利用点阵分析法研究细胞层的迁移

点阵实验的总体目标是评估黏附性细胞单层在微环境信号刺激下的迁移表型。该方法有助于回答癌症研究领域的一些关键问题，例如细胞因子或生长因子如何改变肿瘤细胞的运动能力。点阵实验的主要优势在于操作简便，并可获得可重复的实验结果。

尽管该方法可用于研究细胞运动性，但也适用于多种后续实验，例如对细胞进行染色以评估生长集落形态和细胞分散情况、免疫荧光染色、蛋白质及DNA或RNA分析，或向动物体内注射细胞。首先，将小鼠IV型胶原置于冰上解冻，并用50 µmol/L HCl稀释，配制3 mL浓度为10 µg/mL的IV型胶原溶液。向12孔玻璃底培养板的各孔中加入250 µL IV型胶原溶液，并将其放入大小合适、可紧密闭合的塑料盒中。

将湿润的纸巾覆盖并环绕在培养板周围，以制造一个湿润的培养环境，并盖上盒子。然后在室温下孵育培养板过夜。次日早晨，为去除未吸附的胶原蛋白和缓冲液，使用去离子水冲洗培养板两次，冲洗时应将水流对准培养板孔的边缘，而不是由孔底边缘与盖玻片形成的交界处。

在超净工作台中将培养板风干，立即使用或于4 °C保存最多五天。制备细胞悬液时，选用在DMEM/F12培养基中添加5%马血清培养至80%融合度的60 mm组织培养皿中的细胞。用不含钙和镁的DPBS洗涤细胞一次，随后加入500 μL室温的胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C、5% CO₂、湿润环境中孵育3至5分钟。

加入4.5毫升培养基重悬已脱落的细胞，以终止胰蛋白酶活性，并使用血细胞计数板对20微升细胞悬液进行计数。将剩余细胞转移至50毫升锥形管中，在200×g离心3分钟。随后吸除上清液，将细胞重悬于培养基中，调整细胞密度至3×10⁶个细胞/毫升。

将细胞接种于经胶原蛋白IV包被的12孔玻璃底板小孔内盖玻片的中央位置时，取10微升细胞悬液形成液滴，注意避免触碰或刮伤包被层。若接种的液滴非圆形，则无法形成圆形的细胞层；若包被层被触碰或刮伤，将影响细胞的良好贴附。将培养板置于37°C、湿润环境中孵育30分钟，以使细胞充分贴壁。

然后，在倒置显微镜下检查细胞贴壁情况。用一毫升培养基轻轻洗涤各孔两次，以去除未贴壁的细胞，然后向每孔加入一毫升培养基。在倒置显微镜下检查，确保无悬浮细胞残留，否则需再次洗涤各孔。

将细胞置于37摄氏度、5%CO2的湿润环境中孵育过夜，以获得结构清晰的细胞片层。使用倒置显微镜检查所有孔，确保细胞集落已正常生长。如有必要，标记不合适的孔并弃用。

根据每种实验条件，为培养板的每个孔做好相应标记。每种条件设两个或三个复孔。在细胞刺激前3小时，更换培养基，使用含0.1%马血清的DMEM/F12培养基对细胞进行饥饿处理。

然后，通过添加 EGF 或其他所需的介质刺激细胞。使用 1 µL 移液器，或轻轻摇晃培养板以混匀培养基。将培养板孵育 1 至 4 天，以观察边缘位移和边缘轮廓变化。

进行苏木精-伊红（H&E）染色时，先用 PBS 洗涤细胞两次，然后固定约两分钟。加入苏木精染液染色约两分钟，使细胞核着色。用自来水洗涤细胞 5 至 10 分钟，直至细胞核呈现蓝色。

然后用伊红对细胞质染色两分钟，再用去离子水冲洗细胞。将培养板自然晾干，然后翻转过来，使用直尺测量点样的直径。或者，也可用相机拍摄培养板的图像，再使用ImageJ软件分析点样的直径。

进行延时显微成像时，打开培养箱显微镜，并将温度调节至37摄氏度。用去离子水（DH2O）填充加湿器，然后将CO2浓度调节至5%。确保培养箱腔室已加湿，并确认电动载物台可自由移动。随后，关闭培养箱腔室，使显微镜适应37摄氏度的环境温度。

将培养板放置于孵育显微镜的载物台上，设置载物台列表，然后对每个细胞点的两个对边及中心位置进行成像。使用10倍物镜，每3分钟拍摄一次图像，持续15至24小时。下载数据后，使用Matlab等选定的软件进行图像分析。

最初，通过相差成像观察细胞点发现，在表皮生长因子（EGF）刺激后，具有侵袭性并能形成肺转移灶的乳腺癌细胞仍保持间充质表型。然而，在EGF刺激的细胞点中，更频繁地观察到单个细胞从细胞团块中迁移而出。为进一步评估这些能形成肺转移灶的乳腺癌细胞对EGF的反应，对经EGF刺激四天的细胞培养物进行了苏木精和伊红（H&E）染色分析。

事实上，EGF 刺激导致集落直径增大，表明 EGF 刺激的细胞迁移能力可能发生变化。在此点阵实验中，对形成集落的乳腺癌细胞施加 EGF 刺激后，连续九小时对细胞片边缘的细胞进行成像。PIV 分析显示，EGF 将细胞迁移速度从对照组细胞的 0.45 微米/分钟提高至 0.63 微米/分钟。

此外，EGF 将细胞方向性的变异性（即角度分布）从对照组培养中的 0.95 降低至 EGF 刺激培养中的 0.79。另外，正如培养四天后经 H 和 E 染色所观察到的，EGF 使上皮边缘在九小时内径向位移从 257 µm 增加到 356 µm。一旦掌握，该技术的实际操作时间仅为数小时。

完成此操作后，还可进行其他方法，如延时成像、免疫染色以及DNA和RNA分析，以回答更多科学问题。例如，可利用该方法分析蛋白质在快速或慢速迁移的细胞中是否存在差异表达，或细胞在向周围环境迁移时的表达变化。观看本视频后，您应能够充分理解如何建立点阵实验，并利用其评估贴壁的 cohesive 细胞层在微环境信号刺激下的迁移表型。