过细胞外基质（ECM）时，细胞骨架组分及其变化情况。

科学家还可以研究细胞外基质（ECM）的特性如何影响细胞迁移。利用一种同心凝胶系统，将细胞嵌入内层凝胶基质中，周围包裹不同浓度的外层基质，科学家可通过延时显微镜追踪细胞从内层凝胶向初始无细胞的外层凝胶迁移的过程。研究人员发现，较高浓度凝胶的更大刚度导致细胞位移和细胞迁移总距离均增加。

最后，可在活体动物内进行基质侵袭实验，以在器官特异性的背景下研究血管生成。在此方法中，首先制备常用于组织工程的纤维蛋白凝胶（因其具有可生物降解的特性），随后将其植入小鼠肺部，并用纤维蛋白原蛋白制成的“胶水”固定凝胶。允许细胞迁移和新生血管形成过程持续7至30天，之后取出肺组织和纤维蛋白凝胶，进行固定和切片。对这些切片的成像显示，在植入的凝胶中形成了血管和肺泡，使研究人员得以在体内环境中深入了解肺发育这一关键过程。

您刚刚观看了 JoVE 关于细胞外基质侵袭实验的视频。本视频讨论了细胞外基质（ECM）的组成以及细胞如何在其中迁移，介绍了一种研究内皮细胞在三维基质中迁移的简单实验方案，并重点介绍了当前在细胞-ECM 相互作用背景下正在研究的多种细胞过程。由于内源性细胞迁移发生在三维空间中，因此使用三维培养技术最能模拟这些生物学条件。随着基质成分的不断优化，科学家将能够更精确地在实验室中复制并研究细胞迁移过程。一如既往，感谢您的观看！