Name: 人体滋养层模型研究母体肥胖炎症对胎盘自噬的调节作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 了解人体滋养层细胞培养模型如何研究母体肥胖相关炎症对胎盘基因调控的影响。该方法通过TNFα处理模拟炎症环境，为理解肥胖相关胎盘功能障碍提供重要实验基础。

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作者感谢捐赠胎盘用于本研究的女性。我们还感谢俄勒冈健康与科学大学（OHSU）的产科与分娩科以及母胎研究团队在胎盘收集协调方面提供的支持。我们衷心感谢Eric Wang博士和Kelly Kuo医学博士在实验方法及优化过程中给予的支持与帮助。
本工作由美国国立卫生研究院（NIH HD076259A，AM）和美国心脏协会（AHA GRNT29960007，AM）资助。

胎盘样本由俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学附属大学医院的产科与分娩科根据机构审查委员会批准的方案收集，并取得患者的知情同意。
1. 胎盘组织的采集
<ol>
	<li>准备 
	注意：所有接触组织的设备必须无菌。
	<ol>
		<li>将解剖器械在121 °C条件下高压灭菌60分钟。</li>
		<li>使用个人防护装备（PPE）：实验服/防护服/刷手服、手套，以及带面罩或护目镜的口罩。</li>
		<li>打开水浴锅并设定温度为 37 °C。</li>
		<li>将两个50 mL离心管预热，每个离心管中加入25 mL完全培养基（Iscove改良的Dulbecco培养基，添加10% FBS和1%青霉素/链霉素）， 表3在37 °C水浴中。</li>
		<li>在获得患者知情同意后，于剖宫产术后立即获取胎盘。</li>
		<li>熟悉胎盘的结构。脐带附着于胎儿面（绒毛膜板），可见血管从脐带附着处呈放射状延伸。另一面为母体面，即底蜕膜板，包含蜕膜组织以及含有血管树的结构，称为叶状绒毛。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>绒毛组织取样 
	注意：胎盘绒毛组织应在分娩后尽快取样，最好在30分钟内完成。
	<ol>
		<li>将绒毛膜板朝上，使用镊子和剪刀，在距离胎盘边缘约2-3 cm处随机截取2-3块全层组织（大小约为2.5 cm × 2.5 cm）图1A). 
		注意：避免取用外观异常的胎盘组织（如白色钙化灶）。</li>
		<li>剔除绒毛膜和基底板以及任何大型血管。</li>
		<li>将获得的绒毛组织（图1B在温热的完全培养基中处理（总计约80–120克），并在取样后30分钟内开始滋养层细胞的分离。 
		注意：递送、取样与滋养层细胞分离之间的时间间隔长短会影响某些后续检测和应用的效果。应尽量缩短这些间隔时间，并在不同分离操作间保持一致。</li>
		<li>采用1.2.1–1.2.2步骤中所述技术，从胎盘不同区域（包括中心部位）随机取5个1 cm × 1 cm的绒毛组织样本。</li>
		<li>将每份1 cm × 1 cm的绒毛组织样本切成4–5个小块（每块约30 mg），置于2 mL微量离心管中，并在液氮中快速冷冻2-80 °C 保存，用于后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 从绒毛组织中分离滋养层细胞
<ol>
	<li>准备 
	注意：使用无菌设备，并在超净工作台内进行涉及细胞的操作。
	<ol>
		<li>解冻四管冷冻的密度梯度液表1，参见补充材料中的必需耗材、试剂和设备清单，在胎盘送达前一晚将其置于 4 °C。 
		注意：也可在分离当天制备密度梯度。</li>
		<li>开启离心机并设置温度为 20 °C。 
		注意：除非另有说明，所有离心步骤均以最大加速度和最大减速度进行。</li>
		<li>配制含 Ca 的 1x HEPES 缓冲盐溶液（HBSS）+2 和 Mg+2 (表3).</li>
		<li>将胰蛋白酶预热至 37 °C。</li>
		<li>将DNase用无菌添加物的HBSS稀释至约2720千单位/毫升。</li>
		<li>将50 mL新生牛血清（NCS）预热至37 °C。</li>
		<li>将完全培养基预热至 37 °C。</li>
		<li>预热的冻存液（90% FBS，10% DMSO， 表3至 37 °C。 
		警告： DMSO 具有毒性，操作时必须佩戴手套。</li>
		<li>配制消化缓冲液（表2和表3通过在无菌瓶中混合308 mL添加了补剂的HBSS、50 mL胰蛋白酶（3751.7 BAEE单位/mL）和0.5 mL DNase（379.4千单位/mL）制备。 
		注意：从绒毛组织中分离细胞所需时间约为 7 h。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>处理绒毛组织
	<ol>
		<li>用含有室温磷酸盐缓冲液（PBS）的50 mL锥形管冲洗每一块绒毛组织。根据需要重复操作并更换PBS，直至去除多余血液（当组织充分冲洗后，PBS冲洗液将呈淡红色或粉红色）。</li>
		<li>将绒毛组织置于无菌培养皿中，用显微镜载玻片轻轻刮除血管上的柔软绒毛组织，尽可能去除所有血管。</li>
		<li>使用剪刀将所得绒毛组织切碎。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>绒毛组织消化及滋养层细胞粗分离
	<ol>
		<li>将剪碎的绒毛组织根据胰蛋白酶和DNase的特定活性计算出的体积（165 mL）转移至含有消化液的无菌瓶中， 表2).</li>
		<li>在37 °C水浴中以每分钟70转（rpm）的转速振荡孵育35分钟后，将消化瓶倾斜放置，使未消化的组织碎片沉降至瓶底。用血清移液管小心吸取上清液，避免触及已沉降的组织。</li>
		<li>将上清液通过100 µm细胞滤筛，均匀分装至50 mL锥形管中。 
		注意：为节省时间，建议在第二次消化时，向剩余的沉淀组织中加入消化液（110 mL，表2），并按照步骤2.3.2所述重新开始孵育。</li>
		<li>轻轻将3 - 5 mL NCS沿管底缓慢用血清移液管加至滤过上清液下方。应可见滤过上清液（含滋养层细胞）与NCS之间形成液面弯月面。图2A).</li>
		<li>在20 °C下，以1,250 × g离心上清液与NCS混合物15分钟。离心后形成的沉淀中，最底层为红细胞，其上为含有滋养层细胞的白色层。图2B).</li>
		<li>重复步骤 2.3.2 - 2.3.5，分别进行第二次和第三次消化（向组织瓶中分别加入 110 mL 和 83.5 mL 消化液） 表2).</li>
		<li>所有上清液离心后，将每个沉淀重悬于5 mL温热的完全培养基中，然后将各悬液合并。</li>
		<li>将细胞悬液均分至两个50 mL离心管中，在20 °C下以1,250 x g离心15分钟。</li>
		<li>轻轻吸除上清液，将每份细胞沉淀重悬于6 mL预热的完全培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>密度梯度离心
	<ol>
		<li>使用移液管将细胞悬液缓慢而轻柔地分层加至四个密度梯度液的上层，每个密度梯度液分配3 mL细胞悬液。</li>
		<li>在20 °C下，以1,250 × g离心20分钟，加速度和减速度设为最低，离心密度梯度。此步骤应产生可区分的沉降细胞条带（表 4).</li>
		<li>缓慢而小心地移除密度梯度介质（DGM）的上层液体，直至露出含有滋养层细胞的不透明条带（位于35%&#160;- 达到50% DGM时（表4).</li>
		<li>将滋养层细胞条转移至两个50 mL锥形管中，加入预热的完全培养基至满管。</li>
		<li>轻轻倒置离心管3至6次以混匀，然后在20 °C下以1,250 × g离心15分钟。</li>
		<li>移除上清液，将每份细胞沉淀重悬于 5 mL 预热的完全培养基中。合并细胞悬液，使用血细胞计数板和台盼蓝（或选用的细胞计数方法）计数活细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用血细胞计数板进行细胞计数
	<ol>
		<li>使用移液管上下吹打混匀细胞悬液，或轻轻翻转离心管数次以混匀。</li>
		<li>取等体积的细胞悬液与台盼蓝溶液（例如，各20 µL）加入另一管中，轻轻混匀。</li>
		<li>室温孵育1 - 2分钟。</li>
		<li>将15 - 20 µL细胞与台盼蓝混合液轻轻滴加至盖玻片与血细胞计数板之间，依靠毛细作用使细胞均匀扩散至计数网格区域。</li>
		<li>用计数器统计四个4×4方格中每个方格内的活细胞数量（死细胞会被染成深蓝色）。采用统一的计数规则，避免重复计数（例如，不计数接触下方或左侧边界的细胞）。 
		注意：每个4×4方格应包含50–150个细胞。细胞数量过少或过多可能导致细胞计数偏高或偏低。</li>
		<li>取4个4方格区域的总细胞数的平均值，再乘以104，然后乘以稀释倍数（细胞悬液与台盼蓝的比例），以计算每毫升的细胞数量。</li>
		<li>将每毫升细胞数量乘以细胞悬液的总体积，以计算总细胞产量。 
		注意：从80-120 g绒毛组织开始分离，预计可获得约1亿个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞接种
	<ol>
		<li>每孔接种300万个细胞（3.3 × 10⁵ 个细胞/mL）5 每平方厘米细胞数2在6孔板中（每孔2 mL悬液），轻轻前后左右摇动以均匀分散细胞。 
		注意：滋养层细胞需要经过组织培养处理的培养板才能正常贴壁。需要形成单层细胞以促进合体化。</li>
		<li>将接种的细胞置于超净工作台中静置约30分钟，以使细胞均匀分布、沉降并开始贴附于孔板底部，之后再放入培养箱中。</li>
		<li>在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养细胞，最长72小时（每天更换培养基）2 和95%湿度。 
		注意：在培养期间，每隔24小时在显微镜下以10–20倍物镜观察滋养层细胞一次。滋养层细胞不增殖，无法传代。在72小时的培养过程中，圆形的单个滋养层细胞会融合形成合体滋养层（syncytium）图3A 和 B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冻存细胞
	<ol>
		<li>以1,250 × g离心10分钟（20 °C），沉淀未使用的细胞。</li>
		<li>尽可能吸除沉淀物中的上清液。</li>
		<li>将沉淀重悬于冷冻保存液中（表3).</li>
		<li>将分装样品置于装有100%异丙醇的冻存容器中，在-80 °C下冷冻。将冷冻后的分装样品转移至液氮中。2 次日进行长期保存。 
		注意：细胞在冻存后可进行培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解冻细胞
	<ol>
		<li>取出一份冷冻细胞，在37 °C水浴中边旋转边解冻。在细胞完全解冻成液体之前，及时将样品从水浴中取出。</li>
		<li>立即将解冻的细胞转移至15 ml锥形管中。先缓慢加入10 mL完全培养基，并间歇性混匀。</li>
		<li>将管子颠倒数次以混匀。</li>
		<li>在 20 °C 下以 200 x g 离心 10 分钟。</li>
		<li>吸弃上清液，将沉淀物重悬于 2 - 5 mL 温热的完全培养基中。</li>
		<li>计数细胞，并按照前述方法接种。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用TNFα处理原代滋养层细胞、收集细胞裂解液及进行蛋白质印迹分析
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>将完全培养基预热至 37 °C。</li>
		<li>用完全培养基配制 10 µg/mL 的 TNFα 储存液，并于 -20 °C 保存，直至使用。</li>
		<li>处理细胞前，用完全培养基将 TNFα 储存液稀释为 1 µg/mL 的工作液。再将该工作液用完全培养基进行系列稀释，得到 104 pg/mL、103 pg/mL、500 pg/mL、250 pg/mL 和 125 pg/mL 的浓度。 
		注意：104 pg/mL 的 TNFα 浓度具有中等细胞毒性。实际测试的 TNFα 浓度应根据下游应用的具体需求进行调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 TNFα 处理细胞
	<ol>
		<li>培养 24 小时后，吸除细胞培养基，每孔加入 2 mL 含 TNFα 的完全培养基（6 孔板，每个处理组和对照组至少设两孔）。</li>
		<li>经 TNFα 处理 24 小时（总培养时间为 48 小时）后，吸除含 TNFα 的培养基，更换为完全培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集细胞及总蛋白提取
	<ol>
		<li>培养 72 小时后（即去除 TNFα 后 24 小时），吸除培养基，用室温 PBS 轻柔冲洗细胞，然后直接向每孔加入 80 µL 冰冷的含新鲜添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀分析缓冲液（RIPA 缓冲液）（表 3）。</li>
		<li>用细胞刮刀将细胞从培养板上刮下，转移至 1.5 mL 微量离心管中，同一处理组的孔合并收集。</li>
		<li>将离心管置于涡旋振荡器上，高速涡旋至少 3 次，每次 15 秒，以裂解细胞。</li>
		<li>4 °C 条件下轻轻摇动孵育 15 分钟。 
		注意：也可在步骤 3.3.3 之后，将细胞在冰上孵育 15 分钟，期间通过轻弹管壁、涡旋或反复吹打进行间歇性混匀。</li>
		<li>重复步骤 3.3.3。</li>
		<li>在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞碎片。</li>
		<li>将上清液（含细胞蛋白）转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，并于 -80 °C 保存。 
		注意：本步骤可作为暂停点，后续可继续实验。建议将细胞蛋白样品分装成多份，避免反复冻融。</li>
		<li>采用合适方法（如二辛可宁酸法（BCA），参见补充材料中的必需试剂、耗材与设备表）测定总蛋白浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rubicon 或目标蛋白的 SDS-PAGE 与蛋白质印迹分析 
	注意：按照制造商说明，使用实验室常规系统进行蛋白质印迹实验。
	<ol>
		<li>在 12% 丙烯酰胺凝胶的每孔中上样 20–40 µg 总蛋白（溶于上样缓冲液中）（表 3），在电泳缓冲液（表 3）中进行 SDS-PAGE 分离。</li>
		<li>按照制造商说明，使用转移缓冲液（表 3），将凝胶中的蛋白湿转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。</li>
		<li>将膜置于含 5% 脱脂奶粉的含 0.1% Tween 20 的 Tris 缓冲盐水（TBST，表 3）中，室温摇动孵育至少 1 小时。</li>
		<li>将膜置于含 Rubicon 一抗（参见补充材料中的必需试剂、耗材与设备表）的 TBST 溶液（含 1% 脱脂奶粉）中，按 1:500 稀释，4 °C 摇动孵育过夜。</li>
		<li>室温摇动条件下，用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟，再用 TBS 洗涤 1 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>将膜置于含二抗（HRP 标记或其他可见标记，参见补充材料中的必需试剂、耗材与设备表）的 TBST 溶液（含 5% 脱脂奶粉）中，按 1:2000 至 1:5000 稀释，室温摇动孵育至少 1 小时。</li>
		<li>重复步骤 3.4.5 的洗涤程序，并使用合适的显色底物（如化学发光底物）在成像系统上显影。</li>
		<li>重复步骤 3.4.5 的洗涤程序，按照制造商说明，用 β-actin 或其他合适的内参抗体对膜进行二次探查。</li>
		<li>使用合适的图像分析软件，通过手动测定吸光度（条带强度）、扣除背景吸光度，并归一化至相应的内参条带强度，分析 Rubicon 的表达水平。根据需要进行统计学分析，以评估蛋白水平变化的统计学显著性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

胎盘负责调控胎儿的生长发育，在母体肥胖环境中其功能会受到损害6。尽管滋养层细胞具有较高的代谢需求，但在母体肥胖情况下，胎盘表现出线粒体呼吸功能障碍6,19。胎盘代谢的改变可能与肥胖妊娠中并发症发生率升高以及不良胎儿结局有关3,6,7。母体肥胖还会影响胎盘中的自噬功能。来自伴有男性胎儿的肥胖妊娠的胎盘显示出自噬流功能障碍，表现为自噬体的积聚13。维持最佳的自噬流对细胞稳态至关重要，而母体肥胖胎盘中自噬功能的缺陷可能在介导肥胖妊娠相关不良结局中发挥重要作用。
母体肥胖所表现出的胎盘功能受损的精确病因尚不明确，其可能起源于炎症信号通路。肥胖和妊娠均属于促炎状态，其特征是循环中TNFα水平升高<...

肥胖是一种以慢性低度炎症为特征的炎性状态，源于过多的脂肪组织和营养物质的过剩。在肥胖状态下，促炎性细胞因子在代谢组织中以及全身循环中均升高。大量证据表明，TNFα在肥胖环境中显著升高，并与胰岛素抵抗和代谢功能障碍密切相关1。TNFα的激活还在癌症和自身免疫等疾病的发生发展中起重要作用，因此成为有前景的治疗靶点2。
肥胖相关的炎症会因妊娠而加剧，而妊娠本身也是一种促炎状态3,4。先前研究已表明，在女性胎儿的妊娠中，胎盘TNFα含量随母体脂肪量的增加而升高。此外，TNFα处理可抑制女性胎儿滋养层细胞的线粒体呼吸，但对男性胎儿细胞无此作用，提示TNFα以性别差异的方式参与调控胎盘代谢5。母体肥胖与妊娠期间多种并发症发生率升高相关，包括死产，而男性胎儿的易感性最高3,6,7,8。由于胎盘在母胎界面发挥关键作用，因此在肥胖的宫内环境中，胎盘功能能力的变化可能在介导肥胖妊娠结局中起重要作用，这种变化是对炎症信号响应的结果。
胎盘绒毛组织中的细胞滋养层细胞和合体滋养层细胞在母体与发育中胎儿之间的内分泌信号传导以及营养物质和氧气交换过程中起着关键作用9。绒毛细胞滋养层细胞（下文简称为滋养层细胞）功能能力的受损可能危及胎儿的健康与发育。本方案描述了一种通过剥离绒毛膜板和基底板来采集人足月胎盘绒毛组织的方法，并提供了一套优化的滋养层细胞分离流程，用于原代细胞培养。该方案基于已建立的技术方法，包括通过酶消化法降解绒毛组织以释放细胞外基质中的细胞，随后采用差速密度离心法分离滋养层细胞10,11,12。本方案详细阐述了一种实验策略：将来自瘦型妊娠胎盘的原代滋养层细胞在添加了TNFα的培养基中进行处理，以模拟与母体肥胖相关的炎症微环境中的一个组分。最后，介绍了一种简单的方法，用于收集经TNFα处理后的滋养层细胞的全细胞裂解液，并通过Western blot检测基因表达的变化。
虽然该模型不能重现致肥胖的 在子宫内 通过提供一个受控系统，该模型能够全面解析在母体肥胖条件下，TNFα介导的炎症反应对滋养层细胞应答的独立作用。该模型不仅为发现或验证TNFα信号通路直接调控的滋养层细胞分子靶点提供了机会，同时也可用于检测所观察到的基因表达模式变化是否 体内 在母体肥胖的胎盘中，这可能是由TNFα介导的炎症所致。
本文所述方法旨在研究TNFα介导的炎症对人滋养层细胞自噬调控的影响。来自伴有男性胎儿的肥胖妊娠的滋养层细胞表现出自噬体周转障碍或自噬体成熟异常。13一种名为Rubicon（RUN结构域蛋白Beclin1相互作用蛋白及富含半胱氨酸蛋白）的蛋白质，定位于溶酶体和晚期内体，最近被描述为 &#34;制动器&#34; 在自噬周转过程中，因其作为自噬体成熟的负向调节因子而发挥作用14,15事实上，Rubicon 是一种抑制自噬的蛋白质，这类蛋白极为罕见，因此成为有价值的治疗靶点。关于 Rubicon 的病理生理学意义，目前所知甚少，仅限于其在微生物先天免疫反应中的作用。16,17 心肌细胞保护18采用本方案所述方法发现，在用浓度递增的TNFα（最高至250 pg/mL）处理后，女性原代滋养层细胞中Rubicon表达上调。Rubicon的调控可能在母体肥胖妊娠中女性胎儿较男性胎儿预后更佳的机制中发挥一定作用。该结果模拟了与母体肥胖相关的炎症状态。 离体 通过将人滋养层细胞暴露于外源性TNFα，可建立一个研究肥胖宫内环境对滋养层细胞关键信号通路调控及其对胎盘功能影响的平台。

<table><tbody><tr><td>10X HBSS</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2（无水）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4（无水）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>DNA酶</td><td>沃辛顿生化公司</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶/磷酸酶抑制剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>88668</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Invitrogen</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-600</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ6228822</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>艾斯科夫&amp;rsquo;s 改良杜尔贝科培养基&amp;rsquo;s Medium（IMDM）</td><td>Gibco</td><td>12440-046</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>康宁</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>新生牛血清（NCS）</td><td>Gibco</td><td>26010-074</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（Pen/Strep）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>10% 甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-427-098</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TNF&amp;alpha;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP3177-50UG</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>70013-032</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA 真空采血管</td><td>BD</td><td>366450</td><td></td></tr><tr><td>Percoll（密度梯度介质，DGM）</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>康宁</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 管 2.0 mL，自然色</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>康宁</td><td>25-900-Cl</td><td></td></tr><tr><td>伯乐Mini-PROTEAN Tetra系统</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1658001FC</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Mini Trans-Blot 转印槽</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1658033</td><td></td></tr><tr><td>TGX FastCast 丙烯酰胺试剂盒，12%</td><td>Bio-Rad</td><td>1610175</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean 3 多用制胶室</td><td>Bio-Rad</td><td>1654112</td><td></td></tr><tr><td>4X Laemmli 上样缓冲液</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148-100ML</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Bio-Rad</td><td>1610718</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr><tr><td>速溶脱脂奶粉</td><td>康乃馨</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rubicon (D9F7) 兔单克隆抗体</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>8465S</td><td></td></tr><tr><td>单克隆抗-&amp;beta;-小鼠产生的肌动蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2228-100UL</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 IgG，HRP 标记抗体</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG，HRP 标记抗体</td><td>细胞信号技术公司</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>34578</td><td></td></tr></tbody></table>

一种原代人类滋养层细胞模型，用于研究母体肥胖相关炎症对胎盘自噬调控的影响

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

母体肥胖与不良围产期结局风险增加相关，这种关联可能由胎盘功能受损介导，而胎盘功能受损部分归因于自噬失调。肥胖妊娠胎盘中自噬调控因子表达的异常变化可能受到与肥胖和妊娠均相关的炎症过程的调控。本文描述了一种从足月人胎盘取样绒毛组织并分离绒毛细胞滋养层细胞用于原代细胞培养的方案。随后，通过使用肿瘤坏死因子α（TNFα）处理来自瘦型妊娠的原代滋养层细胞，模拟肥胖宫内环境中的炎症微环境；TNFα是一种在肥胖和妊娠状态下均升高的促炎性细胞因子。通过实施本方案发现，外源性TNFα暴露可调控来自瘦型妊娠且胎儿为女性的滋养层细胞中Rubicon（自噬的负向调控因子）的表达。尽管肥胖宫内环境中多种生物学因素均有可能调节滋养层细胞中的关键通路，但这种ex vivo系统特别有助于确定在母体肥胖的人胎盘中in vivo观察到的表达模式是否直接由TNFα信号传导所致。最终，该方法为解析母体肥胖相关炎症对滋养层细胞中自噬及其他关键细胞通路的调控机制和分子影响提供了机会，这些影响可能进而损害胎盘功能。

来自瘦型孕妇（孕前体重指数（BMI） &lt;25）收集了25名妊娠过程无并发症且胎儿为女性的产妇，在剖宫产（无产程）后15分钟内采集样本。胎盘经检查确认无钙化且发育正常：去除脐带和胎膜后重量介于300–600 g，呈圆形，直径为15–25 cm，脐带插入胎盘中央部位。从胎盘不同部位取2–3个样本，将绒毛组织从底板和绒毛膜板上分离。图1)，获得约100 g绒毛组织作为原代滋养层细胞分离的起始材料。在采集绒毛组织后20分钟内，按照本文所述方法开始原代滋养层细胞的分离操作，可获得0.8 - 1 × 10⁶8 活细胞。将细胞以每孔 3 x 10 的密度接种于 6 孔培养板中6 (3.3 × 105 每平方厘米细胞数2）。培养24 h后，在显微镜下观察细胞贴壁情况，并确认滋养层细胞形态正常（单个圆形细胞）。将培养基更换为含125-10浓度梯度TNFα的完全培养基4 pg/mL，使得每个浓度和阴性对照（仅完全培养基...

本文介绍了一种人胎盘绒毛组织取样后分离细胞滋养层细胞用于原代细胞培养的实验方案。用TNFα处理滋养层细胞可模拟肥胖子宫内环境中的炎症状态，有助于发现母体肥胖胎盘中受炎症调控的分子靶点。

母体肥胖与不良围产期结局风险增加相关，这种关联可能由胎盘功能受损所介导，而胎盘功能受损可能会……

本滋养层细胞培养模型的总体目标是测量与肥胖相关的炎症对滋养层细胞中关键信号通路调控的影响。该控制系统的主要优势在于，它建立了在母体肥胖背景下，TNF-α介导的炎症与胎盘基因调控之间的关联。该实验系统的主要优势在于，它能够在母体肥胖的背景下，建立TNF-α介导的炎症与胎盘基因调控之间的关系。演示该操作的将是我实验室的技术员 Bailey Simon 和 Matt Bucher。胎盘绒毛组织应在分娩后尽快取样，最好在30分钟内完成。将绒毛膜板朝上放置，使用镊子和剪刀从胎盘边缘向内2至3厘米处随机切除2至3个全层组织样本，每个样本大小为2至3厘米。避免取用外观异常的胎盘组织。切除绒毛膜板和基底板以及任何较大的血管。将所得的绒毛组织置于温热的完全培养基中。在采集绒毛组织后的30分钟内，开始滋养层细胞的分离。将每一块绒毛组织置于盛有室温磷酸盐缓冲液（PBS）的50毫升锥形管中，轻轻振荡以释放组织中多余的血液。倾去PBS，更换新鲜PBS。重复 PBS 清洗，直至去除大部分多余的血液。当组织被充分清洗后，PBS 清洗液将呈现淡红色或粉红色。将绒毛组织置于无菌培养皿中，并使用载玻片在显微镜下轻轻刮除附着于血管上的柔软绒毛组织，尽可能去除所有血管。使用剪刀将获得的绒毛组织充分剪碎。根据胰蛋白酶和DNase的特定活性，按计算好的体积，将剪碎的绒毛组织转移至含有消化液的无菌瓶中。将消化瓶置于37摄氏度水浴中，以70 rpm振荡孵育35分钟。35分钟后，将消化瓶倾斜放置，使未消化的组织碎片沉降至瓶底。用血清移液管小心吸取上清液，避免触及沉淀的组织。将上清液通过100微米细胞滤筛，均匀分装至50毫升锥形管中。通过向剩余的已沉降组织中加入消化液，并将瓶子置于37摄氏度水浴中孵育，开始第二次消化。用移液管从离心管底部缓慢加入三到五毫升新生小牛血清（NCS），使其位于第一次消化所得的滤过上清液下方。含有滋养层细胞的滤过上清液与NCS之间应可见到弯月面。将上清液在20°C下以1,250 × g离心15分钟，离心介质为NCS。离心后形成的沉淀物最底层为红细胞，其上为含有滋养层细胞的白色层。同样方法过滤第二次和第三次消化后的上清液。将NCS置于张力下的上清液下方，在20°C下以1,250 × g离心15分钟。待所有上清液完成离心且NCS层与上清液层均被移除后，将每份沉淀物重新悬浮于5毫升温热的完全培养基中，然后合并各悬浮液。将细胞悬液等分为两份，分别加入两个50毫升锥形管中，在20°C下以1,250 × g离心15分钟。轻轻吸除上清液，并将每个细胞沉淀重悬于6 mL温热的完全培养基中。开始此操作时，使用移液管将细胞悬液缓慢而小心地等量分层加至四个密度梯度液的上层。以最低加速度和减速度，在20°C条件下，以1,250 × g离心20分钟。这应产生可区分的沉淀细胞条带。缓慢而小心地移除密度梯度介质的上层，直至到达含有滋养层细胞的不透明条带。将滋养层细胞条带转移至两个50毫升的锥形管中，并用温热的完全培养基充满。轻轻倒置离心管3至6次以混匀，于20摄氏度、1,250 × g条件下离心15分钟。弃去上清液，将每份细胞沉淀重悬于5毫升温热的完全培养基中。合并细胞悬液，使用血细胞计数板和台盼蓝染色计数活细胞。细胞计数后的下一步是接种细胞。在每个六孔板的每孔中接种三百万个细胞。轻轻前后摇动和左右摇动培养板，以使细胞均匀分布。将接种的细胞置于层流通风橱中约30分钟，以使细胞均匀分布、沉降并开始贴附于孔板底部。30分钟后，将培养板放入含5%二氧化碳和95%湿度的37摄氏度培养箱中。培养24小时后，在显微镜下观察滋养层细胞，以确认细胞贴壁情况及滋养层细胞形态正常。细胞可在培养24小时后进行处理。吸除细胞中的培养基，每孔加入2毫升添加TNF-α的培养基。将培养板放回37°C培养箱中继续培养。经 TNF alpha 处理 24 小时后，弃去含 TNF alpha 的培养基，更换为完全培养基，再继续培养 24 小时。在去除 TNF alpha 后的 24 小时，吸除培养基，并用室温 PBS 轻轻冲洗细胞。每孔直接加入 80 微升预冷的含有新鲜添加的蛋白酶和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀分析缓冲液。用细胞刮刀将细胞从培养板上刮下。将细胞转移至 1.5 毫升微量离心管中，同一处理组的孔合并收集。通过在高速下涡旋振荡管子，每次至少15秒，进行至少三个循环来冰浴细胞。将细胞在4°C条件下孵育15分钟，并伴随摇动。再次在高速下涡旋振荡管子。在4°C条件下，以10,000 × g离心5分钟，沉淀细胞碎片。将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。将细胞蛋白样品储存于-80°C，直至进行目标蛋白的Western印迹分析。培养72小时后，对原代滋养层细胞进行细胞角蛋白7（红色显示）的免疫细胞化学分析，结果证实细胞已发生合体化，表现为多核细胞团的形成。此外，波形蛋白（同样以红色显示）的免疫细胞化学分析显示，成纤维细胞污染极少。两幅图像中的细胞核复染均呈蓝色。使用TNFα处理，浓度高达每毫升250皮克时，可上调rubicon的表达。当TNFα浓度超过每毫升250皮克时，rubicon的表达水平则下降至接近甚至低于基线水平。同样，与瘦型对照组相比，来自肥胖妊娠且胎儿为女性的胎盘绒毛组织快速冷冻活检样本中，rubicon的表达显著上调。一旦掌握，若操作得当，从绒毛组织中分离滋养层细胞可在六到七小时内完成。在进行该操作时，提前准备好材料和试剂至关重要，以便能够有条不紊且高效地开展工作。完成该步骤后，可进一步开展其他检测，例如细胞生物能量学测定，以回答更多科学问题，例如：肥胖的宫内环境中存在的炎症是否会影响滋养层细胞的代谢能力？该技术方法为胎盘研究者建立母体环境对滋养层细胞功能的影响奠定了基础。观看本视频后，您将充分了解如何从绒毛组织中分离滋养层细胞用于细胞培养实验，以及如何确定TNFα介导的炎症对滋养层细胞中关键信号通路调控的影响。请注意，操作人源组织、培养细胞、DMSO、丙烯酰胺和还原试剂具有极高危险性，在进行本实验操作时，必须始终采取适当防护措施，例如穿戴合适的个人防护装备（PPE）并采用无菌技术。

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医学

人体滋养层模型研究母体肥胖炎症对胎盘自噬的调节作用

在本实验方案中，我们描述了在小鼠妊娠第10.5天时分离胎盘组织，并通过Percoll梯度分离滋养层细胞的方法。随后，我们展示了将分离得到的细胞用于Matrigel侵袭实验的操作过程。...

小鼠滋养层细胞的分离及滋养层细胞侵袭实验

人原代滋养层细胞培养模型研究褪黑素对缺氧/复氧诱导损伤的保护作用

本文介绍了一种建立原代人胎盘（绒毛）和蜕膜器官培养的简单方法。绒毛和蜕膜器官培养是研究人类母胎界面病理发生机制的宝贵工具。文中展示了对兼性胞内细菌单核细胞增生李斯特菌（Listeria...

利用人胎盘和蜕膜器官培养研究母胎界面感染

本方案可使研究人员分离并鉴定从饮食诱导的代谢紊乱模型中提取的各种典型炎症组织中的组织驻留巨噬细胞。...

从受肥胖相关炎症影响的组织中分离、表征与纯化巨噬细胞

本文介绍了一种简便易行的实验方案，利用三种体外实验方法评估人类滋养层细胞的细胞运动能力：划痕实验、Transwell侵袭实验和细胞增殖实验。...

评估永生化人孕早期滋养层细胞系迁移、侵袭和增殖能力的体外实验方法

我们建立了一种绒毛膜羊膜炎模型，以模拟胎儿在无活体生物并发症的情况下暴露于母体炎症（FEMI）的环境，从而研究FEMI对子代肠道发育的影响。该模型可用于探讨绒毛膜羊膜炎后肠道损伤发生机制的相关病因。...

一种用于研究急性绒毛膜羊膜炎对新生儿肠道发育影响的小鼠母体炎症致胎儿暴露模型

本文介绍了一种将寡核苷酸（如小干扰RNA（siRNA）、microRNA模拟物（miRs）或抗microRNA（anti-miR））导入成熟脂肪细胞以调控蛋白质和microRNA表达的实验方案。...

一种用于研究蛋白质和微小RNA调控对脂肪细胞功能影响的脂肪细胞培养模型

以下是在恒定流动条件下培养胎盘外植体的实验方案。该方法通过模拟动态生理环境，改进了传统的静态绒毛培养系统。...

离体 胎盘外植体流体培养——模拟动态环境条件 子宫内

本方案可实现从人类足月胎盘的底蜕膜和绒毛膜中分离、鉴定和培养原代HLA-G+绒毛外滋养层细胞（EVT）。原代EVT培养物可维持96小时的活力，可用于与配对的母体免疫细胞共培养，并进一步对其相互作用进行流式细胞术和分子分析。...

从人类足月胎盘组织中分离纯化 HLA-G+ 细胞外滋养层细胞用于表型鉴定与功能分析

一个 离体 高脂饮食诱导脂肪组织炎症的小鼠模型

了解人体滋养层细胞培养模型如何研究母体肥胖相关炎症对胎盘基因调控的影响。该方法通过TNFα处理模拟炎症环境，为理解肥胖相关胎盘功能障碍提供重要实验基础。

一种原代人类滋养层细胞模型，用于研究母体肥胖相关炎症对胎盘自噬调控的影响

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