一种原代人类滋养层细胞模型，用于研究母体肥胖相关炎症对胎盘自噬调控的影响

本滋养层细胞培养模型的总体目标是测量与肥胖相关的炎症对滋养层细胞中关键信号通路调控的影响。该控制系统的主要优势在于，它建立了在母体肥胖背景下，TNF-α介导的炎症与胎盘基因调控之间的关联。该实验系统的主要优势在于，它能够在母体肥胖的背景下，建立TNF-α介导的炎症与胎盘基因调控之间的关系。

演示该操作的将是我实验室的技术员 Bailey Simon 和 Matt Bucher。胎盘绒毛组织应在分娩后尽快取样，最好在30分钟内完成。将绒毛膜板朝上放置，使用镊子和剪刀从胎盘边缘向内2至3厘米处随机切除2至3个全层组织样本，每个样本大小为2至3厘米。

避免取用外观异常的胎盘组织。切除绒毛膜板和基底板以及任何较大的血管。将所得的绒毛组织置于温热的完全培养基中。

在采集绒毛组织后的30分钟内，开始滋养层细胞的分离。将每一块绒毛组织置于盛有室温磷酸盐缓冲液（PBS）的50毫升锥形管中，轻轻振荡以释放组织中多余的血液。倾去PBS，更换新鲜PBS。

重复 PBS 清洗，直至去除大部分多余的血液。当组织被充分清洗后，PBS 清洗液将呈现淡红色或粉红色。将绒毛组织置于无菌培养皿中，并使用载玻片在显微镜下轻轻刮除附着于血管上的柔软绒毛组织，尽可能去除所有血管。

使用剪刀将获得的绒毛组织充分剪碎。根据胰蛋白酶和DNase的特定活性，按计算好的体积，将剪碎的绒毛组织转移至含有消化液的无菌瓶中。将消化瓶置于37摄氏度水浴中，以70 rpm振荡孵育35分钟。

35分钟后，将消化瓶倾斜放置，使未消化的组织碎片沉降至瓶底。用血清移液管小心吸取上清液，避免触及沉淀的组织。将上清液通过100微米细胞滤筛，均匀分装至50毫升锥形管中。

通过向剩余的已沉降组织中加入消化液，并将瓶子置于37摄氏度水浴中孵育，开始第二次消化。用移液管从离心管底部缓慢加入三到五毫升新生小牛血清（NCS），使其位于第一次消化所得的滤过上清液下方。含有滋养层细胞的滤过上清液与NCS之间应可见到弯月面。

将上清液在20°C下以1,250 × g离心15分钟，离心介质为NCS。离心后形成的沉淀物最底层为红细胞，其上为含有滋养层细胞的白色层。同样方法过滤第二次和第三次消化后的上清液。

将NCS置于张力下的上清液下方，在20°C下以1,250 × g离心15分钟。待所有上清液完成离心且NCS层与上清液层均被移除后，将每份沉淀物重新悬浮于5毫升温热的完全培养基中，然后合并各悬浮液。将细胞悬液等分为两份，分别加入两个50毫升锥形管中，在20°C下以1,250 × g离心15分钟。

轻轻吸除上清液，并将每个细胞沉淀重悬于6 mL温热的完全培养基中。开始此操作时，使用移液管将细胞悬液缓慢而小心地等量分层加至四个密度梯度液的上层。以最低加速度和减速度，在20°C条件下，以1,250 × g离心20分钟。

这应产生可区分的沉淀细胞条带。缓慢而小心地移除密度梯度介质的上层，直至到达含有滋养层细胞的不透明条带。将滋养层细胞条带转移至两个50毫升的锥形管中，并用温热的完全培养基充满。

轻轻倒置离心管3至6次以混匀，于20摄氏度、1,250 × g条件下离心15分钟。弃去上清液，将每份细胞沉淀重悬于5毫升温热的完全培养基中。合并细胞悬液，使用血细胞计数板和台盼蓝染色计数活细胞。

细胞计数后的下一步是接种细胞。在每个六孔板的每孔中接种三百万个细胞。轻轻前后摇动和左右摇动培养板，以使细胞均匀分布。

将接种的细胞置于层流通风橱中约30分钟，以使细胞均匀分布、沉降并开始贴附于孔板底部。30分钟后，将培养板放入含5%二氧化碳和95%湿度的37摄氏度培养箱中。培养24小时后，在显微镜下观察滋养层细胞，以确认细胞贴壁情况及滋养层细胞形态正常。

细胞可在培养24小时后进行处理。吸除细胞中的培养基，每孔加入2毫升添加TNF-α的培养基。将培养板放回37°C培养箱中继续培养。

经 TNF alpha 处理 24 小时后，弃去含 TNF alpha 的培养基，更换为完全培养基，再继续培养 24 小时。在去除 TNF alpha 后的 24 小时，吸除培养基，并用室温 PBS 轻轻冲洗细胞。

每孔直接加入 80 微升预冷的含有新鲜添加的蛋白酶和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀分析缓冲液。用细胞刮刀将细胞从培养板上刮下。将细胞转移至 1.5 毫升微量离心管中，同一处理组的孔合并收集。

通过在高速下涡旋振荡管子，每次至少15秒，进行至少三个循环来冰浴细胞。将细胞在4°C条件下孵育15分钟，并伴随摇动。再次在高速下涡旋振荡管子。

在4°C条件下，以10,000 × g离心5分钟，沉淀细胞碎片。将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。将细胞蛋白样品储存于-80°C，直至进行目标蛋白的Western印迹分析。

培养72小时后，对原代滋养层细胞进行细胞角蛋白7（红色显示）的免疫细胞化学分析，结果证实细胞已发生合体化，表现为多核细胞团的形成。此外，波形蛋白（同样以红色显示）的免疫细胞化学分析显示，成纤维细胞污染极少。两幅图像中的细胞核复染均呈蓝色。

使用TNFα处理，浓度高达每毫升250皮克时，可上调rubicon的表达。当TNFα浓度超过每毫升250皮克时，rubicon的表达水平则下降至接近甚至低于基线水平。同样，与瘦型对照组相比，来自肥胖妊娠且胎儿为女性的胎盘绒毛组织快速冷冻活检样本中，rubicon的表达显著上调。

一旦掌握，若操作得当，从绒毛组织中分离滋养层细胞可在六到七小时内完成。在进行该操作时，提前准备好材料和试剂至关重要，以便能够有条不紊且高效地开展工作。完成该步骤后，可进一步开展其他检测，例如细胞生物能量学测定，以回答更多科学问题，例如：肥胖的宫内环境中存在的炎症是否会影响滋养层细胞的代谢能力？

该技术方法为胎盘研究者建立母体环境对滋养层细胞功能的影响奠定了基础。观看本视频后，您将充分了解如何从绒毛组织中分离滋养层细胞用于细胞培养实验，以及如何确定TNFα介导的炎症对滋养层细胞中关键信号通路调控的影响。请注意，操作人源组织、培养细胞、DMSO、丙烯酰胺和还原试剂具有极高危险性，在进行本实验操作时，必须始终采取适当防护措施，例如穿戴合适的个人防护装备（PPE）并采用无菌技术。