高速超分辨速度显微镜在活原纤毛中的应用
2018年1月16日
最近, 我们映射了三维 (3D) 的运输路线的空间位置的各种蛋白质转运内原纤毛的活细胞。本文详细介绍了新应用于活原纤毛的3D 超分辨率荧光成像方法的实验装置、生物样品的处理过程和数据分析。
本实验的总体目标是确定初级纤毛中的蛋白质转运途径。这种方法可以帮助回答纤毛领域的关键问题，例如正常和功能失调纤毛的蛋白质运输途径差异。该技术的主要优点是它具有足够高的分辨率，可以看到活细胞中的亚衍射蛋白质转运路线。
首先，在 37 摄氏度下解冻由 NIH-3T3 细胞专门设计的冷冻原液，比实验提前一周半。将解冻的细胞转移到含有 3 mL 预热培养基的 25 cm 见方的细胞培养瓶中。将细胞保持在 37 摄氏度，在 5% 二氧化碳培养箱中。
培养细胞直至达到 80% 汇合，然后分裂细胞。为了分裂细胞，用 0.25% 胰蛋白酶在 37 摄氏度下胰蛋白酶消化它们 2 分钟。短暂孵育后，吸出胰蛋白酶并用两毫升预热的培养基代替。
移液介质以打碎任何细胞簇，然后从培养瓶中取出 75% 的细胞，并将培养基总体积恢复到 3 mL。实验前至少将细胞分开 3 次，以确保其细胞周期的均匀性。实验前两天，分液细胞，用 1.5 毫升相同培养基将它们接种在 35 毫米玻璃底板上，使其 60-70% 汇合。
然后，在实验前一天，用所需的质粒对细胞进行化学转染。将 500-1000 ng 质粒以 1：2.5 的比例与转染试剂和 0.25 mL 无抗生素的减血清培养基混合 30 分钟。转染复合物形成后，从 35 毫米玻璃底培养皿中吸出培养基，并用 0.25 毫米的转染混合物和额外的 1.25 毫米不含抗生素的减血清培养基替换，然后将板放回培养箱中。
对于具有外部标记的 SSTR3 构建体的细胞，在实验前一小时从玻璃底培养皿中取出培养基。用 1 毫升 PBS 洗涤细胞 5 次，并加入 1 毫升补充有 1 微摩尔 Alexa 647 偶联链霉亲和素的减血清培养基。实验前不超过 15 分钟，从玻璃底培养皿中取出培养基，并用 1 毫升 PBS 洗涤细胞 5 次。
然后将 1 毫升成像缓冲液加入玻璃底培养皿中。将玻璃底板固定在显微镜中的载物台上。使用 GFP 过滤器组找到 GFP 表达细胞，并定位在初级纤毛中正确表达 SSTR3-GFP 的细胞。
找到合适的细胞后，将初级纤毛底部的 NPHP4-mCherry 点与成像平面上对应于激光单点照明的位置对齐。使用捕捉功能，在聚焦控制窗口的相机选项卡中，捕获用绿色荧光蛋白标记的 NPHP4-mCherry 和 SSTR3 蛋白的落射荧光图像。获得参考图像后，通过用 1 毫瓦激光照明对过渡区进行光漂白 20 秒，局部降低标记的单分子浓度。
为了准备单分子追踪，请将 Alexa 647 标记的分子的激光照明功率降低到 0.5 毫瓦。将 Gain 和 Intensification 设置为最大值，并将帧速率设置为 2 毫秒。然后单击对焦控制窗口的相机选项卡中的流按钮，并使用适当的照明激光器。
记录未光漂白标记的单分子，因为它们通过过渡区的光漂白区域运输。请记住录制不超过两分钟的视频，以避免睫状漂移的影响。捕获单个分子后，使用 2D 高斯拟合算法（例如 Gelles 实验室的 Glimpse）处理视频，该算法可以精确定位每个单个分子的激发点、扩散函数和感兴趣的包围区域的质心。
最后，选择精度优于 10 纳米的所有单分子位置，并根据拟合 2D 高斯函数的单分子位置的分布校正纤毛中心。如本视频所述，单点照明可用于通过 NPHP4-mCherry 标记的过渡区跟踪 AF647 标记的 SSTR3 分子。在数据分析之前，将单分子视频叠加在宽视场照明上是一个有用的验证步骤，以确保激光器正确对准，并且有足够的信噪比。
这里成像的是一个细胞，其中有一个通过染色鉴定的初级纤毛。IFT20 是鞭毛内运输复合物的组成部分，它沿着初级纤毛内的微管携带货物，以 Arl13b-mCherry 为标志。一旦确定，使用快速显微镜跟踪单个 IFT20-GFP 蛋白。
接下来，使用 2D 到 3D 转换算法生成初级纤毛内蛋白质沿单个维度的空间概率密度分布。这个高密度区域可能与轴丝微管共定位，这与鞭毛内运输路线的已知位置一致。在尝试此过程时，请务必将样品与激光精确对准，以最大程度地减少系统误差。
看完这个视频，你应该对如何使用快速显微镜进行单分子追踪有了很好的了解，并且你会知道如何在初级纤毛中获得单分子转运路线。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本研究聚焦于使用超分辨率荧光成像技术来绘制初级纤毛中蛋白质运输路径的三维（3D）空间位置。详细说明了实验设置和数据分析，以提供对活细胞中蛋白质运输的洞察。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 荧光成像
背景
- 初级纤毛在细胞信号传导中扮演着关键角色。
- 理解蛋白质运输路径可以揭示正常和功能障碍纤毛之间的差异。
- 高分辨率成像技术对于在活细胞中研究这些过程至关重要。
- 这项研究有助于更广泛地理解纤毛功能和功能障碍。
研究目的
- 识别初级纤毛中的蛋白质运输路径。
- 调查正常和功能障碍纤毛之间的运输路径差异。
- 应用新型成像技术以增强活细胞研究的分辨率。
使用的方法
- 3D超分辨率荧光成像。
- NIH-3T3细胞的活细胞成像准备。
- 在受控条件下解冻和培养细胞。
- 数据分析以绘制蛋白质运输路径。
主要结果
- 成功绘制了活初级纤毛中的蛋白质运输路径。
- 识别了在不同条件下运输路径的关键差异。
- 展示了成像技术的有效性。
- 对纤毛中蛋白质运输动态提供了洞察。
结论
- 该研究为初级纤毛中的蛋白质运输提供了新的视角。
- 高分辨率成像可以揭示关于纤毛功能的关键洞察。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上探索纤毛功能障碍。
常见问题
Executive Industry Relevance
Mapping protein transport routes in primary cilia addresses a critical gap in understanding ciliary signaling mechanisms relevant to ciliopathies and neurodevelopmental disorders. High-speed super-resolution SPEED microscopy enables real-time single-molecule tracking in live cells, providing quantitative spatial data that supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This capability enhances predictive confidence in identifying druggable nodes within ciliary signaling pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing 3D spatial probability density maps of ciliary protein transport routes in live primary cilia.
- Operational Value: Supports functional target validation by resolving subdiffraction transport pathways of cytosolic and membrane proteins involved in intraflagellar transport.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking through direct observation of protein dynamics in disease-relevant cellular models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems (NIH-3T3 cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins) for downstream compound screening and target engagement studies.
- Quantitative Output: Generates 3D spatial probability density maps that serve as standardized, reproducible readouts for assessing compound effects on protein trafficking.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple ciliary proteins (e.g., SSTR3, IFT20) and disease models through consistent sample preparation and imaging protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects to translational biomarker alignment by identifying transport route differences between normal and dysfunctional cilia, informing preclinical model selection.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by providing mechanistic insights into cargo transport along axonemal microtubules.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing transport defects that correlate with ciliary dysfunction phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
Positioned within the discovery continuum, SPEED microscopy supports hypothesis testing in early discovery, enables assay-ready systems for screening, and provides quantitative spatial analytics that inform lead identification and preclinical progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping 3D transport routes of ciliary proteins in live cells.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized preparation of live primary cilia models and reproducible single-molecule tracking outputs.
- Analytics: Provides high-precision spatial measurements (sub-10 nm localization) and probability density distributions that enable condition comparison and effect quantification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking observed transport routes to known intraflagellar transport mechanisms and disease-associated phenotypes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging capability across multiple targets and cell lines due to its adaptability to various fluorescence-tagged ciliary proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in ciliary protein trafficking.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through defined cell preparation, transfection, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of transport-related liabilities, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of ciliary targets based on functional transport data from live-cell models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy, single-molecule tracking, and live-cell imaging techniques.
- Depends on specialized instrumentation including high-speed laser illumination, sensitive cameras (e.g., EMCCD), and environmental control for live-cell maintenance.
- Necessitates cross-team standardization of transfection efficiency, expression levels, and photobleaching protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different ciliary proteins or cell types due to variability in transfection efficiency and cilia formation.
- Limited by the need for precise laser-sample alignment to minimize systematic error in 2D-to-3D transformation and spatial mapping accuracy.
