Name: 利用二次 Nanoelectrospray 电离耦合高分辨质谱的实时呼吸分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 了解二次纳米电喷雾电离耦合高分辨质谱技术，用于实时分析呼出气体的化学成分。该方法可实现肺癌早期诊断及治疗监测，具有高灵敏度和特异性。

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本工作受到国家自然科学基金（编号：91543117）的资助。

注意：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。请佩戴适当的个人防护装备，例如，实验服、手套、护目镜、长裤和封闭式鞋头的鞋子。
1. 设置 Sec-nanoESI 源
<ol>
	<li>根据SESI流程设置Sec-nanoESI源， 即，将呼出气体引入并与电喷雾羽流相交，由带电液滴进行离子化（图1）。各实验室自行构建的来源取决于所用质谱仪的接口24,25. 此处，基于商用纳米电喷雾电离源（nanoESI源）搭建Sec-nanoESI源图2）并应用于台式四极杆轨道阱质谱仪。 
	注意：主体部分为一个立方体不锈钢腔室（长25 mm，内径13 mm）（图2b）带有一个入口（内径 4 mm），用于将纳米电喷雾毛细管引入腔室。因此，该腔室并非完全密封（图2b).</li>
	<li>在腔室两侧各安装两根不锈钢管（长度 8 mm，外径 5 mm，内径 3 mm），用于气体输送。</li>
	<li>在腔室的顶部和底部安装两片石英窗（内径 14 mm），用于通过肉眼或数码显微镜观察纳米电喷雾电离（nanoESI）毛细管尖端位置及纳米电喷雾状态。</li>
	<li>将腔室焊接到质谱仪的扫掠锥上。 
	注意：设计可能会因各实验室所用质谱仪的大气压接口的具体几何结构不同而有所变化。</li>
</ol>
2. 仪器优化
<ol>
	<li>根据制造商说明，对质谱仪的正离子和负离子检测模式进行校准。通过校准，优化质谱仪参数（如透镜电位和检测条件），以在指定分辨率下获得良好的灵敏度和峰形。本实验采用的质谱分辨率为70000。
	<ol>
		<li>使用商业ESI源执行Q Exactive的完整校准；然而，质量校准可使用任何兼容的离子源（包括定制离子源）完成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置质谱仪离子传输管（ITT）的温度 &#62; 100 °C。尽管最高温度可设置为350 °C，但这可能导致某些化合物分解。因此，本实验采用150 °C。 
	注意：对于采用采样孔而非ITT的质谱仪，应设置采样孔的温度 &#62; 100 °C</li>
	<li>根据溶剂的性质选择合适的ESI溶剂和流速例如，极性和挥发性）以及目标化合物（例如，质子亲和力）。水和甲醇以不同比例组成的混合液常被用作ESI溶剂25在本实验中，使用含有0.1%（v/v）甲酸的水溶液，因为已有文献报道该溶剂具有较高的离子化效率。13,19,23将电喷雾电离（ESI）溶剂的流速设定在0-1.5 μL/min范围内，并设为200 nL/min。 
	注意：使用前将 ESI 溶剂脱气 30 分钟。</li>
	<li>优化 Sec-nanoESI 源参数，主要调节 nanoESI 电压和 nanoESI 毛细管尖端位置。电压通常在 2.0 至 4.5 kV 范围内，此处使用 2.5 kV。 
	注意：随着流速增加，施加更高的电喷雾电离电压。喷针尖端与质谱仪进样口之间的距离可在1至5 mm范围内调整。优化后，在质谱图中观察到的归一化强度水平（NL）应为 &#62; 1×106 总离子流色谱图（TIC）的变化应 &#60; 正离子和负离子检测模式下的灵敏度均为10%。在以下质量范围内获取质谱图和总离子流图（TIC）： m/z 50-750.</li>
	<li>向源端通入纯净气体。此步骤为可选，旨在减少室内空气中挥发性有机化合物（VOCs）的干扰。使用高纯度氮气（N₂）2，99.99%）或纯净空气均可使用。当存在纯气体时，质谱中观察到的NL应为 &#62; 1×105 TIC 的变化应为 &#60; 正离子和负离子检测模式下的纯度均达到10%。高纯度N2 以 0.8 L/min 的流速输送。 
	注意：纯气体与呼吸气体的总流速应高于质谱仪狭缝处的流速。</li>
</ol>
3. 呼出气体的测量
<ol>
	<li>吸入室内空气，并以恒定流速进行正常呼气，将肺内所有气体完全呼出。通过受试者可见的压差计或流量计监测呼气流速。使用聚四氟乙烯（PTFE）管路输送呼出气体23。
	<ol>
		<li>为防止管路内水蒸气冷凝，可将管路加热至80–100 oC7,23,27，或使用Nafion干燥管28,29。本实验中，受试者呼气流速由流量计控制为0.4 L/min。</li>
		<li>将流量计的进气口连接至Nafion管（长度60 cm），以去除呼出气体中的水蒸气，并将流量计的出气口连接至PTFE管（长度13 cm，内径4 mm）。单次呼气测量耗时< &#60; 30 s。</li>
		<li>进行4–6次重复测量28,29。</li>
		<li>为尽量减少干扰因素，要求受试者在测量前至少30分钟内禁食、禁饮及禁止刷牙23。 
		注：为降低室内空气中挥发性有机物（VOCs）的影响，已有研究建议吸入纯净气体而非室内空气26。当使用Nafion管时，部分极性化合物可能损失。</li>
		<li>测量过程中，持续检查离子强度是否超过仪器的线性检测范围。信号饱和可能导致出现并非实际来源于样品中化合物的伪峰。通过鼻腔吸气时，部分环境中的挥发性有机物和颗粒物会被去除；但需注意，鼻腔通道内的化合物也可能被检测到。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 获取呼出气体指纹图谱及化合物的时间轨迹
<ol>
	<li>获取色谱图和质谱图。使用软件（例如 Xcalibur）记录色谱图和质谱图。由于这是直接质谱分析，未进行色谱分离，总离子色谱图（TIC）实际上表示质谱中检测到的所有信号的时间轨迹，而提取离子色谱图（EIC）则显示指定化合物的时间轨迹。 
	注意：对于其他商用质谱仪，可通过相应的数据采集软件获取色谱图和质谱图。</li>
	<li>通过在测量呼出气体时选择总离子色谱图中的若干扫描次数，获得呼出气体的指纹图谱。使用软件获取代表这些扫描次数平均值的质谱图。
	<ol>
		<li>为消除呼出气体指纹图谱中的背景峰，请使用软件中的“减去背景”工具。具体操作请参考仪器制造商提供的用户手册。简要步骤为：在未引入呼出气体样品时选择相同数量的扫描次数，将所得背景质谱图从呼出气体指纹图谱中扣除。 
		注意：本方法中，用于识别呼出气体指纹图谱特征的阈值定义为背景信号标准偏差的三倍。对于其他商用质谱仪，可使用相应的数据采集软件进行背景扣除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取指定化合物的时间轨迹。在呼出气体指纹图谱中选择目标化合物的峰，随后由软件获取该化合物的时间轨迹。</li>
</ol>

<ol><li>De Lacy Costello, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+volatiles+from+the+healthy+human+body%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Breath+Res%22%5BJournal%5D)">A review of the volatiles from the healthy human body.</a> J. Breath Res. 8 (1), 014001-014030 (2014).</li>
<li>Phillips, M., Greenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-trap+detection+of+volatile+organic+compounds+in+alveolar+breath%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Ion-trap detection of volatile organic compounds in alveolar breath.</a> Clin. Chem. 38 (1), 60-65 (1992).</li>
<li>Martínez-Lozano Sinues, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+variation+of+the+human+metabolome+captured+by+real-time+breath+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Circadian variation of the human metabolome captured by real-time breath analysis.</a> PLoS One. 9 (12), 0114422-0114438 (2014).</li>
<li>Garcia-Gomez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+electrospray+ionization+coupled+to+high-resolution+mass+spectrometry+reveals+tryptophan+pathway+metabolites+in+exhaled+human+breath%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Common%22%5BJournal%5D)">Secondary electrospray ionization coupled to high-resolution mass spectrometry reveals tryptophan pathway metabolites in exhaled human breath.</a> Chem. Common. 52 (55), 8526-8528 (2016).</li>
<li>Garcia-Gomez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+amino+acids+in+the+exhalome+by+secondary+electrospray+ionization-mass+spectrometry%3A+A+proof-of-principle+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of amino acids in the exhalome by secondary electrospray ionization-mass spectrometry: A proof-of-principle Study.</a> Clin. Chem. 62 (9), 1230-1237 (2016).</li>
<li>Martínez-Lozano Sinues, P., Kohler, M., Brown, S. A., Zenobia, R., Dallmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gauging+circadian+variation+in+ketamine+metabolism+by+real-time+breath+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Common%22%5BJournal%5D)">Gauging circadian variation in ketamine metabolism by real-time breath analysis.</a> Chem. Common. 53 (14), 2264-2267 (2017).</li>
<li>Gamez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time%2C+in+vivo+monitoring+and+pharmacokinetics+of+valproic+acid+via+a+novel+biomarker+in+exhaled+breath%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Common%22%5BJournal%5D)">Real-time, in vivo monitoring and pharmacokinetics of valproic acid via a novel biomarker in exhaled breath.</a> Chem. Common. 47 (17), 4884-4886 (2011).</li>
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<li>Li, X., Huang, L., Zhu, H., Zhou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+human+breath+analysis+by+secondary+nano-electrospray+ionization+ultrahigh+resolution+mass+spectrometry%3A+Importance+of+high+mass+resolution+and+mass+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct human breath analysis by secondary nano-electrospray ionization ultrahigh resolution mass spectrometry: Importance of high mass resolution and mass accuracy.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 31 (3), 301-308 (2017).</li>
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<li>Bregy, L., Martínez-Lozano Sinues, P., Nudnova, M. M., Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+breath+analysis+with+active+capillary+plasma+ionization-ambient+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Breath+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time breath analysis with active capillary plasma ionization-ambient mass spectrometry.</a> J. Breath Res. 8 (2), 027102-027110 (2014).</li>
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<li>Martínez-Lozano, P., Zingaro, L., Finiguerra, A., Cristoni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+electrospray+ionization-mass+spectrometry%3A+breath+study+on+a+control+group%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Breath+Res%22%5BJournal%5D)">Secondary electrospray ionization-mass spectrometry: breath study on a control group.</a> J. Breath Res. 5 (1), 016002-016012 (2011).</li>
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<li>Martínez-Lozano Sinues, P., Fernandez de la Mora, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+fatty+acid+vapors+in+breath+by+electrospray+ionization+and+atmospheric+pressure+Ionization-Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of fatty acid vapors in breath by electrospray ionization and atmospheric pressure Ionization-Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 80 (21), 8210-8215 (2008).</li>
<li>Martínez-Lozano Sinues, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breath+analysis+in+real+time+by+mass+spectrometry+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Respiration%22%5BJournal%5D)">Breath analysis in real time by mass spectrometry in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Respiration. 87 (4), 301-310 (2014).</li>
<li>Martínez-Lozano Sinues, P., Kohler, M., Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+diurnal+changes+in+exhaled+human+breath%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Monitoring diurnal changes in exhaled human breath.</a> Anal. Chem. 85 (1), 369-373 (2013).</li>
<li>Chen, H. W., Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutral+desorption+sampling+of+biological+surfaces+for+rapid+chemical+characterization+by+extractive+electropray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Neutral desorption sampling of biological surfaces for rapid chemical characterization by extractive electropray ionization mass spectrometry.</a> Nat. Protoc. 3 (9), 1467-1475 (2008).</li>
<li>Li, X., Hu, B., Ding, J., Chen, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+characterization+of+complex+viscous+samples+at+molecular+levels+by+neutral+desorption+extractive+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid characterization of complex viscous samples at molecular levels by neutral desorption extractive electrospray ionization mass spectrometry.</a> Nat. Protoc. 7 (6), 1010-1025 (2011).</li>
<li>Gordon, S. M., Szidon, J. P., Krotoszynski, B. K., Gibbons, R. D., O'Neill, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+organic+compounds+in+exhaled+air+from+patients+with+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Volatile organic compounds in exhaled air from patients with lung cancer.</a> Clin. Chem. 31 (8), 1278-1282 (1985).</li>
<li>Ding, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+extractive+electrospray+ionization+ion+trap+mass+spectrometry+in+vivo+breath+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Development of extractive electrospray ionization ion trap mass spectrometry in vivo breath analysis.</a> Analyst. 134 (10), 2040-2050 (2009).</li>
<li>Basum, G., Dahnke, H., Halmer, D., Hering, P., Mürtz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+recording+of+ethane+trances+in+human+breath+via+infrared+laser+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Online recording of ethane trances in human breath via infrared laser spectroscopy.</a> J. Appl. Physiol. 95 (6), 2583-2590 (2003).</li>
<li>Tøien, Ø <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+open+flow+respirometry+in+continuous+and+long-term+measurements%3A+design+and+principles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Automated open flow respirometry in continuous and long-term measurements: design and principles.</a> J. Appl. Physiol. 114 (8), 1094-1107 (2013).</li>
<li>Huang, L., Li, X., Xu, M., Huang, Z. X., Zhou, Z. <a target="_blank" href="http://www.cjcu.jlu.edu.cn/EN/abstract/abstract28124.shtml">Identification of relatively high molecular weight compounds in human breath using secondary nano electrospray ionization ultrahigh resolution mass spectrometry.</a> Chem. J. Chinese U. 38 (5), 752-757 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

基于商用纳米电喷雾电离（nanoESI）源构建的Sec-nanoESI源，其电离效率高于使用常规电喷雾电离（ESI）源的情况30。此外，在密闭腔室中，电离效率进一步提高，因为密闭环境可将电离过程与周围环境空气隔离，同时促进气体样品与喷雾羽流之间的混合。使用Sec-nanoESI时，相较于ESI源需要优化的参数更少，因而更易于安装、应用和维护。
若在使用二级纳米电喷雾电离质谱法（Sec-nanoESI-MS）进行呼气分析时未观察到信号或灵敏度显著下降，应检查喷雾毛细管尖端的位置以及毛细管尖端液滴的形成情况。将毛细管尖端与质谱仪的进样口对齐。若喷雾毛细管堵塞或尖端被污染，应更换为新的喷雾毛细管。否则，检查仪器的离子传输管（ITT）是否堵塞或污染。必要时更换或清洗离子传输管。在检查喷雾毛细管前，应关闭电喷雾（ESI）电压。将离子传输管的温度设为室温，并等待温度降至室温后再进行操作。
SESI-HRMS 已被证明是一种用于实时呼气分析的高灵敏度和高选择性技术<sup class="xre...

随着现代分析技术的快速发展，已在人类呼出气体中鉴定出数百种挥发性有机化合物（VOCs）1。这些VOCs主要来源于肺泡气（健康成年人约为350 mL）和解剖学死腔气（约150 mL）2，分别受机体代谢3,4,5,6,7,8和环境污染9的影响。因此，若能对这些VOCs进行有效识别，它们有望作为无创性生物标志物，用于疾病诊断和环境暴露评估。
尽管气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）是呼出挥发性有机物（VOCs）定性和定量分析应用最广泛的技术2，但近年来发展的直接质谱（MS）技术因其具有高时间分辨率和样品前处理简单等优势，已被用于实时呼吸分析。诸如质子转移反应质谱（PTR-MS）10、选择离子流动管质谱（SIFT-MS）11、二次电喷雾电离质谱（SESI-MS）12,13（也称为萃取电喷雾电离质谱，EESI-MS14,15）、痕量大气气体分析仪（TAGA）16以及等离子体电离质谱（PI-MS）17等直接质谱技术近年来均已被广泛研究。
在所有直接质谱技术中，SESI 以其作为通用软电离技术而著称19,20,21并且该源易于定制，可与不同类型的质谱仪联用， 例如飞行时间质谱仪8,15离子阱质谱仪14 和Orbitrap质谱仪12,18截至目前，SESI-MS 已成功用于呼吸系统疾病的诊断22, 测定昼夜节律3,6,23药代动力学7,8，并揭示代谢途径4, 等等最近，一种商用的SESI源已面世。
本研究建立了一种简便紧凑的二级纳米电喷雾电离源（Sec-nanoESI），并将其与高分辨质谱仪联用，实现了对呼出气体中挥发性有机物（VOCs）的实时检测。

<table><tbody><tr><td>超纯水</td><td>Merck Millipore, USA</td><td>MPGP04001</td><td>电阻率 &gt;18.2 M&amp;Omega;&amp;middot;cm</td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>F0507</td><td>对呼吸道具有腐蚀性。</td></tr><tr><td>氮气</td><td>广州世源气体有限公司，中国</td><td>N.A.&lt;sup&gt;a&lt;/sup&gt;</td><td>纯度 &gt;99.99%</td></tr><tr><td>Q Exactive 混合四极杆-轨道阱质谱仪</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>02634L(S/N)</td><td>注意高压和高温</td></tr><tr><td>NanoESI 电离源</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>ES002373(S/N); ES071(P/N)</td><td>注意高压和高温</td></tr><tr><td>纳升液相泵</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>5041.0010A(P/N)</td><td>/</td></tr><tr><td>Xcalibur 软件（版本 3.0）</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>BRE0008596</td><td>/</td></tr><tr><td>Dino-Lite 数字显微镜</td><td>特视达（苏州）科技有限公司，中国</td><td>CQ401833R(S/N)</td><td>/</td></tr><tr><td>Nafion 管</td><td>Perma Pure LLC, USA</td><td>ME60</td><td>/</td></tr><tr><td>PTFE 管（内径 4 mm）</td><td>东莞宏富绝缘材料有限公司，中国</td><td>N.A.</td><td>注意极性化合物可能损失</td></tr><tr><td>质量流量控制器</td><td>Line-Tech, 韩国</td><td>M15122007 (S/N)</td><td>/</td></tr><tr><td>流量计</td><td>余姚市工业自动化仪表厂，中国</td><td>40784</td><td>/</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;a&lt;/sup&gt;N.A.：不可用。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用高分辨质谱联用二次纳米电喷雾电离进行实时呼吸分析

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

呼出的挥发性有机化合物（VOCs）已引起广泛关注，因其可作为疾病诊断和环境暴露的无创生物标志物。本研究介绍了一种利用二次纳米电喷雾电离联用高分辨质谱法（Sec-nanoESI-HRMS）实时表征呼出VOCs的实验方案。自制的二次纳米电喷雾电离源基于商用纳米电喷雾电离源快速搭建而成。在扣除背景后的呼出气体质谱中检测到数百个峰，正离子和负离子检测模式下的质量精度分别为-4.0–13.5 ppm和-20.3–1.3 ppm。根据精确质量数和同位素分布，对这些峰指认了准确的元素组成。单次呼气测量耗时不到30秒，完成六次重复测量约需7分钟。

图3展示了在正离子和负离子检测模式下记录的质荷比（m/z）50–750范围内的呼出气体指纹图谱。在扣除背景后的呼出气体指纹图谱中，分别检测到291个峰（峰强度 &gt; 5.0×104）和173个峰（峰强度 &gt; 3.0×104），对应正离子和负离子检测模式。有关质谱中峰的鉴定方法，详见先前发表的文献12,18,24,29。简要而言，检测到了内源性挥发性代谢物以及来自室内空气的挥发性有机化合物（VOCs）。例如，m/z 74.0606处的峰（图3a）根据人类代谢组数据库（HMDB）可归因为呼出的N,N-二甲基甲酰胺或氨...

本文演示了一种利用二级纳米电喷雾电离结合高分辨质谱技术，实时表征呼出气体化学成分的实验方案。

呼出的挥发性有机化合物（VOCs）已引起广泛关注，因为它们可作为疾病诊断和环境暴露的生物标志物……

本实验的总体目标是利用二级纳米电喷雾电离联用高分辨质谱技术，对呼出气体的化学成分进行表征。该方法有助于解答医学领域的关键问题，例如疾病的早期诊断、治疗过程的监测以及环境暴露评估。该技术的主要优势在于可实现实时检测。该技术还具有高通量、高灵敏度、高特异性和操作简便等优点。该技术的应用已拓展至肺癌的诊断，因为在不同阶段的肺癌患者呼出气体中已发现多种潜在的生物标志物候选分子。通常，初次接触该方法的人员会遇到困难，因为离子源通常是自行组装的。直观的演示至关重要，因为目前该方法尚无标准操作流程。首先，按照二次电喷雾离子化过程设置一个次级纳米电喷雾离子源，其中将呼出气体引入并与电喷雾流相交，由带电液滴对其进行离子化。各个实验室的离子源取决于所使用的质谱仪。此处，二级纳米电喷雾电离源（nano ESI source）基于商用纳米电喷雾电离源，并将其连接至一台台式液滴进样四极杆-轨道阱质谱仪。该装置主体为一个立方体形的不锈钢腔室，带有一个用于引入纳米电喷雾电离毛细管的入口。腔室两侧各安装有一根不锈钢管，用于输送气体。腔室顶部和底部配有两片石英窗口，可通过肉眼或数字显微镜观察纳米电喷雾电离毛细管尖端的位置及纳米电喷雾情况。最后，将腔室焊接至质谱仪的扫掠锥上。请注意，设计可能因各实验室所用质谱仪的大气压接口具体几何结构不同而有所调整。根据仪器制造商的说明，对质谱仪在正离子和负离子检测模式下均进行校准。通过校准，可优化质谱仪参数（如透镜电位和检测条件），从而在指定的分辨率值下获得良好的灵敏度和峰形。使用商用 ESI 源执行完整的校准。此处采用 70,000 的质谱分辨率。质量校准可使用任何兼容的离子源进行，包括定制的离子源。将质谱仪离子传输管的温度设置为高于100摄氏度。尽管最高温度可设置为350摄氏度，但这可能导致某些化合物分解。根据溶剂性质及目标化合物的特性，选择适合的ESI溶剂。本实验中使用含有0.1%甲酸的水溶液，以获得较高的离子化效率。将ESI溶剂的流速设置在每分钟200纳升至1.5微升的范围内。优化二级纳米电喷雾电离（nano ESI）源参数，主要是纳米电喷雾电压和纳米电喷雾毛细管尖端位置。电压通常在2.0至4.5千伏之间，此处使用2.5千伏。通入高纯气体以减少室内空气中挥发性有机化合物（VOCs）的影响。此处使用高纯氮气，流速为 0.8 升/分钟。在通入高纯气体的条件下，质谱图中观测到的归一化强度水平应大于 1 × 10⁵，且在正离子和负离子检测模式下，总离子流（TIC）的波动应小于 10%。进行测量时，吸入室内空气，然后以恒定流速进行正常呼气，将肺内气体全部呼出。通过压力计或受试者可见的流量计监测呼气流速。将流量计的进气口连接至Nafion管，以去除呼出气体中的水蒸气。然后，将流量计的出口连接至聚四氟乙烯（PTFE）管，以输送呼出气体。在本实验中，受试者的呼气流速由流量计控制为0.4升/分钟。一次呼气测量耗时不到30秒。进行四到六次重复测量。为尽量减少混杂因素的影响，要求受试者在测量前至少30分钟内禁食、禁饮并避免刷牙。测量过程中，需持续检查铁离子信号强度是否超过仪器的线性检测范围。信号饱和可能导致产生并非来自样品中化合物的伪影峰。通过鼻腔吸气，可去除部分环境中的挥发性有机物（VOCs）和颗粒物。然而需要注意的是，鼻腔通道中的化合物也可能被检测到。使用软件记录色谱图和质谱图。由于这是直接质谱分析，未进行色谱分离，因此总离子流图（TIC）实际上表示质谱中检测到的所有信号随时间变化的轨迹，而提取离子流图（EIC）则显示特定化合物随时间变化的轨迹。此处展示的是实时呼出气体检测的代表性结果。内源性化合物烯丙醇的时间轨迹在不到七分钟内完成了六次重复测量。所有测量均在正离子检测模式下获得了可重复的、扣除背景干扰的呼吸指纹图谱。已检测到291种化合物。这些化合物很可能是醛类、酮类和炔烃类。在呼气指纹的负离子检测模式下，检测到173种化合物，主要来源于脂肪酸。观看此视频后，您应该能够很好地掌握如何搭建自制的 CESI 源并进行实时过程分析。一旦掌握，该测量可在几分钟内完成。前提是操作必须正确。在进行该操作时，重要的是要注意避免采样管路和内源性空气中的化合物产生干扰。了解该方法可为人体呼出气体提供研究依据，也可应用于其他系统，如模拟烷基化体系、离子模型以及逆向细胞系统。在完成该操作后，还可进行其他检测方法，如气相色谱-质谱联用（GCMS）、高分辨质谱（HPRCMS）等，以回答更多问题，例如光谱确证、分析物含量测定等。该技术问世后，为医学领域的研究人员探索疾病的诊断及治疗效果开辟了道路。

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利用二次 Nanoelectrospray 电离耦合高分辨质谱的实时呼吸分析

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