Name: 用点法分析细胞板的迁移 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 学习点法分析细胞板迁移，用于癌症生物学研究。该方法评估肿瘤细胞在微环境信号下的运动表型，操作简便且结果可重复，适用于免疫染色和分子分析等后续实验。

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作者感谢Bhagawat Subramanian、Yi (Jason) Chang、Paul Randazzo和Carole Parent对稿件的审阅与评论。本研究由美国国立卫生研究院国家癌症研究所的院内研究计划资助。

1. 培养皿包被（第1天）
注意：操作时请确保不要在板的底部留下指纹或污渍。
<ol>
	<li>将小鼠 IV 型胶原蛋白置于冰上解冻，并用 50 mM HCl（pH 1.3）稀释，配制 3 mL 浓度为 10 µg/mL 的 IV 型胶原蛋白溶液。 
	注意：IV 型胶原蛋白在 37 °C 时会发生沉淀。因此，在解冻和操作过程中必须将胶原蛋白溶液保持在低温条件下。为避免反复冻融，建议分装成适当体积的 aliquot 并储存于 -80 °C。</li>
	<li>向每个 12 孔玻璃底培养板的孔中加入 250 µL IV 型胶原蛋白溶液，并将其放入大小合适且可密封的塑料盒中。在培养板周围和上方放置湿润的纸巾以形成湿化腔，然后盖紧盒盖。于室温下孵育过夜。 
	注意：由于仅需对生长区域进行包被，因此只需用胶原蛋白溶液覆盖附着于板底的盖玻片即可（参见 图 1A, B 中培养板的示意图）。</li>
	<li>次日早晨，用去离子 H2O 洗涤培养板两次，以去除未吸附的胶原蛋白和缓冲液。将水流对准孔板边缘，避免直接冲向板底与盖玻片交界处（若将液体加入该区域，可能引起飞溅）。随后在超净台中将培养板风干。立即使用或于 4 °C 保存，最长可保存 5 天。 
	注意：不同细胞系可能需要不同的包被条件，例如纤连蛋白或 I 型胶原蛋白。</li>
</ol>
2. 点印迹实验的平板接种（第2天）
<ol>
	<li>制备细胞悬液
	<ol>
		<li>制备细胞悬液时，使用在含5%马血清的DMEM/F12培养基中、于60 mm组织培养皿中生长至80%汇合度的细胞</li>
		<li>用不含钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞一次，加入500 µL胰蛋白酶-EDTA（室温），在37 °C、5% CO2、湿润气氛的培养箱中孵育3–5分钟</li>
		<li>用4.5 mL培养基重悬脱落的细胞以终止胰蛋白酶活性，并用血细胞计数板对20 µL细胞悬液进行计数</li>
		<li>将剩余细胞在15 mL锥形管中以200 × g离心3分钟，吸除上清液，然后用培养基重悬细胞至浓度为3 × 106 个细胞/mL。 
		注意：对于其他包被基质和/或细胞系，需通过系列稀释确定最佳细胞密度。建议以3 × 106 个细胞/mL作为起始点</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种细胞
	<ol>
		<li>将10 µL细胞悬液滴加至IV型胶原包被的12孔玻璃底板每个盖玻片的中央，注意不要接触或刮伤包被层（图1A, B）。将培养板置于37 °C、湿润气氛中孵育30分钟，使细胞贴壁。在倒置显微镜下检查细胞是否已贴附。 
		注意：在液滴边缘处最易观察，此处可观察到单层细胞的形成（图1C）。如有必要，可将孵育时间延长至3小时。确保培养箱内湿度足够高，以防液滴快速干燥。若在此过程中观察到液滴体积减少，可在孔之间的空隙中加入PBS以提高湿度</li>
		<li>用1 mL培养基轻柔地洗涤各孔两次，以去除未贴壁细胞。每孔加入1 mL培养基。在倒置显微镜下检查是否仍有悬浮细胞，如有则需再次洗涤。将细胞在37 °C、5% CO2、湿润气氛中过夜培养，以获得界限清晰的细胞层。 
		注意：悬浮细胞可能重新贴附于培养板并形成不期望的细胞克隆</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 刺激细胞（第3天）
<ol>
	<li>使用倒置显微镜检查所有孔，确保细胞克隆已正常生长。如有必要，标记不合适的孔，并避免使用。</li>
	<li>根据所研究的每种条件，对培养板的每个孔进行适当标记。每种条件应设置重复或三重复。</li>
	<li>在刺激细胞前3小时，更换为含0.1%马血清的DMEM/F12培养基（饥饿培养基），以对细胞进行饥饿处理。</li>
	<li>通过添加EGF（终浓度5 ng/mL）或其他所需介质刺激细胞，并使用1 mL移液器轻轻混匀培养基，或通过轻柔旋转培养板实现混匀。</li>
	<li>将培养板孵育1至4天，观察边缘位移和边缘轮廓（如第4.1节所述），或进行时间推移成像（如第4.2节所述）。</li>
</ol>
4. 细胞克隆和细胞迁移的可视化
<ol>
	<li>苏木精-伊红（HE）染色法检测集落生长（第4–7天）
	<ol>
		<li>用70%乙醇（每孔1 mL）固定细胞，约2分钟。</li>
		<li>用苏木精对细胞核进行染色（每孔1 mL），约2分钟。</li>
		<li>用自来水洗涤细胞，每孔1 mL，直至细胞核呈蓝色，5 - 10 分钟。</li>
		<li>用伊红对细胞质染色（每孔1 mL），约2分钟。</li>
		<li>用去离子水冲洗（1 mL/孔）。 
		注意：苏木精和伊红溶液可收集并重复使用多次，直至染色效果变浅为止。</li>
		<li>风干平板。</li>
		<li>将培养皿翻转，用尺子测量斑点的直径。或者，使用相机拍摄培养皿照片，然后在 ImageJ 中分析斑点直径。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>延时显微成像（第3天）
	<ol>
		<li>打开培养箱显微镜并将温度调节至 37 °C。向加湿器中加入 dH₂O。2O. 调整CO2 至5%。确保培养箱内保持湿润，且电动载物台可自由移动。关闭培养箱，使显微镜适应37 °C环境。 
		注意：此处使用的显微镜（见材料表）应在细胞成像前至少预热 3 h 至 37 °C，以避免焦距漂移。</li>
		<li>将培养板放置于孵育显微镜的载物台上，并设置载物台列表。对每个细胞点的两条对边及中心位置进行成像（图1A).</li>
		<li>每3分钟拍摄一次图像，持续15至24小时，使用10X物镜&#160;目标。下载数据，并使用选定的程序进行图像分析， 例如，ImageJ 或 Matlab。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
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<li>Rosen, P., Misfeldt, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+density+determines+epithelial+migration+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell density determines epithelial migration in culture.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在肿瘤进展过程中，细胞会从起源组织迁移出来，侵袭周围组织并转移到远端部位15。细胞从细胞集落迁移的现象可通过点迁移实验（dot assay）进行观察。本文通过分析人乳腺癌细胞对表皮生长因子（EGF）刺激的迁移表型，示例性地展示了点迁移实验的操作方法。
为了获得准确且可重复的结果，点阵实验设置中的多个步骤至关重要。首先，包被平板的方式决定了细胞能否以及以多强的程度黏附于平板表面，并发生迁移。应确保使用IV型胶原蛋白或其他细胞外基质对平板进行均匀包被，以尽量减少实验变异性。此外，必须确认所研究的细胞能够在包被后的平板上贴附并迁移，可能需要通过多种基质在不同浓度下的多次实验，以优化特定细胞系的包被条件。其次，细胞接种的准确性对可重复性极为关键。细胞液滴的分布范围决定了细胞点的大小及其形状。理想情况下，应将液滴放置到位而不让移液器枪头接触表面。此时液滴的形状主要由平板表面的表面张力决定，从而形成直径可重复的圆形区域。因此，可通过改变接种的细胞悬液体积来调节细胞点的直径。
因此，在进行点样...

迁移实验被广泛用于在体外评估肿瘤细胞的侵袭性和转移潜能。in vitro。最常用的方法是划痕实验，用于评估上皮细胞层向无细胞区域的迁移能力1,2,3。进行划痕实验时，先将细胞接种形成单层，然后用移液器枪头制造一个&#34;划痕&#34;或无细胞区域。划痕实验操作简便，仅需常规的细胞培养耗材，可在多孔板中进行，便于同时处理多个样本。然而，在制造划痕的过程中，细胞会从单层中被物理性移除，并常伴随细胞死亡。此外，附着于培养板表面的细胞外基质也常在划痕过程中受到损伤。类似地，使用硅胶插件（如Ibidi小室4）或模板5,6,7也可能导致细胞的机械性破坏，并部分去除用于包被培养板的基质蛋白。另一类监测伤口或划痕闭合的实验的缺点是其时间进程有限，因为细胞迁移只能在划痕完全闭合前进行分析。
进行点状实验时，将细胞以圆形菌落的形式接种到有包被或无包被的培养板上8。这种接种策略的目的是获得具有明确边缘的细胞层，使其能够向周围无细胞区域迁移或侵袭，而无需通过去除细胞或插入物来干扰培养体系。点状实验的总体目标是通过边缘位移或菌落直径的变化来观察细胞层的迁移情况，同时进行延时成像，以更高时空分辨率分析细胞的迁移表型。
细胞迁移可受到多种微环境信号的影响，例如趋化因子、细胞因子以及表皮生长因子（EGF）等生长因子。&#160;EGF 是一种生长因子，通过与其受体 EGF receptor 结合而发挥生物学效应9，并可增强肿瘤细胞的侵袭性和转移能力4,9,10。本实验采用点阵法（dot assay）研究 EGF 对一种具有侵袭性、可在肺部形成克隆的人乳腺癌细胞系（MCF10CA1a）的细胞迁移作用8,11,12。

<table><tbody><tr><td>MCF10CA1a 细胞</td><td>Karmanos 研究所</td><td>N/A</td><td>用于检测的细胞</td></tr><tr><td>小鼠 IV 型胶原蛋白</td><td>BD Biosciences</td><td>354233</td><td>用于包被培养板</td></tr><tr><td>胰蛋白酶 / EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300054</td><td>用于从组织培养板上消化细胞</td></tr><tr><td>DPBS&amp;nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td>用于洗涤细胞</td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320082</td><td>用作培养基</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Thermo Fisher</td><td>26050088</td><td>用于补充培养基</td></tr><tr><td>12 孔玻璃底培养板</td><td>MatTek</td><td>P12G-1.5-14-F</td><td>用于培养用于成像的细胞</td></tr><tr><td>EGF（表皮生长因子，人重组）</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>用于刺激细胞</td></tr><tr><td>脂肪酸游离型 BSA</td><td>Sigma</td><td>A8806-1G</td><td>用于配制 EGF 缓冲液</td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Sigma</td><td>HHS32</td><td>用于染色细胞集落</td></tr><tr><td>伊红</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26051-10</td><td>用于染色细胞集落</td></tr><tr><td>37 &amp;#176;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Sanyo</td><td>型号 MCO-18AIC (UV)</td><td></td></tr><tr><td>配备培养箱腔室和电动载物台的蔡司 AxioObserver 显微镜</td><td>蔡司</td><td>型号 Axio Observer.Z1</td><td>用于延时成像</td></tr><tr><td>ORCA Flash LT sCMOS 相机</td><td>BioVision</td><td>C11440-42U-KIT</td><td>与蔡司 AxioObserver 联用进行延时成像</td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>BioVision</td><td>MMACQMIC</td><td>用于延时成像的软件</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>型号 IX70</td><td>用于细胞计数及组织培养中集落的观察</td></tr><tr><td>塑料盒</td><td>Lock&amp;Lock</td><td>N/A</td><td>用作保湿室（任何可紧密封盖且能容纳培养板的塑料盒均可使用）</td></tr></tbody></table>

利用点阵分析法研究细胞层的迁移

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

尽管复杂的生物体看似静止，其组织却处于持续的更新过程中。随着细胞老化、死亡并被新细胞取代，细胞会在组织内以高度协调的方式移动。在肿瘤发生过程中，这种平衡被打破，肿瘤细胞离开原始上皮层，侵入局部微环境，迁移到远端部位，并最终在远处形成转移性肿瘤。点迁移实验（dot assay）是一种简单、二维且无约束的细胞迁移检测方法，用于评估细胞层向无细胞区域的净移动，并通过延时成像分析细胞迁移的相关参数。本文以一种具有侵袭性、可在肺部形成克隆的人类乳腺癌细胞系 MCF10CA1a 为例，演示点迁移实验的操作过程，用于分析细胞对表皮生长因子（EGF）的迁移反应。已知 EGF 可增强乳腺癌细胞的恶性潜能，并改变细胞的迁移表型。

本文展示的点状实验（图1）采用具有侵袭性、可在肺部形成克隆的乳腺癌细胞（MCF10CA1a）作为模型系统。该点状实验即使由初学者操作，也能获得高度可重复的细胞点，因此是一种简便且易于实施的实验方法（图1D）。将点状实验与苏木精-伊红（HE）染色、延时成像以及后续的粒子图像测速（PIV）技术相结合，可研究多种迁移参数，包括上皮边缘的位移、细胞迁移速度和方向性，即上皮细胞层边缘的细胞向无细胞区域迁移的过程。最初，通过相差显微镜观察细胞点发现，在表皮生长因子（EGF）刺激后，具有侵袭性的肺部克隆形成型乳腺癌细胞（MCF10CA1a）仍保持间充质表型。然而，在EGF刺激的细胞点中，更频繁地观察到单个细胞从细胞层脱离（图2，箭头所示）。为进一步评估MCF10CA1a细胞对EGF的反应，对经EGF刺激4天的细胞培养物进行了HE染色。结果表明，EGF刺激显著增加了克隆的直径（...

细胞迁移对于发育、组织维持与修复以及肿瘤发生至关重要，其过程受到生长因子、趋化因子和细胞因子的调控。本实验方案描述了点迁移实验（dot assay），这是一种二维、无约束的迁移检测方法，用于评估贴壁的、具有完整性的细胞层在微环境信号刺激下的迁移表型。

尽管复杂的生物体看似静止不变，其组织却处于持续的更新过程中。随着细胞老化、死亡并被新细胞取代，细胞会发生移动……

点阵实验的总体目标是评估黏附性细胞单层在微环境信号刺激下的迁移表型。该方法有助于回答癌症研究领域的一些关键问题，例如细胞因子或生长因子如何改变肿瘤细胞的运动能力。点阵实验的主要优势在于操作简便，并可获得可重复的实验结果。尽管该方法可用于研究细胞运动性，但也适用于多种后续实验，例如对细胞进行染色以评估生长集落形态和细胞分散情况、免疫荧光染色、蛋白质及DNA或RNA分析，或向动物体内注射细胞。首先，将小鼠IV型胶原置于冰上解冻，并用50 µmol/L HCl稀释，配制3 mL浓度为10 µg/mL的IV型胶原溶液。向12孔玻璃底培养板的各孔中加入250 µL IV型胶原溶液，并将其放入大小合适、可紧密闭合的塑料盒中。将湿润的纸巾覆盖并环绕在培养板周围，以制造一个湿润的培养环境，并盖上盒子。然后在室温下孵育培养板过夜。次日早晨，为去除未吸附的胶原蛋白和缓冲液，使用去离子水冲洗培养板两次，冲洗时应将水流对准培养板孔的边缘，而不是由孔底边缘与盖玻片形成的交界处。在超净工作台中将培养板风干，立即使用或于4 °C保存最多五天。制备细胞悬液时，选用在DMEM/F12培养基中添加5%马血清培养至80%融合度的60 mm组织培养皿中的细胞。用不含钙和镁的DPBS洗涤细胞一次，随后加入500 μL室温的胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C、5% CO₂、湿润环境中孵育3至5分钟。加入4.5毫升培养基重悬已脱落的细胞，以终止胰蛋白酶活性，并使用血细胞计数板对20微升细胞悬液进行计数。将剩余细胞转移至50毫升锥形管中，在200×g离心3分钟。随后吸除上清液，将细胞重悬于培养基中，调整细胞密度至3×10⁶个细胞/毫升。将细胞接种于经胶原蛋白IV包被的12孔玻璃底板小孔内盖玻片的中央位置时，取10微升细胞悬液形成液滴，注意避免触碰或刮伤包被层。若接种的液滴非圆形，则无法形成圆形的细胞层；若包被层被触碰或刮伤，将影响细胞的良好贴附。将培养板置于37°C、湿润环境中孵育30分钟，以使细胞充分贴壁。然后，在倒置显微镜下检查细胞贴壁情况。用一毫升培养基轻轻洗涤各孔两次，以去除未贴壁的细胞，然后向每孔加入一毫升培养基。在倒置显微镜下检查，确保无悬浮细胞残留，否则需再次洗涤各孔。将细胞置于37摄氏度、5%CO2的湿润环境中孵育过夜，以获得结构清晰的细胞片层。使用倒置显微镜检查所有孔，确保细胞集落已正常生长。如有必要，标记不合适的孔并弃用。根据每种实验条件，为培养板的每个孔做好相应标记。每种条件设两个或三个复孔。在细胞刺激前3小时，更换培养基，使用含0.1%马血清的DMEM/F12培养基对细胞进行饥饿处理。然后，通过添加 EGF 或其他所需的介质刺激细胞。使用 1 µL 移液器，或轻轻摇晃培养板以混匀培养基。将培养板孵育 1 至 4 天，以观察边缘位移和边缘轮廓变化。进行苏木精-伊红（H&E）染色时，

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

用点法分析细胞板的迁移

本文描述了常用于体外研究细胞迁移和侵袭的高通可及性方法。in vitro...

体外 细胞迁移与侵袭实验

本文描述了一种在二维受限微环境中定量研究细胞自发迁移的方法。该方法利用微加工通道，可在单次实验中于不同条件下研究大量细胞的迁移行为。...

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本方案详细介绍了一种可定制的方法，用于测量细胞在趋化因子作用下的迁移行为，该方法也可用于测定药物从聚合物基质中扩散的速率。...

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使用自动化活细胞成像仪的简单迁移/侵袭实验流程

机械力在调控细胞迁移过程中起着重要作用。本实验方案展示了如何使用可变形的弹性水凝胶，通过玻璃微移液管和显微操作器施加局部刚度梯度，从而刺激细胞并诱导其结构和迁移行为的改变。...

单细胞硬度趋性实验用于评估细胞运动及相关信号事件的力学调控

本文介绍了一种用于定量评估细胞在颗粒状水凝胶内部及其界面处三维迁移的实验方案。...

量化细胞在颗粒状水凝胶生物材料内部及向其内部的三维迁移

学习点法分析细胞板迁移，用于癌症生物学研究。该方法评估肿瘤细胞在微环境信号下的运动表型，操作简便且结果可重复，适用于免疫染色和分子分析等后续实验。

利用点阵分析法研究细胞层的迁移

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