Name: 脉络细胞自体移植治疗老年性黄斑变性的再生疗法: 初步体内报告 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 了解脉络膜上腔自体脂肪干细胞与血小板移植治疗干性老年性黄斑变性的再生疗法。该方法通过减缓视网膜细胞凋亡、促进血管化来改善低视力患者的视敏度和视网膜敏感度。

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作者没有致谢。

本研究方案已获得低视力学院伦理委员会的批准，所有受试者均签署了符合《赫尔辛基宣言》的书面知情同意书。该研究已获得拉夫堡大学和谢菲尔德大学的伦理批准。
注意：接受通过Limoli视网膜修复技术（LRRT）进行脉络膜上自体移植的干性年龄相关性黄斑变性患者的纳入与排除标准详见表1。
1. 干性年龄相关性黄斑变性患者的诊断
<ol>
	<li>使用共焦扫描激光检眼镜、SD-OCT 和 MY 确定诊断。</li>
	<li>评估每组远距离和近距离的矫正后最佳视力（BCVA）。使用点数（Pts）测量近距离视力（近视力）。在0天（T0）、90天（T90）和180天（T180）时，采用4米处的早期治疗糖尿病视网膜病变研究（EDTRS）视力表，以logMAR单位测量BCVA。</li>
	<li>根据国际临床视觉电生理学会（ISCEV）2009年制定的标准，记录暗视、中视和明视条件下的细胞电活动或闪光视网膜电图（flash ERG）11.</li>
</ol>
2. 麻醉
注意：LRRT 期间麻醉的金标准是局部麻醉，辅以筋膜下麻醉浸润和镇静。在特定情况下，首选全身麻醉。
<ol>
	<li>手术前15&#160;–20分钟，通过滴眼方式使用4%利多卡因和1%罗哌卡因进行角膜和结膜表面麻醉。</li>
	<li>通过直接浸润注射将麻醉剂注入结膜下和Tenon囊下间隙。</li>
	<li>在抽取脂肪组织前，对腹部区域以及距角膜缘12 mm处的结膜下和Tenon囊下间隙进行局部浸润麻醉。采用含1,200 IU肾上腺素的卡波卡因或布比卡因局部麻醉剂。</li>
	<li>术中可通过麻醉实现镇静，适当使用芬太尼作为麻醉性镇痛药，以重复小剂量推注方式给药。每次推注剂量通常为芬太尼0.025 mg联合咪达唑仑1 mg。</li>
</ol>
3. 利莫利视网膜修复技术制备
注意：该技术是 Pelaez 干预方法的一种变体，即将眼眶自体脂肪移植至巩膜下腔1,6,7,12。手术移植的细胞可在周围组织、脉络膜和视网膜中产生多种具有神经营养和血管营养特性的生长因子（GFs）18,19,20,21,22,23,24,25。在 LRRT 中，通过深部巩膜切除术缩短移植的自体细胞与脉络膜之间的距离，并扩大蒂部与脉络膜之间的接触面积，以促进自体细胞的旁分泌作用进入脉络膜血流9,10,14。
<ol>
	<li>在进行脉络膜与巩膜之间细胞移植手术前，对每只眼睛进行适当的消毒，该手术称为Limoli视网膜修复技术（Limoli Retinal Restoration Technique, LRRT）15,16,17。</li>
	<li>将通过Coleman et al. 和Lawrence技术（图1）从腹部脂肪获取的脂肪来源基质血管组分（SVF）中的ADSCs移植至脉络膜上腔15,16,17。</li>
	<li>使用通过以下步骤获得的富血小板血浆（PRP）凝胶中提取的血小板，浸润脂肪蒂组织。</li>
	<li>离心血液6,12，收集富血小板血浆（PRP）。血小板脱颗粒的刺激可导致生长因子（GF）在脂肪蒂组织中释放6,12。</li>
</ol>
4. 技术规格与策略
注意：根据 Lawrence 和 Coleman 技术，从患者的腹部皮下层收集并纯化脂肪组织（材料表）17。
<ol>
	<li>根据 Lawrence 和 Coleman 技术，使用连接锁定注射器的 3 mm 钝头套管，手动采集每位患者腹部皮下层 10 mL 脂肪组织17 (图2A/2B).</li>
	<li>通过在20 °C下以1,500 × g离心5分钟，将脂肪组织的纯基质血管组分（SVF）与血液、脂肪、油和液体分离。图2C）。SVF 含有丰富的 ADSCs17.</li>
	<li>使用22 G针头采集8 mL人外周血，另置于一支试管中用于PRP制备。</li>
	<li>将采集的血液在 20 °C 条件下以 1,500 x g 离心 5 分钟（图2D）。在LRRT中，随之发生的变化可改善自体脂肪移植物的存活率，促进ADSC增殖，有利于脉络膜灌注增加，并更全面地调控仅由脂肪分泌的多种因子的作用7,11,17.</li>
	<li>构建脉络膜上腔（详见步骤4，特别是4.4和4.5），以容纳从眼眶脂肪获取的移植物，并使用根据Lawrence和Coleman技术获得的SVF来源ADSCs与PRP混合物填充该腔隙的残余容积17.</li>
</ol>
5. 通过LRRT（Limoli视网膜修复技术）进行脉络膜上腔自体移植：手术步骤与技术细节
<ol>
	<li>在下颞侧角膜缘附近，用6-0丝线固定巩膜。</li>
	<li>使用5.5&#34; Westcott Tenetomy弯剪，在距下颞侧角膜缘11 mm处切开结膜下和Tenon囊下间隙。</li>
	<li>将Limoli-Basile结膜拉钩插入该间隙，以建立巩膜手术野。</li>
	<li>使用5 mm弯月形刀（刀刃朝上倾斜），在距角膜缘8 mm处的巩膜侧方预先切制一个瓣膜。瓣膜的铰链始终为放射状，位于术者左侧。</li>
	<li>在下颞象限、距角膜缘8 mm处，使用弯月形刀（刀刃朝上倾斜）沿放射状铰链侧方切开一个约5 mm深的巩膜门。巩膜切除需达到适当深度，以观察到脉络膜的 slate 色（灰蓝色）。</li>
	<li>在瓣膜远端部分去除少量瓣盖，制造一个间隙，以便后续脉络膜上自体移植物的血液循环。</li>
	<li>使用眼科镊从下斜肌上方的间隙中取出眶脂肪。确保所取脂肪具有充分血供，以保证植入后存活。</li>
	<li>轻柔地将自体脂肪瓣置于脉络膜床之上，并使用6/0聚乳酸羟基乙酸纤维（choroidal polyglactin）在门的近端边缘缝合固定。</li>
	<li>缝合巩膜瓣，避免对脂肪蒂或其营养血管造成压迫。</li>
	<li>使用30 G带角度（30°）的套管针，向脂肪蒂的间质内浸润1 mL PRP凝胶（通过血液样本离心、组分分离及血小板脱颗粒制备26）。</li>
	<li>准备结膜边缘以便缝合，随后移除结膜拉钩。</li>
	<li>使用6/0聚乳酸羟基乙酸纤维缝合结膜。</li>
	<li>在关闭前，预留空间以便将一根带有自体脂肪移植物的小型柔性塑料管插入巩膜下间隙，位于瓣膜、脉络膜与脉络膜自体移植物之间。</li>
	<li>通过插入巩膜袋内的小型柔性塑料管，将步骤3.2中预先制备的0.5 cc SVF（富含ADSCs）注入并充分填充自体脂肪移植物、脉络膜与巩膜瓣之间的残余间隙。</li>
	<li>填充残余间隙后，关闭缝合口。</li>
	<li>术后给予三天抗生素治疗，每日口服500 mg阿奇霉素。同时给予抗生素与类固醇联合滴眼液治疗（如氯霉素与倍他米松），持续约15–20天。 
	注意：现已获得由脂肪细胞、SVF来源的ADSCs及PRP组成的自体移植物26。通过深层巩膜切除减少移植的自体细胞与脉络膜之间的距离，以促进自体细胞向脉络膜血流中分泌旁分泌因子。出于相同目的，扩大蒂部与脉络膜之间的接触面积。</li>
</ol>

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</ol>

在2015年5月3日至7日于美国科罗拉多州丹佛市举行的ARVO年会上展示。

本研究的主要目的是评估脉络膜上腔移植脂肪细胞、基质血管组分中的脂肪源性干细胞（ADSCs）以及富血小板血浆（PRP）是否能够随时间改善干性年龄相关性黄斑变性（dry AMD）患者眼的视力（VA）和视网膜敏感性。另一个主要目标是基于近期文献，论证这些细胞可能具有的治疗作用，因为已有若干项临床前研究提示，基于生长因子（GF）的治疗在多种疾病的患者管理中可能具有应用价值。
事实上，一些研究表明，自体人诱导多能干细胞（iPSC）可作为移植物的细胞来源，用于年龄相关性黄斑变性（AMD）组织替代疗法中的视网膜色素上皮（RPE）再生18,19。这些细胞片以单层形式生成，能够表达典型的RPE标志物，表现出极性生长因子（GF）分泌能力，具有吞噬功能，并且基因表达模式与天然RPE相似18,19。在移植后，自体非人灵长类动物iPSC-RPE细胞片未出现免疫排斥或肿瘤形成<...

细胞治疗，即通过在损伤区域进行干细胞/祖细胞的全身性或局部注射以治疗多种慢性疾病，在过去十年中受到了广泛关注1自20世纪90年代以来，生长因子（GFs）因其在视网膜萎缩中潜在的治疗作用而受到研究2事实上，许多人类细胞能够产生生长因子（GFs），这是一类能够抑制或减缓细胞凋亡的特定蛋白质。 即细胞的程序性死亡3.
已知干性年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种萎缩性视网膜疾病，其特征是细胞逐渐发生不可逆的死亡，累及光感受器层，进而导致中心视觉功能丧失4。AMD 是发达国家 55 岁以上人群失明的首要原因，占所有黄斑变性的 80%，目前尚无有效治疗方法。
多项研究表明，自体生长因子（GFs）可来源于多种细胞类型，包括来源于眼眶脂肪的脂肪源性基质细胞、来源于富血小板血浆（PRP）的血小板，以及存在于脂肪组织基质血管组分（SVF）中的脂肪源性干细胞（ADSCs）5,6,7。现有的生长因子组合可实现视网膜神经增强，Filatov、Meduri、Pelaez 和 Limoli 的研究已证实自体脂肪移植（AFT）具有疗效8,9,10。
此外，先前的一项研究显示，在干性年龄相关性黄斑变性（AMD）患眼中，脉络膜上腔自体移植术后记录的视网膜电图（ERG）数据有显著改善11。手术移植至脉络膜上腔的组织可调节视网膜细胞的旁分泌功能，延缓其凋亡过程6,7,12。根据外核层厚度的组织学检查结果，在豚鼠视网膜研究中发现，生长因子（GFs）可能对视网膜具有营养支持作用。因此，直接或间接使用生长因子（GFs）可能通过分子诱导因子与抑制因子之间的平衡关系，带来潜在的治疗益处6,7,12。
本方法旨在评估脂肪细胞、基质血管组分（SVF）中的脂肪源性干细胞（ADSCs）及富血小板血浆（PRP）的脉络膜上腔移植是否能够改善干性年龄相关性黄斑变性（dry AMD）患眼的最佳矫正视力（BCVA）和微视野（MY）检测结果。根据已引用的文献6,7,12,13，本研究旨在基于自体移植组织的生长因子（GF）分泌能力，验证其治疗效果。

<table><tbody><tr><td>钝头套管，3 mm。&amp;nbsp;</td><td>Mentor, Santa Barbara, CA.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鲁尔锁式注射器。&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Regen-BCT 采血管。&amp;nbsp;</td><td>RegenKit；RegenLab, Le Mont-sur-Lausanne, CH.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>&amp;nbsp;RegenPRP Centri. RegenLab, Le Mont-sur-Lausanne, CH.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Venflon Pro 安全型留置针 22G x 1.00 英寸（0.9 mm x 25 mm）。&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPSS Statistics 版本 19.0</td><td>IBM Corp., Armonk, NY, USA.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦扫描激光检眼镜&amp;nbsp;</td><td>Nidek Inc, Fremont, CA</td><td>Nidek F10&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cirrus 5000 光谱域光学相干断层扫描仪</td><td>Carl Zeiss Meditec AG, Jena, Germany</td><td>&amp;nbsp;SD-OCT&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Maia 100809 微视野计&amp;nbsp;</td><td>CenterVue S.p.A., Padua, Italy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>眼电生理检测系统</td><td>C.S.O., S.r.l., Scandicci, Italy</td><td></td><td>&amp;nbsp;Retimax 用于视网膜电图（ERG）&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

通过脉络膜上腔自体细胞移植治疗干性年龄相关性黄斑变性：初步研究 体内 报告

Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report

本研究旨在探讨脉络膜上腔自体细胞移植是否能够通过在周围组织中产生和分泌生长因子（GFs），随时间推移改善干性年龄相关性黄斑变性（AMD）眼的最佳矫正视力（BCVA）及微视野检查（MY）的反应。患者被随机分配至各研究组。所有患者均被诊断为干性AMD，且BCVA等于或优于最小分辨角对数（logMAR）1。A组包含11例患者的11只眼，接受Limoli视网膜修复技术（LRRT）进行脉络膜上腔自体移植。该技术通过将脂肪细胞、从基质血管组分中获得的脂肪源性干细胞以及富血小板血浆中的血小板植入脉络膜上腔来实施。相反，B组包含14例患者的14只眼，作为对照组。每位患者的诊断均通过共焦扫描激光检眼镜和谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）确认。在A组中，BCVA在术后90天由0.581改善至0.504，在180天时进一步改善至0.376 logMAR（提高32.20%）。此外，微视野检查（MY）结果在180天时由11.44 dB提高至12.59 dB。移植至脉络膜后方的不同细胞类型能够在脉络膜血流中持续分泌生长因子（GFs）。因此，结果表明，在术后六个月，移植组的视力（VA）改善程度优于对照组。

根据本研究所采用的方法，共纳入两组干性年龄相关性黄斑变性（AMD）患者，其最佳矫正视力（BCVA）均大于或等于1个最小分辨角对数（logMAR）。A组包括11例患者的11只眼，接受经睫状体上自体移植的利莫利视网膜修复技术（LRRT）治疗；B组包括14例患者的14只眼，作为对照组。
采用学生t检验和卡方检验分别比较两组研究对象的平均年龄和性别分布（表2）。统计分析和数据可视化均在LRRT手术前后进行。
采用Wilcoxon-Mann-Whitney符号秩检验分析治疗前后差异是否具有显著性。该非参数统计假设检验方法适用于总体分布无法假定为正态分布时，对两个相关样本进行比较，本研究即为此情况。在分析的每一步均测量了视力（VA）值。统计学显著性水平设定为 p 值 &lt;...

本研究的目的是评估通过Limoli视网膜修复技术将富含血小板血浆来源的血小板以及包含在基质血管组分中的脂肪来源干细胞进行脉络膜上腔移植，是否能够改善干性年龄相关性黄斑变性患者眼的视力和视网膜敏感性反应。

本研究旨在探讨自体细胞的脉络膜上腔移植是否能够改善最佳矫正视力（BCVA）以及对……的反应

该手术干预的总体目标是引入一种视网膜神经增强技术，以减缓视网膜细胞的凋亡，从而改善低视力患者的视觉功能和康复效果。该方法有助于解答由视网膜萎缩性退变（如干性年龄相关性黄斑变性或神经性视神经萎缩）引起的低视力领域中的关键科学问题。该技术可同时提升患者在自然状态下的视力以及使用助视放大设备时的视觉能力。这些视网膜修复方法可促进血管蒂脂肪在下层胶样物质基础上的增加，从而增强血管蒂的血管化，改善血管蒂的健康状况和存活率。该疗法还通过生长因子的参与，启动视网膜各组分的再生过程，因而具有治疗作用。尽管该技术最初是为减缓视网膜变性而开发的，但也可应用于需要治疗的成体组织或器官系统。首先，使用22号针头采集8 mL外周血，以获取富含血小板的血浆。应采用含分离胶的枸橼酸钠真空采血管，该管可促进细胞成分与血浆之间的分离。将血液样本在20摄氏度下以1500g离心5分钟。血液将分为三层。吸除并弃去顶层的乏血小板血浆。然后，收集并保存中间层，即富含血小板的血浆。对黄斑变性患者进行麻醉，以实施Limoli视网膜修复术并获取脂肪组织。从腹部皮下层采集脂肪组织。使用连接锁紧注射器的三毫米钝头套管收集约10毫升组织。采用Lawrence和Coleman技术。然后，在1500 ×g、20 °C条件下离心样品5分钟，分离脂肪组织的基质血管组分。位于血层上方的基质血管组分富含脂肪来源的干细胞。自体移植所需量不超过一毫升。最后，配制自体移植物：将0.5至0.6毫升基质血管组分、0.2至0.3毫升富血小板血浆以及0.1毫升透明质酸加入递送管中。使用两个注射器和一个三通旋塞将其混合。将套管针的管口向上倾斜五毫米，以方便将自体移植物注入巩膜下腔。手术开始前，当患者处于坐位时，标记接受治疗的眼睛，以界定手术区域，避免眼球的生理性周期性扭转效应。开始修复手术时，首先在下颞侧角膜缘附近用6-0丝线缝合固定巩膜。巩膜固定是关键步骤。进针时深度应适中，不可过深或过浅。如果刺穿了眼睛，眼球就会塌陷。如果缝线是oketa，眼睛就无法固定。多么令人焦虑！接下来，使用5.5英寸Westcott肌腱剪，在距离下颞侧角膜缘11毫米处切开结膜下和Tenon囊下间隙。然后，插入Limoli基底结膜拉钩，以暴露巩膜手术区域。现在，使用5毫米月形刀，刀刃斜面向上，于距离角膜缘8毫米的下颞侧巩膜象限处预切一瓣膜。将瓣膜的铰链置于放射状，并位于术者左侧。接下来，使用弯月形刀，刀刃斜面向上，从角膜缘起始约8毫米处，在下方颞象限做一个宽约5毫米、带放射状铰链的深巩膜瓣，切口呈门形。切割时需极其缓慢，沿眼球表面做切线方向进行。切勿穿透脉络膜间隙。当看到下方脉络膜呈现蓝青色，且灰白色巩膜痕迹变得不太明显时，即达到理想深度。此时，脉络膜如同一片薄冰。 如果巩膜切除不够深，植入细胞产生的生长因子将无法按预期穿透。如果巩膜切开过深，则有脉络膜穿孔的风险，导致出血，或发生大块穿孔，继而造成视网膜损伤。现在收集一些眶内脂肪。在瓣膜远端部分去除少量眼睑片，形成一个间隙，以促进后续脉络膜上自体移植中的血液循环。然后，使用眼科镊子从下斜肌上方的间隙中取出眶内脂肪。注意观察蒂部是否有少量出血。这些表现表明具有良好的血管化，对于自体移植的存活至关重要。眼眶脂肪手术是另一个关键步骤。我们不使用剪刀打开眼眶空间，以避免出血或肌肉损伤。然后，在将脂肪瓣固定于巩膜之前，先将其游离出来。接着，将自体脂肪瓣轻柔地放置在脉络膜床之上，并使用6-0可吸收聚乳酸羟基乙酸纤维缝线沿“门”近端边缘连续缝合关闭。随后，缝合巩膜瓣，以避免对脂肪瓣或其营养血管造成压迫。现在，使用30号弯头套管针，将1毫升富血小板血浆凝胶注入脂肪瓣的基质中。接下来，移除牵开器，为结膜缝合做准备。然后使用7-0聚乳酸羟基乙酸纤维进行结膜缝合，但不要完全闭合。预留足够的空间，以便将一根细小的软管插入巩膜层间口袋。现在，将软管插入巩膜层间口袋，并将自体移植物注入巩膜下间隙。最后，注射由富血小板血浆、抗生素和类固醇组成的结膜下混合物。接下来三天给予全身性抗生素治疗，随后15至20天给予含有抗生素和类固醇的眼药水。将患有干性年龄相关性黄斑变性的患者分为两组，每组的最佳矫正视力在BAM对数评分中至少为1分。对照组患者接受基于抗氧化剂补充剂和必要时进行视觉康复的治疗，而实验组患者接受LRRT治疗。结果的诊断采用共焦扫描激光检眼镜和谱域光学相干断层扫描技术进行。治疗组在90天后BAM对数评分得到改善，180天后进一步改善。此外，接受LRRT治疗的患者的微视野检查得分从平均11.44分贝提高到平均12.59分贝。总体而言，这些结果表明，移植到脉络膜后方的不同细胞类型能够持续向脉络膜血流中分泌生长因子，从而导致移植组的视力提高程度大于对照组。观看本视频后，您应能充分理解一种通过手术促进生长因子与残留视网膜细胞相互作用来治疗细胞凋亡的潜在疗法。一旦掌握该技术，若操作得当，每只眼睛的手术可在13分钟内完成。在实施该手术过程中，须谨慎进行巩膜固定及深部巩膜切开步骤。否则，该技术相对简单且安全。该技术问世后，为视网膜修复领域的研究人员开辟了道路，使其能够探索阻止或延缓神经视网膜萎缩性退变并改善视觉功能的可能性。

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