用点法分析细胞板的迁移
December 5th, 2017
细胞迁移是发展, 组织维护和修复, 和肿瘤发生的关键, 并由生长因子, 趋化因子, 和细胞因子调节。本协议描述的点法, 一个二维, 无约束的迁移分析, 以评估微提示的反应, 连接的, 有凝聚力的细胞表移表型。
点测定的总体目标是评估响应微环境线索的附着粘性细胞片的迁移表型。这种方法可以帮助回答癌症领域的关键问题，例如细胞因子或生长因子如何改变肿瘤细胞运动。斑点检测的主要优点是易于执行并用于可重复的结果。
虽然这种方法可以提供对细胞运动的见解，但它也适用于一系列后续分析，例如细胞染色以评估生长集落形态和细胞散射、免疫染色、蛋白质和 DNA 或 RNA 分析，或将细胞注射到动物体内。首先，在冰上解冻小鼠胶原蛋白 4，并用 50 微摩尔 HCL 稀释，制备 3 毫升每毫升 10 微克胶原蛋白 4 溶液。将 250 微升胶原蛋白 4 溶液添加到 12 孔玻璃底板的孔中，并将它们放入适当大小的密闭塑料盒中。
将湿纸巾放在板上和周围以形成潮湿室，然后关闭盒子。然后，将板在室温下孵育过夜。第二天早上，要移动未吸收的胶原蛋白和缓冲液，请使用去离子水冲洗板两次，将水很好地引导到板的边缘，而不是由边缘底部和盖玻片形成的边缘。
在层流罩中风干板，并立即使用或在 4 摄氏度下存放长达五天。为了制备细胞悬液，使用在 60 毫米组织培养皿中DMEMF12培养基中生长的细胞，并补充有 5% 马血清至 80% 汇合。使用不含钙和镁的 DPBS 冲洗细胞一次，然后加入 500 微升室温胰蛋白酶 EDTA，并在 37 摄氏度、5% CO2 和潮湿气氛中孵育细胞 3 到 5 分钟。
将分离的细胞悬浮在 4.5 mL 培养基中以终止胰蛋白酶活性，并使用血细胞计数器计数 20 μL 等分试样的细胞悬液。将剩余的细胞放入 50 mL 锥形管中，以 200 倍重力离心 3 分钟。然后，吸出上清液，将细胞重悬于培养基中，至每毫升 6 个细胞的 3 倍 10 至 6 个细胞。
要将细胞接种在胶原蛋白 4 涂层的 12 孔玻璃底板的每个盖玻片的中心，放置 10 微升细胞悬液滴，注意不要触摸或刮擦涂层。电镀非圆形液滴不会产生圆形细胞片，如果涂层被触摸或划伤，则会阻止细胞很好地粘附。将板在 37 摄氏度的潮湿环境中孵育 30 分钟，以使细胞附着。
然后，在倒置显微镜下检查是否附着。用 1 毫升培养基轻轻洗涤孔两次，以去除未贴壁的细胞，然后向每个孔中加入 1 毫升培养基。在倒置显微镜下检查没有漂浮细胞残留，否则再次清洗孔。
将细胞在 37 摄氏度下在 5% CO2 中在潮湿的气氛中孵育过夜，以获得轮廓分明的细胞片。使用倒置显微镜检查所有孔，以确保细胞集落正常生长。如有必要，标记不合适的孔，不要使用它们。
针对所研究的每种情况适当地标记板的每个孔。一式两份或一式三份运行每个条件。在刺激细胞前 3 小时，更换培养基以在含有 0.1% 马血清的DMEMF12中使细胞饥饿。
然后，通过添加 EGF 或其他所需的介质来刺激细胞。使用 1 微升移液器，或轻轻旋转板以混合培养基。将板孵育 1 到 4 天，以观察边缘位移和边缘轮廓。
要进行 H 和 E 染色，请用 PBS 洗涤细胞两次并固定约两分钟。加入苏木精约 2 分钟以对细胞核进行染色。用自来水清洗细胞 5 到 10 分钟，直到细胞核呈蓝色。
然后，用伊红对细胞质染色 2 分钟，然后用去离子水冲洗细胞。风干板，然后将其翻转过来，用尺子测量网点直径。或者，用相机拍摄板的照片，并使用 ImageJ 分析点直径。
要进行延时显微镜，请打开培养箱显微镜，并将温度调节至 37 摄氏度。用 DH2O 填充加湿器，然后将 CO2 调节至 5%确保培养箱室加湿，并且电动载物台可以自由移动。然后，关闭培养箱室，让显微镜调整到 37 摄氏度。
将板放在培养箱显微镜的载物台上并设置载物台列表，然后对两个相对的边缘和每个细胞点的中心进行成像。使用 10 倍物镜，每 3 分钟拍摄一次图像，持续 15 到 24 小时。下载数据并在所选程序（如 Matlab）中继续进行图像分析。
最初，细胞点的相差成像显示，侵袭性、形成肺集落的乳腺癌细胞在用 EGF 刺激后保持间充质表型。然而，在 EGF 刺激的细胞点中更频繁地观察到离开片状的单个细胞。通过对用 EGF 刺激 4 天的培养物进行 H 和 E 染色，进一步评估形成肺集落的乳腺癌细胞对 EGF 的反应。
事实上，EGF 刺激导致集落直径增加，表明 EGF 刺激的细胞的迁移可能发生改变。在该点测定中，用 EGF 刺激形成集落的乳腺癌细胞后，对片状边缘的细胞进行 9 小时的成像。PIV 显示，EGF 将细胞速度从对照细胞的每分钟 0.45 微米提高到每分钟 0.63 微米。
此外，EGF 将细胞方向性或角度扩散的变异性从对照培养物中的 0.95 降低到 EGF 刺激培养物中的 0.79。此外，正如 4 天后通过 H 和 E 染色观察到的那样，EGF 在 9 小时内将上皮边缘的径向位移从 257 微米增加到 356 微米。掌握后，这项技术的动手作时间为几个小时。
按照此程序，可以执行其他方法，如延时成像、免疫染色以及 DNA 和 RNA 分析，以回答其他问题。例如，它可用于分析蛋白质是否在快速或缓慢迁移的细胞中差异表达，或者细胞何时迁移到周围环境中。观看此视频后，您应该对如何设置点检测有很好的了解，并使用它来评估附着的粘性细胞片响应微环境线索的迁移表型。
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概述
点状分析是一种二维、不受约束的迁移分析，旨在评估附着、具有凝聚性的细胞层对微环境信号的迁移表型反应。这种方法在癌症研究中特别有用，用于理解各种因素如何影响肿瘤细胞的运动。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞迁移
- 癌症生物学
- 组织修复
背景
- 细胞迁移对发育和组织维护至关重要。
- 它在肿瘤发生中起着重要作用。
- 生长因子、趋化因子和细胞因子调节细胞迁移。
- 点状分析提供了对这些因素对细胞运动影响的见解。
研究目的
- 评估具有凝聚性的细胞层的迁移行为。
- 了解微环境信号对细胞运动的影响。
- 探索细胞因子/生长因子与肿瘤细胞运动之间的关系。
使用的方法
- 为细胞培养准备胶原蛋白四溶液。
- 使用12孔玻璃底板进行分析。
- 评估细胞散射和集落形态。
- 可进行后续分析，包括免疫染色和分子分析。
主要结果
- 点状分析对细胞迁移的结果具有可重复性。
- 它允许评估不同因素如何影响细胞运动。
- 获得的见解可以为进一步研究癌细胞行为提供信息。
- 促进了一系列后续分析，以加深对细胞动态的理解。
结论
- 点状分析是研究细胞迁移的有价值工具。
- 它提供了一种评估微环境因素影响的简单方法。
- 结果可以为更广泛的肿瘤生物学和治疗策略的理解做出贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
The dot assay enables biopharma R&D teams to quantitatively assess the migratory phenotype of cohesive cell sheets in response to microenvironmental cues such as growth factors. This supports target validation and mechanistic de-risking in oncology drug discovery by providing reproducible, quantitative readouts of cell motility changes. The assay’s simplicity and compatibility with downstream analyses enhance its utility in early discovery workflows for lead identification and predictive confidence building.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding growth factor effects on tumor cell motility.
- Operational Value: Provides reproducible, quantitative measurements of cell speed and directional persistence for target engagement assessment.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that modulate migratory phenotypes in disease-relevant models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative outputs (e.g., radial displacement, angular spread) suitable for high-content screening formats.
- Operational Value: Compatible with time-lapse imaging and automated analysis pipelines for scalable assay implementation.
- Reusability: Enables reuse of validated cell sheets for subsequent molecular analyses, increasing experimental efficiency.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance through use of invasive breast cancer cell models responsive to EGF.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by enabling correlative analysis with immunostaining and molecular profiling.
- Risk Mitigation: Reduces mechanistic ambiguity in migration-related targets through direct phenotypic observation.
Pipeline & Workflow Integration
The dot assay fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification, providing phenotypic data that informs go/no-go decisions before significant investment in preclinical programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cytokine/growth factor effects on cell motility pathways in tumor models.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cell sheets with quantifiable edge displacement metrics for compound evaluation.
- Analytics: Generates trackable parameters such as cell speed (micrometers/minute) and angular spread for comparative condition analysis.
- Translational Research: Enables seamless transition to molecular analysis (e.g., immunostaining, RNA profiling) on the same migrated cell sheets.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable phenotypic platform applicable across multiple projects studying cell migration in cancer and tissue repair.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in migratory response interpretation.
- Operational Value: Delivers standardized, low-variability results through defined protocols and time-lapse readouts.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of migration-modulating targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative motility phenotypes in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, time-lapse microscopy, and image analysis tools such as ImageJ or Matlab.
- Depends on access to incubator microscopes with environmental control (37°C, 5% CO2, humidity) for long-term imaging.
- Necessitates standardization of collagen coating and cell plating procedures to ensure reproducible sheet formation.
- Involves adaptation considerations when transferring to different cell types or extracellular matrix conditions.
- Limited to 2D migration analysis; does not capture 3D invasion or intravasation dynamics without complementary models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:47
Coating Dishes (Day 1)
1:55
Preparing Cell Suspension for Dot Assay (Day 2)
3:11
Plating Cells
4:22
Stimulating Cells (Day 3)
5:19
Hematoxylin-Eosin Staining to Measure Colony Growth (Days 4-7)
6:06
Time Lapse Microscopy
7:12
Results: Analysis of Migration of Cells Sheets Using the Dot Assay
8:55
Conclusion
