细胞表面生物素标记实验

使用生物素标记细胞表面蛋白是研究参与调控膜蛋白的细胞运输途径的一种强大工具。细胞在表面维持一组严格调控的蛋白质，以便通过多种信号通路接收并响应胞外信息。内吞作用是一种包裹过程，被认为通过促使这些细胞表面蛋白内化而参与其调控。因此，在这些蛋白被内吞之前用生物素等试剂进行标记，有助于科学家量化其内化程度，并研究其在细胞通路中的作用。

在本视频中，我们将讨论细胞表面生物素化检测的原理和方法，并探讨当前科学家对该方法的一些改进与应用。

首先让我们回顾一下细胞表面生物素化实验的原理。

如前所述，细胞利用内吞途径来调控表面蛋白在时空上的密度与分布。被内吞的蛋白质会经过特定的细胞内运输通路，随后可能被转运至溶酶体进行降解，或被循环回收至细胞膜表面以维持其功能活性。细胞表面生物素化实验正是为了检测这些过程而设计的。

本实验中所使用的标记物生物素（biotin），也称为维生素H，是一种小分子、水溶性化合物。在细胞表面标记实验中常用的一种生物素衍生物是磺基-NHS-SS-生物素（sulfo-NHS-SS-biotin），其结构包含磺酸基团（sulfo group）、N-羟基琥珀酰亚胺酯基团（N-hydroxy succinimide ester group）、二硫键（disulfide bond）以及生物素（biotin）。为了简化这一复杂结构，我们可以将生物素部分用字母“B”来表示。

该结构中的磺酸基团带有强电荷，使这种生物素无法穿透细胞膜。对细胞表面蛋白的标记是在抑制内吞作用的低温条件下，将sulfo-NHS-SS-biotin加入细胞中完成的。其中NHS基团可与细胞表面蛋白上的伯胺基团发生反应，形成共价键。

随后，将标记后的细胞转移至允许内吞发生的温度条件下，部分已被标记的蛋白将被内化进入细胞。最后，再将细胞移回抑制内吞的低温环境，以终止内吞过程。为了特异性地定量内化蛋白，需加入一种亲水性且不能穿透膜的还原剂——如L-谷胱甘肽（L-glutathione）。该还原剂会与未被内吞的sulfo-NHS-SS-生物素上的二硫键发生反应，从而切断并去除生物素标记。此时，仍保留生物素标记的蛋白即为此前已被内吞、因而其标记受到保护而未被还原剂清除的蛋白。

接着裂解细胞，并分离出已被内吞的生物素化蛋白用于定量分析。通常通过将细胞裂解液加入包被有链霉亲和素（streptavidin）的合成微珠中来实现分离。由于链霉亲和素对生物素具有极高的亲和力，生物素化的蛋白会结合到这些包被微珠上。经过一系列洗涤步骤以去除杂质蛋白，最后通过洗脱步骤释放结合的蛋白。目标蛋白随后可通过如蛋白质印迹（Western blotting）等技术进行分析。

现在您已经了解了生物素化检测背后的原理，接下来我们来看一个通用的实验方案，展示如何通过该方法检测细胞表面蛋白的内吞作用。

首先准备冷却至4°C的培养细胞，将其置于冰上以维持抑制内吞作用的低温环境。接着加入膜不通透性的磺基-NHS-SS-生物素试剂，在避光条件下孵育约30分钟，使生物素标签有足够时间共价结合到细胞表面蛋白上。随后将细胞从冰上取出，在37°C孵育约30分钟，使已标记的表面蛋白发生内吞。孵育结束后，再次将细胞冷却至4°C，并加入亲水性还原剂（如L-谷胱甘肽）。该还原剂可与二硫键反应，从而将未被内吞的标记蛋白上的生物素基团释放掉。

接下来通过离心裂解细胞，破坏细胞膜并释放出生物素标记的蛋白。然后将裂解液加入链霉亲和素包被的磁珠中，使生物素化蛋白与磁珠结合。用预冷的磷酸盐缓冲盐水洗涤磁珠，并用含有去垢剂和还原剂的缓冲液洗脱。这些试剂可使结合在磁珠上的蛋白变性并释放到洗脱液中。洗脱液中的蛋白随后通过凝胶电泳按分子量大小进行分离。最后，通过蛋白质印迹（Western blotting）并使用特异性抗体探针检测目标蛋白，实现其可视化。根据所得条带的密度可定量计算出内吞蛋白的百分比。

现在您已经了解了细胞生物素标记的方法学，接下来我们来看看它在具体实验中的应用。

该生物素标记方案最常见的应用是测量特定细胞表面蛋白的内吞速率。在此研究中，科学家希望评估多巴胺转运体（DAT）的内化情况。通过遵循标准操作流程，研究人员能够测定发生内吞的DAT所占的百分比。这是一张代表性免疫印迹图，其中T泳道代表内吞前的“总”蛋白量，S泳道为“去除非内吞蛋白”的样本，即细胞未进行内吞过程但经过还原剂处理，I泳道则代表“内化”蛋白的结果。

除了测量表面蛋白的内吞外，科学家还研究药物对此过程的影响。在本研究中，研究人员检测了蛋白激酶C（PKC）激活剂处理后DAT表面密度的变化，已有研究表明PKC的激活可能诱导DAT的内吞。研究人员通过将体外（in vitro）生物素标记方案改进并应用于小鼠脑组织的离体（ex vivo）检测，验证了这一结论。实验数据显示，在PKC激活后，细胞膜上的DAT减少了约30%。

最后，通过调整生物素标记实验方案，科学家还可以测量膜蛋白的再循环过程。在此研究中，研究人员关注的是负责氯离子传导的细胞表面通道蛋白CFTR。为了评估其再循环能力，研究人员对一组细胞执行标准的生物素标记流程，而对另一组细胞则在去除未内吞表面蛋白上的生物素后，增加了额外步骤：将温度恢复至37°C，以允许部分已被内吞且带有生物素标记的受体蛋白重新循环回膜上。通过计算再循环前后内化蛋白量的差异，这些研究人员得以定量分析重新回到膜上的CFTR蛋白所占的百分比。

您刚刚观看了 JoVE 关于细胞表面生物素化检测的介绍。该视频介绍了该检测方法的操作步骤，并解释了每一步骤中发生的反应。最后，我们探讨了一些示例实验，展示了该方法的应用性。一如既往，感谢您的观看！