Name: 高速超分辨速度显微镜在活原纤毛中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 了解高速超分辨速度显微镜技术，用于在活细胞中追踪原纤毛内的蛋白质运输路径。该方法以NIH-3T3细胞为模型，可揭示正常与功能障碍纤毛的差异，为细胞生物学研究提供高分辨率成像手段。

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我们感谢密歇根大学安娜堡分校的 Kristen Verhey 博士和马萨诸塞大学医学院的 Gregory Pazour 博士提供部分质粒。本项目获得了美国国立卫生研究院（NIH GM097037、GM116204 和 GM122552 至 W.Y.）的资助。

1. 从细胞库制备用于SPEED显微镜的NIH-3T3细胞
<ol>
	<li>实验前约1.5周，从冻存株中复苏新鲜的NIH-3T3细胞：在37 °C下解冻，并将细胞转移至含3 mL添加了110 mg/mL丙酮酸钠、2 mM谷氨酰胺、10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）的25 cm2细胞培养瓶中。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育。</li>
	<li>当细胞融合度达到80%时（大约每两天一次），在实验前至少传代三次，以确保细胞周期的均一性。用0.25%胰蛋白酶在37 °C处理2分钟进行消化，吸除胰蛋白酶后加入2 mL培养基。反复吹打以分散细胞团块，取出所需数量的细胞，并将培养基总体积补至3 mL。 
	注：NIH-3T3细胞此前经基因工程改造，可表达定位于过渡区（TZ）26的NPHP-4蛋白，该蛋白在其C末端融合了mCherry。mCherry是一种荧光团，可通过561 nm激发光进行激发，用于定量定位TZ选择性屏障并确定初级纤毛的方向。</li>
	<li>实验前两天，将细胞以60–70%融合度接种于35 mm玻璃底培养皿中，加入1.5 mL与步骤1.1相同的培养基，并将细胞放回培养箱中继续培养。</li>
	<li>实验前一天，使用目标质粒对细胞进行化学转染。将500–1000 ng的目标质粒（见下文注）与转染试剂按1:2.5的比例混合于0.25 mL无抗生素的低血清培养基中，室温孵育30分钟。吸除35 mm玻璃底培养皿中的培养基，替换为0.25 mL质粒/转染试剂混合物及额外添加的1.25 mL无抗生素低血清培养基。低血清培养基有助于实现高效转染、诱导初级纤毛生长，并维持细胞存活足够长时间以完成后续实验。将细胞放回培养箱，次日进行实验。 
	注：在对IFT20进行单分子示踪时，使用一种在其C末端融合了GFP的基因改造IFT20质粒25；在对SSTR3进行单分子示踪时，使用一种在其N末端融合了受体肽（AP）结构域、C末端融合了GFP的基因改造SSTR3质粒22。除SSTR3构建体外，还需共表达含有生物素连接酶BirA的质粒，并在转染培养基中补充10 µM生物素。BirA随后会在内质网水平将生物素连接至新合成的AP-SSTR3-GFP分子的AP结构域上。成像前可在培养基中加入平均结合了三个（共四个）链霉亲和素生物素结合位点的Alexa647，从而对细胞外表面的AP-SSTR3-GFP分子进行荧光标记22,27。本方法中使用GFP和AlexaFluor647；然而，其他具有类似高光稳定性和量子产率的荧光探针也可替代使用。</li>
	<li>若使用外部标记的SSTR3构建体，则在实验前1小时移除玻璃底培养皿中的培养基，用1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞5次，然后加入1 mL补充了1 µM Alexa647标记链霉亲和素的低血清培养基。</li>
	<li>实验开始前不超过15分钟，移除玻璃底培养皿中的培养基，并用1 mL PBS对转染并标记的细胞洗涤5次。</li>
	<li>向玻璃底培养皿中加入1 mL成像缓冲液（20 mM HEPES、110 mM KOAc、5 mM NaOAc、2 mM MgOAc、1 mM EGTA，pH 7.3）。 
	注：在成像缓冲液中，细胞活性维持时间不超过3小时，因此每个培养皿仅进行最多2小时的实验。</li>
</ol>
2. SPEED 显微镜技术
注意：SPEED 显微镜系统包括一台倒置荧光显微镜，配备数值孔径为 1.4 的 100× 油浸复消色差物镜、35 mW 的 633 nm 氦-氖激光器、50 mW 固体 488 nm 和 561 nm 激光器、片上乘法增益电荷耦合器件（CCD）相机，以及用于数据采集和处理的显微镜软件包（图 1）。在单通道成像中，GFP、mCherry 和 Alexa647 分别由 488 nm、561 nm 和 633 nm 激光器激发。在单分子追踪实验中，采用单点照明以追踪单个荧光标记分子。在落射荧光成像中，激光照明光路中放置一个凹透镜，以将光束扩展为均匀的照明场。荧光发射光由同一物镜收集，经二向色镜（405/488/561/635）和发射滤光片（405/488/561/635）过滤后，由上述 CCD 相机成像；在单分子追踪时相机工作频率为 500 Hz，落射荧光成像时为 2 Hz。
<ol>
	<li>将玻璃底板固定在显微镜载物台上，找到一个正确表达目标构建体的细胞。找到合适的细胞后，将初级纤毛基部的NPHP4-mCherry荧光点与成像平面上对应激光单点照射的位置对齐。</li>
	<li>使用落射荧光显微镜拍摄NPHP4-mCherry与IFT20-GFP或AP-SSTR3-GFP的荧光图像 &#34;快照&#34; 功能在 &#34;相机&#34; 的标签 &#34;焦点调节控制&#34; 如果使用数字显微软件包（参见 材料表). 
	注意：这些图像将作为后续单分子定位的参考。</li>
	<li>获得参考图像后，局部降低标记单分子的浓度。用1 mW激光照射TZ区域20秒，或直至荧光强度接近背景荧光水平，以进行光漂白。 
	注意：当可精确控制浓度时，使用 0.1–1 nM 的标记单分子。</li>
	<li>为进行单分子示踪实验，将激光照射功率降低至约 0.15 mW（用于标记 GFP 的单分子）或约 0.5 mW（用于标记 Alexa647 的分子）。</li>
	<li>一旦设定好激光功率和成像参数（最大增益、最大放大倍数和 2 ms 帧率）用于单分子成像，开启相应的激发激光，通过点击开始记录非光漂白的、标记的单分子，这些分子在通过中心粒远端区（TZ）的光漂白区域时被运输。 &#34;流&#34; 按钮在 &#34;相机&#34; 标签的 &#34;聚焦控制&#34; 窗口。 
	注意：为将纤毛漂移的影响降至可忽略水平，视频采集时间不应超过2分钟。</li>
	<li>单分子视频采集完成后，使用二维高斯拟合算法（如Gelles实验室开发的Glimpse软件）对视频进行处理，精确确定每个单分子激发点扩散函数（PSF）在感兴趣区域（AOI）内的质心位置。</li>
	<li>以高精度选择所有单分子位置 &#60;10 nm，并根据用二维高斯函数拟合的单分子定位分布来校正纤毛的中心。 
	注意：通过使用二维到三维转换算法，IFT20-GFP 和 AP-SSTR3 的三维运输路径分别在纤毛轴丝或纤毛膜上清晰显示。</li>
</ol>
3. 从二维到三维的转化
<ol>
	<li>当收集到纤毛中穿行分子（信噪比 &#62; 11）的数千个定位信号后，选择纤毛的长轴作为 X 维度。对位置数据在 Y 维度上生成直方图，并以 10 nm 为增量获取各区间的位置总和。 
	注意：二维到三维的转换可通过手工或任意软件或编程语言实现。作者已成功在 Matlab 和 Python 2.7 中实现了该转换。</li>
</ol>

<ol><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li>
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<li>Howarth, M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+proteins+in+live+mammalian+cells+with+biotin+ligase+and+monovalent+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin.</a> Nat Protoc. 3, 534-545 (2008).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案描述了SPEED显微镜技术在初级纤毛中的应用，初级纤毛是一种高度依赖高效蛋白质运输的细胞信号传导细胞器。SPEED显微镜可在中心定位于过渡区（TZ）的单点照明条件下，提供荧光标记分子在通过时的高分辨率（< 10 nm）定位信息。此前，该技术已被用于研究核孔复合体（NPC）中的蛋白质运输6,7,8。然而，该方法也可拓展应用于研究任何亚衍射极限细胞腔隙中的物质运输过程。与其他高分辨率成像技术相比，该技术的优势在于能够在活细胞系统中以空间分辨率<10 nm和时间分辨率<2 ms的精度捕捉单个蛋白质运输的动力学过程。另一优势在于，只需对目标蛋白进行荧光标记，并通过转染（一种研究蛋白质定位的常用分子生物学方法）表达该构建体，即可开始进行SPEED显微镜观察。需要注意的是，高功率激光的单点照明是实现分子位置清晰分离和高分辨率定位的关键特征，但这也限制了照明区域，使该技术不适用于宽场定位成像。幸运的是，若需要宽场成像，研究者可从多种现有的宽场超分辨率技术中进行...

自1873年Ernst Abbe提出以来，传统光学显微镜的分辨率一直被认为受限于光在物镜处的衍射，极限约为200 nm1,2。目前，超分辨率光学显微技术突破了这一限制，能够以亚衍射（&#60; 200 nm）分辨率捕捉动态图像。这些技术通常分为两大类：一类是基于受激发射损耗（STED）显微镜的方法，其通过样品中荧光分子的非线性光学响应产生亚衍射的照明体积3；另一类是基于光激活定位显微镜（PALM）和随机光学重建显微镜（STORM）的超分辨率技术，其利用数学函数定位荧光分子的中心位置（即质心），再将这些质心重构为超分辨率图像4,5。目前，由于光学装置相对简单，PALM和STORM技术被广泛采用，其原理是在长时间记录生物样本视频的每一帧中仅激活一小部分荧光分子。这使得可通过二维高斯拟合更精确地定位每帧图像中荧光标记蛋白的荧光斑点，即点扩散函数（PSF）。随后，可将每个荧光标记分子的二维位置叠加至单一成像平面，从而生成生物样本的超分辨率图像1,2。尽管这类单分子定位超分辨率显微技术确实革新了生物样本的成像方式，但仍存在一些亟待解决的挑战。例如，STORM和PALM在生物样本固定后才能达到最佳空间分辨率，因此仅能提供荧光标记蛋白的静态图像，这与电子显微镜存在类似的局限性。此外，为了在活细胞中实现每个荧光标记蛋白的高空间分辨率，样本必须以极长的帧率进行成像，从而无法捕捉蛋白的动态行为。因此，有必要克服这些主要的技术障碍。
为了获得适用于在活细胞中检测快速移动的蛋白质或RNA的高时空分辨率，我们在实验室开发了超分辨率SPEED显微镜技术（图1）6,7,8。SPEED显微镜的几项关键技术进步使我们能够成功追踪小分子、蛋白质、mRNA和病毒通过天然核孔复合体（NPCs）的核质运输过程6,7,8。简而言之，SPEED显微镜具有以下特征，可用于在活细胞中追踪快速移动的大分子穿过亚微米尺度的旋转对称结构（如NPC和初级纤毛）：（1）倾斜或垂直照明的点扩散函数（PSF）可在焦平面上一个小的衍射极限体积内激发单个分子（图1）；（2）倾斜的PSF可显著避免离焦荧光，从而提高信噪比；（3）照明PSF中的光密度达到100–500 kW/cm2，使得从单个荧光团在快速检测速度（> 500 Hz）下可收集数千个光子；（4）快速检测速度还显著降低了单分子空间定位误差（< 10 nm），从而更准确地确定活细胞中运动荧光分子的空间轨迹，因为分子扩散是导致运动分子单分子定位不精确的主要因素之一；（5）成熟的二维到三维转换算法使我们能够提供分子在NPC或初级纤毛中运输路径的三维空间概率密度图。值得注意的是，我们在笛卡尔坐标系与柱面坐标系之间的转换过程用于生成三维空间概率密度图，而非三维单分子追踪（图2）。此前，电子显微镜数据表明，NPC9,10和初级纤毛11均具有旋转对称结构。理论上，随机扩散穿过NPC或初级纤毛的分子也应呈现旋转对称分布。如图2所示，圆柱体内大量随机扩散的分子在横截面视图中会产生类似于NPC的旋转对称分布，进一步导致相邻两个环之间的每个极小亚区域内的空间分布近似均匀（图2E）。这种均匀分布意味着在柱面坐标系中沿θ方向的空间分布是恒定的。因此，三维坐标（R, X, θ）可简化为二维坐标（R, X, 常数）。实际上，我们从笛卡尔坐标系到柱面坐标系的转换过程是从二维（X, Y）转换为二维（R, X, 常数）。该常数θ对应于图2E中的空间密度p，通过公式A<img alt="公式1" src="/files/ftp_upload/56475/56475eq1.jpg" />计算得出。
最终，单分子示踪技术在生物研究中具有广泛的应用，因此，开发多种技术以满足特定的生物学需求是自然而然的12,13,14。SPEED显微镜技术正是如此。此前，当结合三维变换算法时，该技术被用于解析穿行分子通过核孔复合体（NPCs）的三维运输路径，核孔复合体是一种亚衍射尺度且具有旋转对称性的生物结构6。本文表明，初级纤毛同样是极佳的模型细胞器。初级纤毛是圆柱形、天线状的细胞器（半径约125 nm），从大多数哺乳动物细胞表面突出15,16,17。它们负责接收外部信号，并传递通常与生长和代谢相关的细胞内响应15,16。因此，结构蛋白的流动、跨膜受体的回收以及细胞内信使的传递是初级纤毛的重要功能。在初级纤毛与细胞体的连接处存在一个关键的选择性屏障，称为过渡区（transition zone, TZ），所有蛋白质运输都必须通过该区域11,18,19,20。除了TZ的门控功能外，至少还有两种运输过程——鞭毛内运输（intraflagellar transport）和被动扩散——被认为负责蛋白质在此区域的移动16,21,22。从人类健康的角度来看，初级纤毛的缺失及其下游信号通路的失调是多种癌症的特征。此外，许多遗传性疾病，如Bardet-Biedl综合征和多囊肾病，也与蛋白质运输缺陷相关23。TZ处蛋白质选择性运输的亚衍射极限尺寸及其复杂过程，使初级纤毛成为该技术的理想研究对象。在本方法学论文中，我们将展示对一种纤毛跨膜蛋白——生长抑素受体3（somatostatin receptor 3, SSTR3）24（用Alexa Fluor 647体外标记）以及鞭毛内运输复合物组分IFT2025（用融合GFP分子标记）——的示踪过程。

<table><tbody><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 组织培养皿</td><td>Corning</td><td>VV-01936-00</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ThermoFisher</td><td>10438018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>OPTIMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Transit LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35GCOL-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 标记的链霉亲和素</td><td>ThermoFisher</td><td>S21374</td><td></td></tr><tr><td>生物素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>633 nm 氦-氖激光器</td><td>Melles Griot</td><td>25-LHP-928-249</td><td></td></tr><tr><td>561 nm 固态激光器</td><td>Coherent</td><td>OBIS 561-50 LS</td><td></td></tr><tr><td>488 nm 固态激光器</td><td>Coherent</td><td>1185053</td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>1.4 数值孔径 100&amp;times; 油浸复消色差物镜</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 100&amp;times;</td><td></td></tr><tr><td>片上乘法增益电荷耦合器件相机</td><td>Roper Scientific</td><td>Cascade 128+</td><td></td></tr><tr><td>二向色镜滤光片</td><td>Semrock</td><td>Di01- R405/488/561/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>发射滤光片</td><td>Semrock</td><td>NF01-405/488/561/635-25X5.0</td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 6.0</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td>数字显微成像软件</td></tr></tbody></table>

高速超分辨率speed显微镜在活体初级纤毛中的应用

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

初级纤毛是许多真核细胞表面的一种基于微管的突起结构，含有独特的蛋白质组合，在细胞运动和信号传导中发挥关键作用。由于纤毛自身无法合成蛋白质，因此几乎有200种独特的纤毛蛋白需要在细胞质与初级纤毛之间进行转运。然而，由于现有技术的局限性，目前仍难以在活体初级纤毛中精确绘制这些蛋白质三维（3D）转运路径的空间位置。为克服这一技术难题，我们近期开发并应用了一种高速虚拟三维超分辨率显微技术，称为单点边缘激发亚衍射（SPEED）显微技术，用于确定活细胞初级纤毛中细胞质蛋白和膜蛋白转运路径的三维空间位置。本文将详细介绍SPEED显微技术的系统搭建、表达荧光蛋白标记纤毛蛋白的细胞制备、活纤毛中单个蛋白质的实时单分子追踪，以及纤毛蛋白转运路径三维空间概率密度图的获取方法。

本节展示了利用SPEED显微镜在初级纤毛的过渡区（TZ）获取的数据，用于研究通过约15 nm外部连接子与Alexa647相连的SSTR3的运输路径图3A）。它具有双重作用：验证3D转换算法的准确性。Alexa647应仅标记初级纤毛的外表面，因此3D运输路径应在该位置显示出高密度的信号。必须将稳定表达TZ部位NPHP3-mCherry的NIH-3T3细胞转染AP-SSTR3-GFP，并按照上述方案与链霉亲和素偶联的Alexa647共同孵育。使用mCherry荧光的宽场成像用于定位过渡区（TZ），而GFP信号用于确认细胞已成功表达目标SSTR3构建体。此外，需使用633 nm激发光对Alexa647进行宽场成像，以确认细胞已正确表达BirA质粒并从培养基中吸收了足够的生物素。阳性结果表现为可清晰分辨出与背景荧光分离的纤毛结构。图3B。只有在这些条件下，才能实现链霉亲和素偶联的Alexa647...

近期，我们绘制了活细胞中各种蛋白质在初级纤毛内转运的三维（3D）空间路径。本文详细描述了应用于活体初级纤毛的新型3D超分辨率荧光成像技术的实验装置、生物样本处理过程以及数据分析方法。

高速超分辨率SPEED显微镜在活体初级纤毛中的应用

初级纤毛是一种基于微管的突起，存在于许多真核细胞表面，含有独特的一组发挥特定功能的蛋白质……

本实验的总体目标是确定初级纤毛中的蛋白质运输途径。该方法有助于解答纤毛研究领域的一些关键问题，例如正常纤毛与功能障碍纤毛中蛋白质运输途径的差异。该技术的主要优势在于其分辨率足够高，能够在活细胞中观察到亚衍射极限的蛋白质运输路径。首先，在实验开始前一个半周，将经过特殊基因工程改造的 NIH-3T3 细胞冻存液在 37 摄氏度下解冻。将解冻后的细胞转移至含有 3 毫升预热培养基的 25 平方厘米细胞培养瓶中。将细胞置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中进行培养。将细胞培养至融合度达到80%后进行传代。传代时，用0.25%胰蛋白酶在37摄氏度下消化细胞2分钟。短暂孵育后，吸除胰蛋白酶溶液，并加入2毫升预热的培养基。用移液器吹打培养基以分散细胞团块，然后从培养瓶中移除75%的细胞，并将培养基总体积补至三毫升。实验前至少传代三次，以确保细胞周期的均一性。实验前两天进行细胞传代，将细胞以60–70%的融合度接种于含1.5毫升相同培养基的35毫米玻璃底培养皿中。然后，在实验前一天，使用目标质粒对细胞进行化学转染。将500–1000纳克质粒与转染试剂按1:2.5的比例混合，并加入0.25毫升不含抗生素的低血清培养基，室温孵育30分钟。转染复合物形成后，吸去35毫米玻璃底培养皿中的培养基，替换为0.25毫升转染混合物及额外添加的1.25毫升不含抗生素的低血清培养基，然后将培养皿放回培养箱中继续培养。对于表面标记SSTR3构建体的细胞，在实验前一小时从玻璃底培养皿中移除培养基。用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞五次，并加入一毫升含有一微摩尔Alexa 647标记链霉亲和素的低血清培养基。在实验开始前不超过15分钟，从玻璃底培养皿中移除培养基，并用一毫升PBS洗涤细胞五次。然后向玻璃底培养皿中加入一毫升成像缓冲液。将玻璃底培养皿固定在显微镜载物台上。使用GFP滤光片组找到表达GFP的细胞，并定位一根初级纤毛中正确表达SSTR3-GFP的细胞。找到合适的细胞后，将初级纤毛基部的 NPHP4-mCherry 斑点与成像平面上对应激光单点照射的位置对齐。在聚焦控制窗口的相机选项卡中使用拍摄功能，获取 NPHP4-mCherry 和绿色荧光蛋白标记的 SSTR3 蛋白的落射荧光图像。获得参考图像后，使用1毫瓦的激光照射过渡区20秒，以局部降低标记单分子的浓度。为进行单分子示踪实验，将标记有 Alexa 647 的分子的激光照射功率降低至 0.5 毫瓦。将增益和增益强度设为最大值，帧速率为 2 毫秒。然后点击聚焦控制窗口中相机选项卡的“流”按钮，并启动相应的激发激光。记录非光漂白的标记单分子在通过过渡区光漂白区域时的运动情况。注意录像时间不超过两分钟，以避免纤毛漂移的影响。捕获单分子后，使用二维高斯拟合算法（如Gelles实验室开发的Glimpse）对视频进行处理，精确定位每个单分子激发点的质心、点扩散函数及其周围感兴趣区域。最后，选择所有定位精度优于10纳米的单分子位置，并基于用二维高斯函数拟合的单分子位置分布来校正纤毛的中心。如本视频所述，可利用单点照明追踪被AF647标记的SSTR3分子穿过由NPHP4-mCherry标记的过渡区的过程。在数据分析之前，将单分子视频叠加到宽场照明图像上是一个有用的验证步骤，以确保激光正确对准，并且具有足够的信噪比。图中所示为一个通过染色鉴定出具有初级纤毛的细胞。IFT20 是鞭毛内转运复合体的一个组分，可沿初级纤毛内部的微管运输货物，初级纤毛由 Arl13b-mCherry 标记。鉴定后，采用高速显微镜追踪单个 IFT20-GFP 蛋白的运动。接下来，使用二维到三维转换算法，沿单一维度生成蛋白质在初级纤毛内部的空间概率密度分布。该高密度区域很可能与轴丝微管共定位，这与已知的纤毛内运输路径位置一致。在进行此操作时，重要的是要将样品与激光精确对齐，以尽量减少系统误差。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用高速显微镜进行单分子示踪，并掌握获取初级纤毛中单分子运输路径的方法。

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生物学

高速超分辨速度显微镜在活原纤毛中的应用

本文介绍了一种利用小鼠气管可视化并定量纤毛运动及纤毛驱动流的简便且可靠的技术。该技术可经修改后用于确定多种因素对纤毛运动的影响，包括药理学试剂、遗传因素、环境暴露，以及黏液负荷等机械因素。...

ex vivo 法对啮齿类动物气道上皮纤毛运动进行高分辨率成像

活细胞内动态蛋白质的时空信息对于理解生物学过程至关重要。一种称为快速三维结构光照明显微镜（f3D-SIM）的超分辨率显微技术能够揭示细菌细胞分裂Z环的独特信息：不仅呈现其珠状结构，还能展示FtsZ蛋白在环内的快速动态行为。...

利用快速三维结构光照明显微镜（f3D-SIM）对活体细菌中细胞分裂Z环进行超分辨率成像

本研究优化了一种详细的光学显微技术，用于实时观察和分析脉络丛上皮细胞纤毛的运动 离体...

观察脉络丛上皮细胞的纤毛运动 离体

初级纤毛是与中心粒相关的胞外结构。通过免疫荧光染色检测初级纤毛是一种相对简单的实验方法，可获得极高分辨率的图像。本实验方案中，表达初级纤毛的成纤维细胞经固定、免疫染色后，使用荧光显微镜或共聚焦显微镜进行成像。...

初级纤毛的免疫荧光简易检测方法

本文介绍了一种在完整组织中进行超分辨率活细胞成像的实验方案。我们已标准化了在其原生组织环境中对高度敏感的成体干细胞群体进行成像的条件。该技术通过平衡时间分辨率与空间分辨率，实现在活体组织中直接观察生物学现象。...

超分辨率活细胞成像观察亚细胞结构

我们提供了生成和表征基于人诱导性多能干细胞（hIPSC）的2D和3D新皮质发育模型的详细方案，以及用于定性和定量分析初级纤毛（PC）发生与功能的互补方法。...

基于人诱导性多能干细胞的二维和三维模型解析初级纤毛在新皮质发育中的作用

此处，我们展示一种可重复的 体外...

一种高效且经济的电穿孔方法用于研究颗粒细胞前体中依赖初级纤毛的信号通路

高速视频显微镜分析是一种相对易于操作、快速、经济且在经验丰富的操作者手中具有较高可靠性的工具，可用于原发性纤毛运动障碍的初筛诊断，应成为每个从事重症肺部疾病诊断与治疗的医疗中心的常规配备。...

高速视频显微镜分析用于原发性纤毛运动障碍的初诊

超分辨率显微镜可提供减数分裂中联会复合体内部组分排列的详细信息。在此，我们展示了一种用于解析秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

Caenorhabditis elegans 生殖系中联会复合体的超分辨率显微成像

该方法描述了利用ARL13B-CENTRIN-2转基因小鼠模型中的内源性信号对初级纤毛进行成像的技术 原位，可在大范围矿化组织中从组织采集到纤毛排列的分析，进行三维观察。该方案也可应用于其他类型的组织。...

利用ARL13B-CENTRIN-2小鼠模型对肌肉骨骼组织中初级纤毛的三维成像与分析

本方案详细介绍了集成多路阵列探测器的激光扫描共聚焦显微镜系统在高级成像中的应用及其共享资源管理，适用于高分辨率的细胞及亚细胞成像。该工作流程可在同一平台上实现从共聚焦到超分辨率（约120...

超分辨率成像与共享管理：一种用于多通道检测共聚焦显微镜的实验方案

了解高速超分辨速度显微镜技术，用于在活细胞中追踪原纤毛内的蛋白质运输路径。该方法以NIH-3T3细胞为模型，可揭示正常与功能障碍纤毛的差异，为细胞生物学研究提供高分辨率成像手段。

高速超分辨率SPEED显微镜在活体初级纤毛中的应用

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