线虫线虫线虫-一个多用途的体内模型研究宿主-微生物相互作用
2017年10月18日
在这里, 我们提出线虫线虫线虫作为一个多用途的寄主模型来研究微生物的相互作用。
该测定的总体目标是观察真菌感染对模式生物秀丽隐杆线虫的影响。该方法可以帮助回答传染病领域的关键机制问题，例如病原体毒力因子、宿主免疫效应子以及药物发现。该技术的主要优点是它是一个实验上易于处理的系统，可以从两个角度研究宿主-病原体相互作用。
这是一个快速、简单且具有成本效益的系统。虽然这种特殊方法可以深入了解真菌病原体，但它也可以应用于其他传染源，例如细菌甚至多种生物体，以研究活体宿主中的微生物相互作用。要进行蠕虫镐，请剪下一根 1.5 厘米的铝丝，然后小心地将大约 0.5 厘米的铝丝插入巴斯德移液管的尖端。
使用本生灯或酒精灯在火焰中缓慢旋转玻璃移液器吸头，使其熔化，直到金属丝牢固地粘附在移液器上，而不会影响移液器吸头的原始形状。最后，使用镊子小心地弯曲电线的末端，形成一个小环。为了将大量蠕虫快速转移到新板上，请使用刮刀切下一段含有所选蠕虫的 NGM 琼脂。
然后取出切下的一块，将其面朝下放在新板上 OP50 补丁的边缘。要单独转移蠕虫，请将蠕虫镐中的电线点燃至红色，然后将其从火焰中取出并冷却几秒钟。使用挑头上的金属丝，轻轻刮擦在新板上生长的 OP50 培养物的贴片，覆盖挑板上的金属丝。
覆盖在金属丝尖端的粘性培养物使蠕虫粘附在凹坑的尖端。因此，使用滑动动作轻轻拾取选定的蠕虫。收集到选定的蠕虫后，通过在琼脂上轻轻滑动培养物，将它们放在新盘子上。
然后将金属丝放入火焰中，以去除镐上残留的培养物。将大约 20 只成年动物采摘或分块放在装有 50 微升大肠杆菌菌株 OP50 的盘子上。要在一到两天后收集鸡蛋，请用 10 毫升 M9 缓冲液淹没板。
然后使用玻璃血清移液管旋转并轻轻搅动琼脂平板上的内容物，以释放粘附在 OP50 上的成年动物或鸡蛋。收集所有含有鸡蛋和成虫的液体。将 M9 和 OP50 溶液转移到 15 mL 锥形管中。
将试管以 2， 100 x g 离心 2 分钟。然后吸出大约 9 毫升的上清液，而不干扰沉淀。接下来，使用 2 毫升无菌水、1 毫升漂白剂和 1 毫升 0.25 摩尔氢氧化钠重悬沉淀。
倒置轻轻混匀，直到大约 70% 的成年动物出现裂解。通常，由于它们的外壳，鸡蛋在这种短暂的漂白处理中保持完整。在此步骤中限制漂白剂的暴露量至关重要。
长时间接触漂白剂会破坏鸡蛋。如果鸡蛋制备失败，请限制暴露于漂白剂的持续时间或稀释溶液。将锥形管以 990 x g 离心 2 分钟。
吸出上清液而不干扰沉淀。然后将沉淀重悬于 10 mL M9 缓冲液中。再次旋转并去除上清液而不干扰沉淀后，使用 200 μL M9 缓冲液重悬沉淀。
将3 到 5 毫升 YPD 分配到无菌试管中，并使用无菌定量环接种单个白色念珠菌菌落。将试管放在 30 摄氏度的转鼓上约 16 至 18 小时。标记一个 1.5 毫升微量离心管以含有白色念珠菌，另一个含有 OP50，然后记录每个空管的重量。
将 500 微升过夜的白色念珠菌培养物转移到标有白色念珠菌的试管中。并将 1500 μL 过夜 OP50 培养物放入标记为 OP50 的试管中。以 16， 100 x g 的离心力将试管离心 10 分钟，然后吸出上清液，而不会干扰沉淀。
使用 500 微升无菌水重悬每个沉淀。然后将试管以 16， 100 x g 的离心力离心 5 分钟。吸出上清液而不干扰沉淀。
然后记录微量离心管的最终重量。通过从最终重量中减去微量离心管的初始重量来确定每个颗粒的重量。使用无菌水，将白色念珠菌沉淀重悬至每毫升 10 毫克，将 OP50 沉淀重悬至每毫升 20 毫克。
然后混合 10 微升每毫升 50 毫克的链霉素溶液，制备主感染混合物。2.5 微升 OP50 培养物。0.5 微升白色念珠菌培养物和 7 微升无菌水。
对于对照板，通过用无菌水代替白色念珠菌培养物的体积来制备预混液。然后使用微量移液器将 20 微升感染混合物或 OP50 对照溶液接种到 NGM 板的中心。按照本视频前面演示的准备鸡蛋后，在解剖范围内对鸡蛋进行计数。
并使用 M9 稀释鸡蛋溶液，直到达到每微升约 5 至 6 个健康鸡蛋的浓度。使用移液管，将含有大约 30 个鸡蛋的 20 微升样品分配到准备好的 NGM 板上，位于细菌培养物和板侧面之间的区域。将板在 20 摄氏度下孵育 48 小时。
然后，在解剖显微镜下，计算每个板上活虫和死成虫的数量。如果动物对被铝丝敲击头部或敲击板没有反应，则认为动物死亡。还要用 Dar 计算蠕虫的数量，并通过快速敲击解剖显微镜载物台上的板来确认动物是否患有 Dar。
没有 Dar 的动物会立即向后移动，而有 Dar 的动物要么需要重复的敲击来反转方向，要么根本不这样做。每隔一天，通过将蠕虫捡到新的感染板或对照板上来转移任何剩余的成虫。此时，如果需要，通过跟踪每天活、死和缺失蠕虫的数量来进行生存测定。
至少每隔一天转移一次蠕虫很重要。这确保了在该测定中评分的成虫不会混淆其后代。秀丽隐杆线虫暴露于白色念珠菌 6 天内，观察感染、疾病进展和死亡的迹象。
Dar 表型在存活试验的第 4 天最明显，如在未感染动物中不可见的突出肛门区域所示。已知被白色念珠菌感染的蠕虫在外阴区域表现出肿胀。在这两种情况下，蠕虫在达到此阶段后都无法清除感染。
为了可视化白色念珠菌在肠腔中的定植，蠕虫被喂食标记有 RFP 的野生型白色念珠菌，这会导致定植区域发出红色荧光。白色念珠菌在测定的第 3 天定植于肠腔。如此处所示，感染的蠕虫表现出比未感染对照更严重的肠道膨胀。
在本实验中，测试了蠕虫在由毒性 C.Albicans efg1/efg1 cph1/cph1 双突变体引起的感染中存活的能力。感染双突变体的蠕虫的存活时间在统计学上显著长于对照。表明这两个基因是白色念珠菌对秀丽隐杆线虫毒力所必需的。
一旦掌握，这项技术的每个部分都可以在蠕虫生命周期的每天一到两个小时内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住，一个人可能正在使用传染性病原体。因此，应采取适当的生物安全预防措施。
可以对这个基本程序进行细微的修改，例如引入额外的微生物制剂，以研究活体宿主环境中的微生物相互作用。开发后，这项技术为传染病领域的研究人员探索微生物毒力、宿主先天免疫反应机制以及发现新型抗菌剂铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何维护和作秀丽隐杆线虫有一个很好的了解，并使用该生物体在分子水平上研究宿主微生物的相互作用。
不要忘记，使用微生物病原体和化学试剂（如叠氮化钠）可能很危险，应采用适当的安全预防措施，如 PPE 和废物处理方法。
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概述
本研究将秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）作为研究微生物相互作用的多功能宿主模型，特别关注真菌感染。该方法允许研究人员探索传染病中的关键机制问题，包括病原体毒力和宿主免疫反应。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物相互作用
- 传染病研究
- 宿主-病原体动力学
背景
- 秀丽隐杆线虫作为一种有效的模型生物。
- 该研究旨在了解真菌感染的影响。
- 该模型也可以适用于其他传染病原体。
- 它为实验提供了一种经济高效且易于处理的系统。
研究目的
- 观察真菌感染对秀丽隐杆线虫的影响。
- 研究病原体毒力因子。
- 探索宿主免疫效应因子和药物发现。
使用的方法
- 观察真菌感染影响的分析。
- 利用秀丽隐杆线虫作为宿主模型。
- 研究宿主-病原体相互作用的实验设置。
- 使用铝丝和移液器的蠕虫分选技术。
主要结果
- 对真菌病原体及其与宿主相互作用的洞见。
- 对感染的宿主免疫反应的理解。
- 药物发现的潜在应用。
- 研究各种传染病原体的框架。
结论
- 秀丽隐杆线虫是传染病研究的宝贵模型。
- 该方法可适用于研究多种病原体。
- 该方法增强了对宿主-病原体动力学的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Caenorhabditis elegans provides a scalable, cost-effective in vivo model for de-risking host-microbe interaction studies in early discovery. Its transparent anatomy and conserved innate immunity enable mechanistic interrogation of virulence factors and host defense pathways, supporting predictive confidence in target validation. This system bridges phenotypic screening and translational biomarker discovery for antifungal and antibacterial lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microbial virulence genes such as EFG1 and CPH1 in Candida albicans through survival assays.
- Operational Value: Supports high-throughput whole-genome screens to identify host or pathogen mutants with altered virulence.
- Strategic Value: Facilitates target de-risking by linking genetic perturbations to measurable survival phenotypes in a whole-animal context.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Permits quantification of pathogen colonization via fluorescent tagging (e.g., RFP-labeled C. albicans) in the intestinal lumen.
- Operational Value: Utilizes standardized survival readouts (live/dead scoring, Dar phenotype) for reproducible assay execution across 48-hour intervals.
- Strategic Value: Enables screening of chemical inhibitors or genetic libraries to discover antifungal compounds or virulence factors.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models conserved host innate immune responses, including dual oxidase-dependent reactive oxygen species production, relevant to mammalian mucosal defense.
- Operational Value: Cryopreservation capability ensures long-term strain availability, reducing variability and enabling longitudinal study designs.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by validating target essentiality in pathogen virulence before mammalian model investment.
Pipeline & Workflow Integration
The assay integrates into early discovery workflows by enabling phenotypic validation of targets identified through genomic or chemical screening, with direct applicability to lead identification campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of host-pathogen interactions via measurable outcomes such as survival kinetics and colonization imaging.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs including survival curves and fluorescence intensity for compound or genotype comparison.
- Analytics: Generates statistical endpoints (e.g., median survival, % Dar-positive worms) to enable hit prioritization and structure-activity relationship modeling.
- Translational Research: Connects to preclinical work through conserved immune pathways (e.g., ROS generation) that mirror mammalian epithelial defense mechanisms.
- Enterprise Reuse: Platform adaptability across bacterial, fungal, and polymicrobial infections supports reuse across multiple infectious disease programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in virulence and immunity studies through direct visualization of intestinal colonization and real-time survival tracking.
- Operational Value: Low cost, short generation time, and amenability to automation enhance throughput and reduce per-assay resource expenditure.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing orthogonal validation of targets in a physiologically relevant host context.
- Portfolio Impact: Enables early triage of antimicrobial leads by filtering compounds lacking efficacy in a whole-host infection model.
Implementation Considerations
- Expertise in C. elegans handling, microbial culture, and fluorescence microscopy is required for assay setup and scoring.
- Standardized NGM plate preparation, bacterial lawn seeding, and worm synchronization ensure reproducibility across runs.
- Biosafety containment (BSL-2) is necessary when working with pathogenic microbes such as C. albicans.
- Assay sensitivity may be limited by worm developmental stage and bacterial food source variability, requiring strict synchronization protocols.
- While applicable to multiple pathogens, optimization of infection conditions (e.g., inoculum, temperature) is needed for non-fungal agents.
