利用高分辨质谱联用二次纳米电喷雾电离进行实时呼吸分析

本实验的总体目标是利用二级纳米电喷雾电离联用高分辨质谱技术，对呼出气体的化学成分进行表征。该方法有助于解答医学领域的关键问题，例如疾病的早期诊断、治疗过程的监测以及环境暴露评估。该技术的主要优势在于可实现实时检测。

该技术还具有高通量、高灵敏度、高特异性和操作简便等优点。该技术的应用已拓展至肺癌的诊断，因为在不同阶段的肺癌患者呼出气体中已发现多种潜在的生物标志物候选分子。

通常，初次接触该方法的人员会遇到困难，因为离子源通常是自行组装的。直观的演示至关重要，因为目前该方法尚无标准操作流程。首先，按照二次电喷雾离子化过程设置一个次级纳米电喷雾离子源，其中将呼出气体引入并与电喷雾流相交，由带电液滴对其进行离子化。

各个实验室的离子源取决于所使用的质谱仪。此处，二级纳米电喷雾电离源（nano ESI source）基于商用纳米电喷雾电离源，并将其连接至一台台式液滴进样四极杆-轨道阱质谱仪。

该装置主体为一个立方体形的不锈钢腔室，带有一个用于引入纳米电喷雾电离毛细管的入口。腔室两侧各安装有一根不锈钢管，用于输送气体。腔室顶部和底部配有两片石英窗口，可通过肉眼或数字显微镜观察纳米电喷雾电离毛细管尖端的位置及纳米电喷雾情况。

最后，将腔室焊接至质谱仪的扫掠锥上。请注意，设计可能因各实验室所用质谱仪的大气压接口具体几何结构不同而有所调整。根据仪器制造商的说明，对质谱仪在正离子和负离子检测模式下均进行校准。

通过校准，可优化质谱仪参数（如透镜电位和检测条件），从而在指定的分辨率值下获得良好的灵敏度和峰形。使用商用 ESI 源执行完整的校准。此处采用 70,000 的质谱分辨率。

质量校准可使用任何兼容的离子源进行，包括定制的离子源。将质谱仪离子传输管的温度设置为高于100摄氏度。尽管最高温度可设置为350摄氏度，但这可能导致某些化合物分解。

根据溶剂性质及目标化合物的特性，选择适合的ESI溶剂。本实验中使用含有0.1%甲酸的水溶液，以获得较高的离子化效率。将ESI溶剂的流速设置在每分钟200纳升至1.5微升的范围内。

优化二级纳米电喷雾电离（nano ESI）源参数，主要是纳米电喷雾电压和纳米电喷雾毛细管尖端位置。电压通常在2.0至4.5千伏之间，此处使用2.5千伏。

通入高纯气体以减少室内空气中挥发性有机化合物（VOCs）的影响。此处使用高纯氮气，流速为 0.8 升/分钟。在通入高纯气体的条件下，质谱图中观测到的归一化强度水平应大于 1 × 10⁵，且在正离子和负离子检测模式下，总离子流（TIC）的波动应小于 10%。

进行测量时，吸入室内空气，然后以恒定流速进行正常呼气，将肺内气体全部呼出。通过压力计或受试者可见的流量计监测呼气流速。将流量计的进气口连接至Nafion管，以去除呼出气体中的水蒸气。

然后，将流量计的出口连接至聚四氟乙烯（PTFE）管，以输送呼出气体。在本实验中，受试者的呼气流速由流量计控制为0.4升/分钟。一次呼气测量耗时不到30秒。

进行四到六次重复测量。为尽量减少混杂因素的影响，要求受试者在测量前至少30分钟内禁食、禁饮并避免刷牙。测量过程中，需持续检查铁离子信号强度是否超过仪器的线性检测范围。

信号饱和可能导致产生并非来自样品中化合物的伪影峰。通过鼻腔吸气，可去除部分环境中的挥发性有机物（VOCs）和颗粒物。然而需要注意的是，鼻腔通道中的化合物也可能被检测到。

使用软件记录色谱图和质谱图。由于这是直接质谱分析，未进行色谱分离，因此总离子流图（TIC）实际上表示质谱中检测到的所有信号随时间变化的轨迹，而提取离子流图（EIC）则显示特定化合物随时间变化的轨迹。

此处展示的是实时呼出气体检测的代表性结果。内源性化合物烯丙醇的时间轨迹在不到七分钟内完成了六次重复测量。所有测量均在正离子检测模式下获得了可重复的、扣除背景干扰的呼吸指纹图谱。

已检测到291种化合物。这些化合物很可能是醛类、酮类和炔烃类。在呼气指纹的负离子检测模式下，检测到173种化合物，主要来源于脂肪酸。

观看此视频后，您应该能够很好地掌握如何搭建自制的 CESI 源并进行实时过程分析。一旦掌握，该测量可在几分钟内完成。前提是操作必须正确。

在进行该操作时，重要的是要注意避免采样管路和内源性空气中的化合物产生干扰。了解该方法可为人体呼出气体提供研究依据，也可应用于其他系统，如模拟烷基化体系、离子模型以及逆向细胞系统。在完成该操作后，还可进行其他检测方法，如气相色谱-质谱联用（GCMS）、高分辨质谱（HPRCMS）等，以回答更多问题，例如光谱确证、分析物含量测定等。

该技术问世后，为医学领域的研究人员探索疾病的诊断及治疗效果开辟了道路。