Name: 线虫线虫线虫-一个多用途的体内模型研究宿主-微生物相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 了解使用秀丽隐杆线虫研究宿主-微生物相互作用的方法，探索真菌感染对病原菌毒力和宿主免疫反应的影响。该实验系统快速、简便且经济高效，适用于感染性疾病研究和新药发现。

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本工作在伍斯特理工学院完成，并由该机构提供支持。

1. 线虫生长培养基（NGM）的制备
<ol>
	<li>配制 1 L 培养基时，将 20 g 琼脂、2.5 g 有机氮源（例如，胰蛋白胨）和 3 g 氯化钠加入 2 L 三角瓶中。加入 975 mL 无菌水。
	<ol>
		<li>加入无菌搅拌子。若使用自动培养基分装仪，将管路和培养基一起高压灭菌 15 分钟；若配制体积更大，则需延长灭菌时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养基置于磁力搅拌器上，使其冷却。
	<ol>
		<li>当培养基冷却至手感温热（约 60 °C）时，在无菌条件下加入 1 mL 1 M MgSO4● H2O、1 mL 1 M CaCl2、25 mL KPO4 和 1 mL 0.5% 乙醇胆固醇溶液。</li>
		<li>在超净工作台中，通过手动或自动泵将培养基倒入无菌的 35 mm × 10 mm 培养皿中。使用前在通风橱内干燥 1–2 天。 
		注意：培养皿应保存在 4 °C 以防止污染。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 制作线虫挑针
<ol>
	<li>剪取一段1.5 cm的铝丝。小心地将其中约0.5 cm插入巴斯德吸管的尖端。
	<ol>
		<li>使用本生灯或酒精灯，将玻璃吸管尖端在火焰中缓慢旋转加热，直至铝丝牢固地粘附在吸管上，同时确保吸管尖端的原始形状不受影响。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 制备 E. coli 培养
<ol>
	<li>使用无菌接种环，挑取单个菌落 大肠杆菌 在200 mL LB液体培养基中接种OP50菌株，37 °C振荡培养过夜。</li>
	<li>液体培养物在第二天即可使用，不使用时可保存于 4 °C。 
	注意：该 E. coli 菌株OP50用作食物来源 秀丽隐杆线虫 该培养物在 4 °C 下保存时可使用长达数月。</li>
</ol>
4. C. elegans 培养的基本操作
<ol>
	<li>用制备好的NGM琼脂平板播种 E. coli 通过将约50 - 100 µL制备好的OP50液体培养物点种于平板中央。</li>
	<li>盖上培养皿，室温下静置干燥24小时。干燥后，如需快速生长，将培养皿置于37 °C过夜；若希望生长较慢，可保持在室温条件下。</li>
	<li>通过以下任一方法将线虫添加到培养皿中 &#34;分块处理，&#34; （参见方案步骤 5） &#34;分段与挑取线虫&#34;），单独挑取线虫，或将线虫卵直接放置到培养板上（参见方案步骤6 &#34;卵母细胞制备&#34;).</li>
</ol>
5. 线虫分段与挑取
注意：&#34;分块转移&#34; 是 C. elegans 培养中常用的一种操作，指切割含有线虫的 NGM 琼脂平板部分，并将该片段转移至新平板，从而实现大量线虫的同步转移。此方法也可用于切除平板上的污染区域。在挑取线虫时，应保持琼脂表面完整，避免线虫落入琼脂上的孔洞中而丢失。此外，挑虫工具在接触平板前需充分冷却，以防止熔化琼脂或烫伤线虫。
<ol>
	<li>为了快速将大量线虫转移到新培养皿上，使用刮铲切割含有目标线虫的一小块NGM琼脂。取下切下的琼脂块，将其有菌面朝下放置在新培养皿上OP50菌苔边缘。</li>
	<li>使用线虫挑取工具单独转移线虫，具体操作如下文第8.2步&#34;生存实验&#34;所述。将线虫挑针的金属丝在火焰上灼烧至发红，然后从火焰中取出，静置数秒使其冷却。</li>
	<li>用挑针上的金属丝轻轻刮取新培养皿上OP50菌苔，使金属丝表面沾满菌液。</li>
	<li>金属丝尖端覆盖的黏稠菌液可使线虫附着于针尖，从而通过轻拂动作温和地挑起目标线虫。</li>
	<li>收集到目标线虫后，通过在琼脂表面轻轻划动沾有菌液的金属丝，将线虫转移至新培养皿。随后将金属丝再次插入火焰中，以清除挑针上残留的菌液。</li>
</ol>
6. 卵母细胞准备
<ol>
	<li>转移约20只成年动物（在20 °C培养条件下孵化后约2–3天），通过挑取或块状转移的方法，具体操作如方案步骤5所述。 &#34;分块与挑取线虫，&#34; 接种到含有50 µL大肠杆菌OP50菌株的培养板上。</li>
	<li>1-2天后，向平板中加入10 mL M9缓冲液以收集卵。使用玻璃刻度移液管轻轻旋转并搅动琼脂平板上的内容物，使粘附在OP50或成虫上的卵释放出来。收集含有卵和成虫的全部液体。</li>
	<li>将M9和OP50溶液转移至15 mL离心管中。在2,100 x g条件下离心15 mL离心管2分钟。</li>
	<li>吸出约 9 mL 上清液，注意不要扰动 OP50 沉淀。</li>
	<li>将沉淀重悬于2 mL无菌水、1 mL次氯酸钠溶液和1 mL 0.25 M NaOH中。</li>
	<li>轻轻颠倒混匀，直至大部分（约70%）成虫裂解；由于卵壳的存在，卵通常在此短暂的漂白处理过程中保持完整。将锥形管在990 × g下离心2分钟。</li>
	<li>吸弃上清液，勿扰动沉淀。用10 mL M9缓冲液重悬沉淀。</li>
	<li>将锥形管在990 × g下离心2分钟。吸除上清液，注意不要扰动沉淀。用200 µL M9缓冲液重悬沉淀。 
	注意：卵的制备可能需要多次尝试。如果卵暴露于次氯酸钠溶液时间过长，可能导致卵死亡。若卵未能孵化，可降低溶液中次氯酸钠的浓度，或缩短卵与次氯酸钠的接触时间。</li>
</ol>
7. 感染板的设置
<ol>
	<li>用无菌移液管向无菌试管中加入 3–5 mL YPD 培养基，并用无菌接种环接种一株白色念珠菌（Candida albicans）单菌落。
	<ol>
		<li>将试管置于旋转摇床中，在 30 °C 下培养约 16–18 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>标记两个 1.5 mL 微量离心管，分别用于盛装 C. albicans 和 OP50。记录每个空管的重量。
	<ol>
		<li>将 500 µL 过夜培养的 C. albicans 菌液加入标记为 C. albicans 的离心管中，将 1,500 µL 过夜培养的 OP50 菌液（来自步骤 3.1）加入标记为 OP50 的离心管中。</li>
		<li>在 16,100 × g 条件下离心 10 分钟，小心吸除上清液，避免扰动沉淀。</li>
		<li>用 500 µL 无菌水重悬每个沉淀，在 16,100 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>小心吸除上清液，避免扰动沉淀。记录微量离心管的最终重量。</li>
		<li>通过从最终重量中减去微量离心管的初始重量，计算每个沉淀的重量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用无菌水将 C. albicans 沉淀重悬至浓度为 10 mg/mL，将 OP50 沉淀重悬至浓度为 200 mg/mL。通过混合以下组分制备主感染混合液：10 µL 浓度为 50 mg/mL 的链霉素溶液、2.5 µL OP50 菌液、0.5 µL C. albicans 菌液以及 7 µL 无菌水。
	<ol>
		<li>对于对照组平板，用无菌水替代 C. albicans 菌液的体积，制备主对照混合液。使用微量移液器将 20 µL 感染混合液或 OP50 对照溶液接种至 NGM 平板中央。 
		注：分析时需要约 100 条线虫以确保统计学显著性。该实验通常设置三个重复。因此，需制备 3.2 倍体积的感染混合液和对照溶液。制备略高于 3 倍体积的混合液是为了确保每块平板均能准确接种完整的 20 µL，预留操作误差空间。之所以采用此主混合液方案，是因为线虫在早期幼虫阶段（L1–L3）咽部过小，无法摄取 C. albicans。若需暴露于氟康唑等药理学试剂（图 3B），可将试剂加入感染混合液中。试剂浓度需通过实验确定。例如，在 图 3B 中展示了 50 µM 氟康唑的处理结果，但同样使用该方案测试了 0、12.5、25、50 和 100 µM 氟康唑的不同浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 变形肛门区（Dar）表型分析与存活率检测
<ol>
	<li>观察Dar表型 
	注意：Dar表型在L3阶段及之后最为明显。Dar表现为线虫肛门后区域的一个微小突起（图2A），且随时间推移逐渐变得更加显著。
	<ol>
		<li>通过轻敲解剖显微镜载物台上的培养板快速确认动物是否具有Dar表型；无Dar的个体将立即向后移动，而具有Dar的个体则需要多次敲击才能反转运动方向，或完全无法反转。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生存实验
	<ol>
		<li>按照先前步骤6“&#34;卵的制备&#34;中所述方法完成卵的制备。在解剖镜下计数卵的数量，并用M9缓冲液稀释卵悬液，直至浓度达到每µL约含5–6个健康卵。使用移液器将20 µL含约30个卵的样品滴加到已准备好的NGM平板上，位置位于细菌培养区与平板边缘之间（卵和线虫食物OP50应分别置于两个不同位置）。</li>
		<li>将平板在20 °C下培养48小时。在解剖显微镜下统计每块平板上存活和死亡的成虫数量，以及具有Dar表型的线虫数量。记录具有Dar表型个体的百分比。</li>
		<li>若线虫在头部被铝丝轻触或轻敲培养板后无任何反应，则视为已死亡。</li>
		<li>每隔一天，按照步骤5“&#34;分块与挑取线虫&#34;所述方法，将剩余的成虫转移至新的感染组或对照组平板上。此时，可通过每日记录存活、死亡及丢失的线虫数量来进行生存分析。 
		注意：该实验可持续两周，从卵的制备开始。此外，卵悬液不应直接滴加在细菌培养区域，因为溶液中可能残留微量次氯酸钠，会杀死OP50细菌。同时，滴加位置应距离平板边缘约0.5 cm，以避免卵卡在培养皿壁与琼脂之间。此外，由于线虫繁殖迅速，将成虫转移到新平板至关重要，以便将其与其后代分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析生存数据
	<ol>
		<li>使用生存曲线分析软件分析结果（参见材料列表）。</li>
		<li>采用Gehan-Breslow-Wilcoxon法（假设早期生存时间的数据比后期更准确，据此对数据加权）以及Logrank统计工具比较生存曲线45。 
		注意：例如，在图4B-C中，经突变型C. albicans处理的线虫生存情况与同源野生型对照组或互补菌株处理组进行了比较。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们所描述的用于检测 C. elegans 在整个生命周期暴露于 C. albicans 时感染情况和存活率的方法，可经修改后用于测试其他病原体。其他细菌或真菌的液体培养物可采用类似方式制备，并饲喂给 C. elegans。此外，可通过连续感染的方式进行检测：首先按照所述方法使幼虫暴露于一种病原体，待其发育至成虫后，再将线虫转移至含有另一种病原体的新培养板上。
进行该实验时，需特别注意时间控制。首先，在制备卵以收获实验用卵的过程中，必须严格限制卵暴露于次氯酸钠溶液的时间。次氯酸钠溶液溶解成虫以释放卵所需的时间因情况而异。加入次氯酸钠溶液后，必须立即在解剖显微镜下密切观察线虫混合液。当约70%的成虫已解体时，应立即进行离心。若卵的制备未能获得可存活的卵，可降低次氯酸钠的浓度或缩短暴露时间。完成该实验时，还需注意根据需要及时将成虫转移至新的培养板，以避免实验对象与其子代混淆。实验开始时，将接种卵的数量控制在25至30个，也有助于防止此类情况发生。此外，频繁地将成虫转移至新培养板，还可降低线虫爬至培养皿边缘而死亡的风险。
<p...

C. elegans 作为强大的模式生物已被使用了五十多年。20世纪60年代，南非生物学家悉尼·布伦纳（Sydney Brenner）率先利用 C. elegans 研究神经元发育，为后续众多科学家在线虫中研究细胞和动物生物学的各个方面奠定了基础。这一研究谱系包括因RNA干扰（RNAi）研究而获得诺贝尔奖的克雷格·梅洛（Craig Mello）和安德鲁·法尔（Andrew Fire）1，因器官发育与细胞凋亡研究而获奖的罗伯特·霍维茨（Robert Horvitz）和约翰·苏尔斯顿（John Sulston）2,3,4，以及因绿色荧光蛋白研究而获奖的马丁·查尔菲（Martin Chalfie）5。尽管该模式生物传统上被用于分子和发育生物学研究，但在过去15年中，研究人员已开始利用 C. elegans 探讨多种人类病原体的生物学特性，包括 Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus、Salmonella enterica 和 Serratia marcescens6,7,8,9,10。这些研究表明，许多参与人类与病原体相互作用的机制在线虫中是保守的，但也存在一些仅在此模式生物中特有的免疫机制11,12。在自然环境中，C. elegans 会遭遇土壤中摄入性病原体的多种威胁，这促使它在肠道腔内进化并维持了一套复杂的先天免疫系统。参与肠道腔保护的许多基因和机制由高度保守的元件调控，而这些元件在高等哺乳动物中同样存在11,13。因此，C. elegans 是研究如 Salmonella enterica14、Shigella boydii15 或 Vibrio cholerae16 等胃肠道病原体的优良模型。
本文强调了秀丽隐杆线虫（C. elegans）作为研究感染性病原体（如白色念珠菌 C. albicans）的模式宿主所具备的显著多功能性。C. elegans作为模式宿主可用于高通量筛选毒力因子，相较于常用于研究念珠菌病的小鼠模型，该方法成本更低且耗时更短42。
本研究显示，该模型及相关生存分析可可靠地用于研究宿主先天免疫效应因子（对抵抗感染至关重要）、驱动毒力的病原体决定因子以及可干预发病过程的药理学化合物。与先前报道的检测方法不同，该方法能够研究动物从幼虫阶段到成虫阶段整个生命周期内对病原体的暴露情况，而不仅限于从成年到死亡阶段43,44。总之，我们的 C. elegans - C. albicans 模型是一种多功能且强大的工具，不仅可用于研究驱动感染与免疫的遗传基础，还可用于发现可用于治疗干预的新化合物。

<table><tbody><tr><td>琼脂（颗粒状，细菌学级）</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>20-248</td><td></td></tr><tr><td>铝丝（95% 铂，32 号规格）</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-1M32P</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Zeiss 倒置显微镜</td><td>Axiovision Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨（Bacto-Peptone）</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>秀丽隐杆线虫 Bli-3 品系</td><td>秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center）</td><td>Bli-3(e767) CB767</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP51-250</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇，Sigma 级，纯度不低于 99%</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>一次性培养管（20 x 150 mm）</td><td>FIsherBrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜（NI-150 高强度照明器）</td><td>Nikon Instrument Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌（E. coli）</td><td>秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center）</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism（生存曲线分析软件）</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤（Miller's 配方）</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>11-120</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Fisher Scientific</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>中等规格培养皿（35 × 10 mm）</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>白色念珠菌野生型 SC5314</td><td>ATCC</td><td>SC5314</td><td></td></tr><tr><td>野生型秀丽隐杆线虫（C. elegans）</td><td>秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center）</td><td>N2</td><td></td></tr></tbody></table>

秀丽隐杆线虫——一种多功能的模式生物 体内 研究宿主-微生物相互作用的模型

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

我们展示了一种利用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）作为模式宿主研究微生物相互作用的方法。微生物通过饮食摄入，使肠道成为疾病发生的主要部位。线虫肠道在结构和功能上均模拟了哺乳动物肠道，且具有透明性，便于通过显微镜观察其定植过程。本文中我们证明，病原体可导致宿主患病甚至死亡。我们能够鉴定出毒力发生改变的微生物突变体。由于其对生物胁迫具有保守的先天免疫反应，C. elegans 是研究宿主先天免疫相互作用机制的优良体系。我们展示，双氧化酶基因发生突变的宿主无法产生活性氧物质，因而不能抵抗微生物侵袭。我们进一步通过实验证明该生存分析方法的多功能性：它可用于研究抑制微生物生长的抑制剂的作用效果。该检测方法还可用于发现真菌毒力因子，作为开发新型抗真菌药物的靶点，同时也为深入揭示宿主-微生物相互作用提供了机会。本实验设计适用于高通量全基因组筛选，而线虫可冷冻保存以供后续使用的特性，使其成为一种经济高效且极具吸引力的完整动物模型。

致病性检测实验（图1）使用 C. albicans 和 秀丽隐杆线虫 此前已被我们实验室报道17,18 及其他实验室19,20我们展示了使用该方法的可行性 秀丽隐杆线虫 用于研究 C. albicans 毒力表明 C. albicans 细胞被线虫迅速摄取并在肠腔内积聚，导致运动减缓、肛门区域畸形（Dar）图2A），外阴肿胀（图 2B），肠管扩张（图3A），以及致死率（图3<...

本文中，我们介绍线虫Caenorhabditis elegans作为一种多功能的宿主模型，用于研究微生物相互作用。

我们展示了一种利用秀丽隐杆线虫作为模式宿主研究微生物相互作用的方法。微生物通过饮食途径引入，从而使……

本实验的总体目标是观察真菌感染对模式生物 C. Elegans 的影响。该方法有助于回答传染病领域中的一些关键机制性问题，例如病原体的毒力因子、宿主的免疫效应分子，以及药物发现。该技术的主要优势在于，它是一个实验上易于操作的系统，可从宿主和病原体两个角度研究宿主-病原体相互作用。这是一种快速、简便且成本效益高的系统。尽管该方法特别适用于研究真菌病原体，但也可应用于其他感染性病原体，例如细菌，甚至可用于研究多种微生物在活体宿主中的相互作用。制作线虫挑取针时，截取一段1.5厘米长的铝丝，然后将约0.5厘米长的铝丝小心插入巴斯德吸管的尖端。使用本生灯或酒精灯，将玻璃移液管尖端在火焰中缓慢旋转，直至玻璃熔化，使金属丝牢固地附着在移液管上，同时不破坏移液管尖端原有的形状。最后，使用镊子小心地将金属丝末端弯成一个小环。若需快速将大量线虫转移至新的培养板，可使用刮铲切割含有目标线虫的一小块NGM琼脂进行转移。然后移除切下的部分，将其倒置放在新培养皿中OP50菌斑的边缘。若需单独转移线虫，先将线虫挑取针的金属丝在火焰上灼烧至发红，随后从火焰中取出，静置冷却数秒钟。用该金属丝轻轻刮取新培养皿上生长的OP50菌斑，使菌液均匀覆盖挑针上的金属丝。黏稠的培养物覆盖在金属丝尖端，可使线虫黏附在凹槽的尖端。因此，使用轻扫动作可轻柔地挑取选定的线虫。待选定线虫收集完毕后，通过轻轻将培养物在琼脂表面扫过，将其转移至新的培养板上。然后将接种环放入火焰中，以烧除其上残留的培养物。取约20只成虫，通过单个挑取或小块转移的方式，将其转移至含有50微升大肠杆菌OP50菌株的培养板上。在1至2天后，向培养板中加入10毫升M9缓冲液，以收集卵。然后使用玻璃血清移液管轻轻搅动琼脂平板中的内容物，以释放粘附在OP50上的成虫或卵。收集含有卵和成虫的所有液体。将M9和OP50溶液转移至15毫升锥形管中。将离心管在2,100 × g条件下离心两分钟。然后吸取约九毫升上清液，注意不要扰动沉淀。接着，用两毫升无菌水、一毫升次氯酸钠溶液和一毫升0.25摩尔氢氧化钠溶液重悬沉淀。轻轻颠倒混匀，直至约70%的成虫裂解。由于卵壳的存在，短时间漂白处理通常不会破坏卵的完整性。此步骤中必须严格控制漂白剂的暴露时间。长时间暴露于漂白剂会破坏卵。如果卵的制备失败，可缩短漂白剂处理时间或稀释溶液。将锥形管在990 × g下离心2分钟。吸除上清液，注意不要扰动沉淀。然后用10毫升M9缓冲液重悬沉淀。再次离心后，在不扰动沉淀的情况下弃去上清液，加入200微升M9缓冲液重悬沉淀。向无菌试管中加入三到五毫升 YPD 培养基，并用无菌接种环接种一单个白色念珠菌菌落。将试管置于 30 摄氏度的旋转摇床中培养约 16 至 18 小时。标记一个 1.5 毫升微量离心管用于盛放 C.albicans，另一个用于盛放 OP50，并记录每个空管的重量。将500微升过夜培养的白色念珠菌（C.albicans）菌液转移至标记为C.Albicans的离心管中，将1500微升过夜培养的OP50菌液转移至标记为OP50的离心管中。在16,100 × g条件下离心10分钟，然后小心吸除上清液，避免扰动沉淀。使用 500 µL 无菌水重悬每个沉淀。然后以 16,100 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，注意不要扰动沉淀。然后记录微量离心管的最终重量。通过从最终重量中减去微量离心管的初始重量，确定每个沉淀物的重量。使用无菌水将白色念珠菌（C.albicans）沉淀物重悬至 10 毫克/毫升，将 OP50 沉淀物重悬至 20 毫克/毫升。然后通过混合以下成分制备主感染混合液：10 微升浓度为 50 毫克/毫升的链霉素溶液、2.5 微升 OP50 菌液、0.5 微升白色念珠菌（C. Albicans）菌液以及 7 微升无菌水。对于对照组平板，通过用无菌水替代白色念珠菌（C.albicans）培养物的体积来制备总混合液。然后使用微量移液器将20 µL感染混合液或OP50对照溶液接种到NGM平板的中心。按照本视频前面演示的方法制备卵后，在解剖显微镜下计数卵的数量。然后用M9稀释卵溶液，直至达到每微升约5到6个健康卵的浓度。使用移液器将含有约30个卵的20微升样品滴加到已准备好的NGM平板上，位置位于细菌培养区域与平板边缘之间的区域。将平板在20°C下孵育48小时。然后，在解剖显微镜下，统计每块培养板上存活和死亡的成虫线虫数量。若线虫在用铝丝轻触头部或轻敲培养板后无任何反应，则判定为死亡。同时统计具有滞育表型（Dar）的线虫数量，并通过快速轻敲解剖显微镜载物台上的培养板，确认该线虫是否确实表现为Dar表型。没有Dar的动物会立即向后移动，而具有Dar的动物则需要反复敲击才能使其改变方向，或者完全无法改变方向。每隔一天，通过挑取将剩余的成虫转移到新的感染板或对照板上。此时，如有需要，可通过每天记录存活、死亡和丢失的线虫数量来进行生存分析实验。至少应每隔一天转移一次线虫。这可以确保在此实验中被计数的成年线虫不会与其子代混淆。秀丽隐杆线虫（C.elegans）暴露于白色念珠菌（C.albicans）中持续六天，并观察其感染迹象、疾病进展及死亡情况。在生存实验的第四天，Dar表型最为明显，其特征是肛门区域突出，在未感染的线虫中则不可见。感染白色念珠菌（C.albicans）的线虫还表现出阴门区域肿胀。在这两种情况下，线虫一旦达到此阶段便无法清除感染。为了观察白色念珠菌在肠道腔内的定植情况，将表达红色荧光蛋白（RFP）标记的野生型白色念珠菌喂给线虫，使定植区域呈现红色荧光。在实验的第三天，白色念珠菌已定植于肠道腔内。如图所示，感染线虫的肠道扩张程度较未感染的对照组更为严重。在本实验中，检测了线虫对白色念珠菌无毒 efg1/efg1 cph1/cph1 双重突变株感染的存活能力。感染双重突变株的线虫存活时间显著长于对照组，表明这两个基因对于白色念珠菌对秀丽隐杆线虫的致病性是必需的。一旦掌握，该技术的每个步骤均可在蠕虫生命周期内的每一天耗时一到两个小时完成。在进行该操作时，重要的是要记住，实验中可能涉及感染性试剂，因此应采取适当的生物安全防护措施。可以对该基本实验流程进行一些小的修改，例如引入额外的微生物因子，以研究在活体宿主环境中微生物之间的相互作用。该技术建立后，为感染性疾病领域的研究人员探索微生物的致病性、宿主天然免疫反应的机制以及发现新型抗菌因子提供了重要途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何培养和操作秀丽隐杆线虫（C. elegans），并利用该模式生物在分子水平上研究宿主与微生物的相互作用。请注意，操作微生物病原体和化学试剂（如叠氮化钠）可能存在危险，应采取适当的防护措施，如使用个人防护装备（PPE）和规范的废物处理方法。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

线虫线虫线虫-一个多用途的体内模型研究宿主-微生物相互作用

基础 Caenorhabditis elegans 实验方法：同步化与观察

野生的Caenorhabditis线虫与多种微生物相关，这些微生物通常位于肠道腔内或感染肠道。本方案详细介绍了一种利用dauer幼虫角质层的抗性来富集定植于肠道中不可培养微生物的方法。...

选择性清洗野生 Caenorhabditis 线虫以富集肠道微生物组细菌

微孢子虫寄生虫Nematocida parisii感染Caenorhabditis...

研究微孢子虫感染的 Caenorhabditis elegans 模型中的遗传免疫

肠道微生物，包括胞外细菌以及奥尔赛病毒和微孢子虫（真菌）等胞内病原体，常与野生Caenorhabditis线虫相关。本文介绍了一种用于检测和定量定植和/或感染C.

RNA荧光 原位 杂交（FISH）技术用于可视化微生物定植与感染 秀丽隐杆线虫 肠道

本方案描述了一种在低温麻痹和表面漂白 以去除外部细菌后，对单个细菌定植的Caenorhabditis...

利用单条线虫数据量化异质性 秀丽隐杆线虫- 细菌相互作用

Caenorhabditis elegans 是生物学中的主要模式物种之一，然而几乎所有研究都是在缺乏其天然共生微生物的情况下进行的。本文所述方法将有助于增进我们对这些共生微生物多样性的理解，为未来开展功能性的 C. elegans...

模式线虫天然微生物群的分离与表征 秀丽隐杆线虫

堆肥微宇宙实验将自然界中存在的微生物多样性引入实验室，以促进对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

堆肥微宇宙作为微生物组研究中微生物多样性高且接近自然环境的实验体系 秀丽隐杆线虫

Caenorhabditis elegans 是研究驱动宿主-微生物组相互作用的分子决定因素的有力模型。我们提出了一种高通量分析流程，可在单个动物水平上同时表征肠道微生物组定植情况以及 C. elegans...

秀丽隐杆线虫肠道微生物组定量与分析的流式蠕虫检测技术应用

本文提供了有效使用SegElegans的详细说明。SegElegans是我们开发的一种深度学习系统，可用于对宽场显微镜图像中的单个线虫进行自动分割，进而用于ImageJ等图像分析软件。我们提供了该系统的在线和离线使用方法。...

自动化分析 秀丽隐杆线虫 使用 SegElegans 进行荧光成像

我们描述了一种可靠的基因替换策略，用于对黑粉菌 Ustilago maydis...

植物病原真菌 Ustilago maydis 的遗传操作以研究真菌生物学及植物-微生物相互作用

了解使用秀丽隐杆线虫研究宿主-微生物相互作用的方法，探索真菌感染对病原菌毒力和宿主免疫反应的影响。该实验系统快速、简便且经济高效，适用于感染性疾病研究和新药发现。

秀丽隐杆线虫——一种多功能的模式生物体内研究宿主-微生物相互作用的模型

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