诱导C57BL/6小鼠实验性自身免疫性神经炎以进行功能与神经病理学评估的简易方法

本实验的总体目标是在小鼠模型中成功诱导实验性自身免疫性神经炎（EAN），以对疾病过程进行功能性和病理学分析。EAN模型可用于探讨周围神经病变相关的关键科学问题，同时也是潜在评估新型治疗药物疗效的理想模型。

该方法的主要优势在于提供了一种简单且客观的功能检测范式，可在小鼠EAN模型中应用。今天与我一同演示该实验操作的是来自墨尔本大学神经营养因子与髓鞘生物学实验室的本科生 Sang Won Yoo。在疾病诱导前3天，打开运动功能评估装置并开启照明按钮。

拿起小鼠，将其轻轻放入盛有红色食用染料的容器中。将小鼠放入行走舱内，将跑步机速度设置为15厘米每秒。启动跑步机，并点击“记录”按钮，使用步态功能成像系统捕捉小鼠持续36秒的跑步运动。

36 秒后，停止录像和跑步机，并将练习运行的视频文件保存到指定文件夹中。首次免疫前一天，使用配备 30-1/2 规针头的 0.5 毫升注射器，向已麻醉的 6 至 8 周龄雄性 C57BL/6 小鼠腹腔注射 250 微升含 1.6 微克/毫升百日咳毒素的小鼠等渗 PBS 溶液。然后，根据表格中的标准，按照 0 到 4 的评分等级对小鼠进行 EAN 临床体征评分，并如前所示进行运动功能评估。

第二天，取等体积新配制的溶于0.9%生理盐水的多肽溶液与含有20毫克/毫升结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂溶液，加入珠磨器中，在室温下以最高速度混合1分钟。用接种物填充配备23号针头的注射器，在排出注射器筒内空气前，将注射器倒置并轻轻振摇。注射前，去除肩胛骨之间中线外侧的毛发，并用70%乙醇对暴露的皮肤进行消毒。

然后，使用一把有齿镊夹住皮肤，通过皮下注射将50 µL溶液注入百日咳毒素处理的小鼠体内。次日早晨，按照上述方法，经腹腔注射给予250 µL PBS中含1.2 µg/mL的百日咳毒素，48小时后再次腹腔注射相同浓度（1.2 µg/mL）的百日咳毒素。第三次百日咳毒素注射后三天，在先前相同的注射部位再次给予50 µL新鲜配制的接种物，并在实验结束前每周两次监测动物的临床评分和运动功能。

在C57BL/6小鼠中，P0 180-199肽诱导的实验性自身免疫性神经炎（EAN）表现为单相病程，临床评分从首次免疫后第6天开始出现，首次免疫后第25天达到最高严重程度，随后在首次免疫后第40天出现一定程度的临床评分改善。小鼠在首次免疫后第6天即开始无法完成简单的跑步任务，到首次免疫后第35天时几乎完全丧失完成简单跑步机跑步任务的能力，且在首次免疫后第55天时跑步能力未见改善。对肽诱导EAN小鼠坐骨神经的半薄切片检查显示，与年龄匹配的健康对照组相比，存在脱髓鞘区域。

高倍透射电子显微镜图像可用于识别特定的神经病理学特征，例如脱髓鞘、髓鞘板层损伤，以及轴突应激的迹象（如线粒体肿胀）。这些动物模型还表现出急性轴突损伤，其证据是在坐骨神经中观察到创伤性升高的β-淀粉样前体蛋白表达，而在年龄匹配的健康对照组织中则未见此现象。此外，还观察到郎飞结增宽以及旁结区结构紊乱。

一旦掌握，每只小鼠的皮下注射可在大约5到10分钟内完成，且注射错误的可能性极低。在进行该操作时，必须仔细观察注射部位，以确保所有接种物均保留在注射部位内，无任何外漏。跑步机步态的视频采集非常有用，因为它能够计算其他参数，例如摆动时相或步长，而这些指标在评估新型治疗药物的有效性时可能具有重要意义。

观看本视频后，您应能充分掌握如何在 C57BL/6 雄性小鼠中诱导 EAN。此外，您还应能熟练掌握如何安全、准确地进行皮下注射，确保无注射操作误差。请务必注意，在使用针头和接种物时存在受伤风险，尤其是在使用锐器时。

因此，为了避免任何受伤风险，务必始终使用镊子，切勿用手直接接触皮肤或组织，同时应使用一次性注射器，并且在操作过程中切勿重新套上针帽。