人体滋养层模型研究母体肥胖炎症对胎盘自噬的调节作用
September 27th, 2017
本文介绍了一种用于人胎盘绒毛组织的取样方法, 其次是分离细胞原代细胞培养。滋养治疗 TNFα重述炎症在肥胖的宫内环境和促进发现的分子靶调控的炎症在胎盘孕产妇肥胖。
该滋养层细胞培养模型的总体目标是测量肥胖相关炎症对滋养层细胞关键通路调节的影响。这种控制系统的主要优点是它在孕产妇肥胖的情况下建立了 TNF α 介导的炎症与胎盘基因调控之间的关系。该实验系统的主要优点是它在孕产妇肥胖的情况下建立了 TNF-α 介导的炎症与胎盘基因调控之间的关系。
演示该程序的是我实验室的技术人员 Bailey Simon 和 Matt Bucher。分娩后应尽快从胎盘中取样绒毛组织，最好在 30 分钟或更短的时间内取样。绒毛膜板朝上，用镊子和剪刀从胎盘外围 2 到 3 厘米处随机切除两到三个全层切片。
避免胎盘出现异常的部分。修剪绒毛膜和基底板以及任何大血管。将所得绒毛组织放入温暖的完全培养基中。
在绒毛组织取样后 30 分钟内，开始滋养层分离。将每块绒毛组织放入装有室温 PBS 的 50 毫升锥形管中，轻轻搅拌以释放组织中多余的血液。倒出 PBS 并替换为新鲜的 PBS。
重复 PBS 冲洗，直到去除大部分多余的血液。彻底冲洗组织后，PBS 冲洗液将呈浅红色或粉红色。将绒毛组织放入无菌培养皿中，并使用显微镜载玻片轻轻地从血管中刮掉柔软的绒毛组织，去除尽可能多的血管。
用剪刀将得到的绒毛组织切碎。根据胰蛋白酶和 DNase 的比活性计算的体积，将切碎的绒毛组织转移到装有消化液的无菌瓶中。将消化瓶置于 37 摄氏度的水浴中，以 70 rpm 的速度振荡 35 分钟。
35 分钟后，将消化瓶侧向倾斜，让未消化的组织碎片沉淀在瓶子底部。用血清移液管小心吸取上清液，避开沉淀的组织。通过 100 微米细胞过滤器在 50 mL 锥形管之间均匀分配上清液。
将消化液加入剩余的沉淀组织中，并将瓶子置于 37 摄氏度的水浴中孵育，开始第二次消化。从试管底部的血清移液管中缓慢分配，将 3 到 5 毫升新生犊牛血清 （NCS） 轻轻分层于第一次消化的过滤上清液下方。含有滋养层细胞和 NCS 的应变上清液之间的弯月面应该是可见的。
在20 摄氏度下，用 1， 250 倍 g 的 NCS 离心上清液 15 分钟。所得沉淀将包括最下层的红细胞，然后是含有滋养层细胞的白色层。以同样的方式，从第二次和第三次消化中过滤上清液。
将 NCS 层在过滤的上清液下，并在 20 摄氏度下以 1， 250 倍 g 离心 15 分钟。离心所有上清液并去除 NCS 和上清液层后，将每个沉淀重悬于 5 mL 温热的完全培养基中，然后合并悬浮液。将细胞悬液均匀分装在两个 50 mL 锥形管中，在 20 摄氏度下以 1， 250 倍 g 离心 15 分钟。
轻轻去除上清液，将每个细胞沉淀重悬于 6 mL 温热的完全培养基中。要开始此过程，请使用移液管将细胞悬液平均分配到四个密度梯度之间，缓慢而小心地将细胞悬液分层在密度梯度的顶部。在 20 摄氏度下以 1， 250 倍 g 的离心密度梯度 20 分钟，同时加速和减速最小。
这应该会产生可区分的沉淀细胞条带。缓慢而小心地去除密度梯度培养基的顶层，直到达到包含滋养层细胞的不透明条带。将滋养层带转移到两个 50 毫升锥形管中，并填充温暖的完全培养基。
轻轻倒置试管 3 到 6 次，混合并在 20 摄氏度下以 1， 250 倍 g 离心 15 分钟。去除上清液，将每个细胞沉淀重悬于 5 mL 温热的完全培养基中。合并细胞悬液，并使用血细胞计数器和台盼蓝对活细胞进行计数。
细胞计数后的下一步是接种细胞。在每个 6 孔板中每孔接种 300 万个细胞。轻轻地来回和左右摇动板，以均匀分布细胞。
将铺板的细胞留在层流通风口中约 30 分钟，让细胞均匀分布、沉淀并开始粘附在孔底部。30 分钟后，将板放入 37 摄氏度、二氧化碳含量为 5%、湿度为 95% 的培养箱中。培养 24 小时后，在显微镜下检查滋养层细胞，以确认附着和适当的滋养层形态。
培养 24 小时后即可处理细胞。从细胞中吸出培养基，并用每孔 2 毫升补充 TNF α 的培养基替换。将板放回 37 摄氏度的培养箱中。
TNF α 暴露 24 小时后，用完全培养基替换补充 TNF α 的培养基。再孵育 24 小时。去除 TNF α 后 24 小时，吸出培养基并用室温 PBS 轻轻冲洗细胞。
向每个孔中直接加入 80 μL 冰冷的放射免疫沉淀测定缓冲液，其中含有新鲜添加的蛋白酶和磷酸酶抑制剂。用细胞刮刀从板中取出细胞。将细胞转移到 1.5 mL 微量离心管中，在处理组内合并孔。
将试管高速涡旋至少 3 次，每隔 15 秒，冰敷细胞。将细胞在 4 摄氏度下摇动孵育 15 分钟。再次将管子高处涡旋。
在 4 摄氏度下以 10， 000 次 g 离心 5 分钟，以沉淀细胞碎片。将上清液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。将细胞蛋白质样品储存在 80 摄氏度，直到通过 Western 印迹分析感兴趣的蛋白质。
培养 72 小时后，原代滋养层细胞中细胞角蛋白 7 的免疫细胞化学分析（红色所示）证实细胞发生了合体化，存在多核细胞团证明了这一点。此外，波形蛋白的免疫细胞化学分析（也是红色的）显示很少有污染的成纤维细胞。细胞核复染在两张图像中均以蓝色显示。
用 TNF α 处理高达 250 pg/毫升，上调 rubicon 表达。当 TNF α 浓度大于 250 pg/mL 时，rubicon 表达水平下降到基线甚至以下。同样，与瘦对照组相比，rubicon 在肥胖妊娠女性胎儿胎盘的快速冷冻绒毛组织活检中显着上调。
一旦掌握，如果作得当，可以在 6 到 7 小时内从绒毛组织中分离滋养层。在尝试此程序时，提前准备材料和试剂非常重要，这样您就可以有意识地有效地工作。在此程序之后，可以进行其他检测，例如测量细胞生物能量学的检测，以回答其他问题，例如肥胖宫内环境中的炎症会影响滋养层细胞的代谢能力？
之后，这种显影方法为胎盘研究人员确定母体环境对滋养层功能的影响铺平了道路。观看此视频后，您将很好地了解如何从绒毛组织中分离滋养层细胞以进行细胞培养实验，以及如何确定 TNF α 介导的炎症在滋养层细胞关键通路调节中的作用。不要忘记，与人体组织、培养细胞、DMSO、丙烯酰胺和还原试剂一起工作可能非常危险，并且在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴适当的 PPE 和使用无菌技术。
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概述
该协议概述了人类胎盘绒毛组织的取样以及随后的绒毛滋养细胞分离以用于原代细胞培养。该模型旨在研究与肥胖相关的炎症对滋养细胞基因调控的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 产科
背景
- 孕期肥胖与子宫内环境的炎症有关。
- TNFα是影响滋养细胞的炎症的关键介质。
- 了解胎盘中的基因调控可以揭示干预的分子靶点。
- 滋养细胞的原代细胞培养允许受控的实验条件。
研究目的
- 测量TNFα对滋养细胞基因调控的影响。
- 建立一个模拟孕期肥胖炎症条件的模型。
- 识别胎盘组织中由炎症调控的分子靶点。
使用的方法
- 在分娩后30分钟内取样胎盘绒毛组织。
- 分离绒毛滋养细胞以备培养。
- 用TNFα处理滋养细胞以模拟炎症条件。
- 分析受炎症影响的基因调控途径。
主要结果
- 建立了可靠的滋养细胞培养模型。
- 展示了TNFα在调控滋养细胞基因表达中的作用。
- 识别了受肥胖相关炎症影响的关键途径。
- 洞察了胎盘功能障碍的潜在治疗靶点。
结论
- 滋养细胞模型有效地模拟了孕期肥胖的炎症环境。
- 研究结果有助于理解胎盘在炎症条件下的基因调控。
- 这项研究可能为未来的肥胖相关胎盘问题干预措施提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
Obesity-driven inflammation in pregnancy presents a significant challenge for placental function, impacting fetal outcomes and translational research. This primary human trophoblast model enables direct interrogation of inflammatory signaling, such as TNFα-mediated pathways, on autophagy regulation in the placenta. The system provides a controlled, disease-relevant platform for mechanistic de-risking and target validation in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven testing of inflammatory mediators on placental gene regulation.
- Supports mechanistic de-risking by isolating TNFα effects on autophagy regulators like Rubicon.
- Facilitates functional target validation in a primary human cell context.
- Provides predictive confidence for downstream pathway modulation strategies.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated primary trophoblast system for quantitative readouts.
- Supports reproducible measurement of gene and protein expression changes under defined inflammatory conditions.
- Enables assay standardization for screening modulators of autophagy and inflammation.
- Prepares a scalable platform for evaluating compound effects on placental pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for maternal obesity and placental dysfunction.
- Provides translational continuity from in vivo observations to ex vivo mechanistic studies.
- Supports risk-adjusted advancement of targets implicated in placental inflammation.
- Enables biomarker exploration for placental health in metabolic disease contexts.
Pipeline & Workflow Integration
This model bridges early discovery and preclinical research by enabling direct testing of inflammatory hypotheses in primary human trophoblasts, supporting lead identification and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing of TNFα-driven autophagy regulation in placental cells.
- Screening: Provides quantitative, reproducible outputs for gene and protein expression under controlled inflammatory stimuli.
- Analytics: Supports statistical comparison of treatment conditions and dose-response relationships.
- Translational Research: Connects in vivo placental findings to ex vivo mechanistic validation in human cells.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse assays targeting placental inflammation and metabolic dysfunction.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target-pathway relationships for placental inflammation.
- Operational Value: Standardizes primary cell isolation and treatment protocols for reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for targets modulating autophagy in maternal obesity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of placental targets for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human tissue handling and primary cell culture.
- Demands access to placental tissue and specialized cell isolation infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible outputs.
- Adaptation may be needed for different gestational ages or disease states.
- Practical limitations include tissue availability and donor variability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Collection of Placental Tissue
1:42
Isolation of Trophoblasts from Vilous Tissue
5:11
Density Centrifugation
6:29
Plating Cells
7:18
Treating Cells with TNFα and Harvesting Cells and Total Protein
9:10
Results: TNFα Regulates the Expression of Rubicon in Trophoblasts from Lean Pregnancies with Female Fetuses
10:20
Conclusion
