C57BL/6 小鼠自身免疫性神经炎的功能和病理评价的简易方法

本报告概述了一个简单的方法, 成功诱导实验性自身免疫神经炎 (一) 使用髓磷脂蛋白零 (P0)_180-199肽结合弗氏的完整佐剂和百日咳毒素。我们提出了一个复杂的范例, 能够准确地评估在这一过程中出现的功能性赤字和神经病的程度。

该程序的总体目标是在小鼠模型中成功诱导实验性自身免疫性神经炎或 EAN，用于疾病过程的功能和病理分析。EAN 模型可用于解决与周围神经病变相关的关键问题。这也是一个可能研究新型治疗药物疗效的极好模型。

这种方法的主要优点是它提供了一个简单而客观的功能测试范例，当在鼠标中使用 EAN 模型时，可以应用该范例。今天与我一起演示该程序的是 Sang Won Yoo，他是墨尔本大学神经营养因子和髓鞘生物学实验室的本科生。在疾病诱导前 3 天，打开运动功能评估仪并打开灯光按钮。

拿起鼠标并将其放到装有红色食用染料的容器上。将鼠标放入步行隔间，并将跑步机的速度设置为每秒 15 厘米。打开跑步机并点击录制，使用步态功能成像系统捕捉鼠标的跑步动作 36 秒。

36 秒后，停止记录和跑步机，并将练习跑的 Practice-Run 视频文件保存在指定文件夹中。第一次免疫前一天，使用配备有 30-1/2 号针头的 0.5 毫升注射器，在 250 微升小鼠等渗 PBS IP 中施用每毫升 1.6 微克百日咳毒素，麻醉 6 至 8 周龄雄性 C57BL/6 小鼠。然后，根据表格以 0 到 4 的等级对小鼠的 EAN 临床症状进行评分，并进行刚才所示的运动功能评估。

第二天，将等体积的新鲜制备的肽溶液（溶于 0.9% 盐水中）和 20 毫克/毫升结核分枝杆菌溶液在完全弗氏佐剂中混合在微珠机中，并在室温下以最大速度混合溶液 1 分钟。在装有 23 号针头的注射器中装入接种物，并在排空注射器轴内的任何空气之前倒置并摇晃注射器。在接种之前，去除肩胛骨之间中线外侧的毛发，并用 70% 乙醇对裸露的皮肤进行消毒。

然后，使用一对 Adson 镊子抓住皮肤，并通过皮下注射将 50 微升溶液输送到注射百日咳毒素的小鼠中。第二天早上，如刚才所示，在 250 μL PBS IP 中输送每毫升 1.2 μg 百日咳毒素，然后在 48 小时后再注射每毫升 1.2 μg 百日咳毒素 IP。第三次百日咳注射后三天后，在与之前相同的注射部位再施用 50 微升新鲜制备的接种物，并每周两次监测动物的临床评分和运动功能，直至实验结束。

P0 180-199 肽诱导的 C57BL/6 小鼠 EAN 导致单相疾病，临床评分从第一次免疫后 6 天开始，第一次免疫后 25 天达到最高评分严重程度，随后在第一次免疫后 40 天出现一些临床评分改善。小鼠早在第一次免疫后 6 天就开始在简单的跑步任务中失败，在免疫后 35 天完成简单的跑步机跑步任务的能力很小，在第一次免疫后 55 天跑步能力没有改善。对肽诱导的 EAN 小鼠坐骨神经的半薄片的检查揭示了与年龄匹配的健康对照的坐骨神经相比，脱髓鞘区域。

高功率透射电子显微镜图像可以识别特定的神经病理学特征，例如脱髓鞘、髓鞘薄片损伤以及轴突应激迹象，例如线粒体肿胀。这些动物还表现出急性轴突损伤，坐骨神经中 β-淀粉样蛋白前体蛋白表达的创伤性升高证明了这一点，这在年龄匹配的健康对照组织中未观察到。还观察到节点的扩大和平行节点的中断。

一旦掌握，每只小鼠可以在大约 5 到 10 分钟内进行皮下注射，并且任何注射错误的可能性最小。在尝试此程序时，观察注射部位以确保所有接种物都留在注射部位内并且没有一个渗出，这一点非常重要。跑步机步态的视频捕捉非常有用，因为它可以计算其他参数，例如摆动阶段或步幅，这些措施在测试新疗法的疗效时可能变得很重要。

看完这个视频，你应该对如何在 C57BL/6 雄性小鼠中诱导 EAN 有了很好的了解。此外，您应该对如何安全准确地进行皮下注射有很好的了解，以确保没有注射错误。不要忘记，使用针头和接种物时，尤其是使用锐器时，可能会受伤。

因此，为避免任何受伤的机会，最好始终使用镊子，切勿用手抓住皮肤或组织，并且使用一次性注射器，在此过程中切勿重新盖帽。