秀丽隐杆线虫——一种多功能的模式生物 体内 研究宿主-微生物相互作用的模型

本实验的总体目标是观察真菌感染对模式生物 C. Elegans 的影响。该方法有助于回答传染病领域中的一些关键机制性问题，例如病原体的毒力因子、宿主的免疫效应分子，以及药物发现。该技术的主要优势在于，它是一个实验上易于操作的系统，可从宿主和病原体两个角度研究宿主-病原体相互作用。

这是一种快速、简便且成本效益高的系统。尽管该方法特别适用于研究真菌病原体，但也可应用于其他感染性病原体，例如细菌，甚至可用于研究多种微生物在活体宿主中的相互作用。制作线虫挑取针时，截取一段1.5厘米长的铝丝，然后将约0.5厘米长的铝丝小心插入巴斯德吸管的尖端。

使用本生灯或酒精灯，将玻璃移液管尖端在火焰中缓慢旋转，直至玻璃熔化，使金属丝牢固地附着在移液管上，同时不破坏移液管尖端原有的形状。最后，使用镊子小心地将金属丝末端弯成一个小环。若需快速将大量线虫转移至新的培养板，可使用刮铲切割含有目标线虫的一小块NGM琼脂进行转移。

然后移除切下的部分，将其倒置放在新培养皿中OP50菌斑的边缘。若需单独转移线虫，先将线虫挑取针的金属丝在火焰上灼烧至发红，随后从火焰中取出，静置冷却数秒钟。用该金属丝轻轻刮取新培养皿上生长的OP50菌斑，使菌液均匀覆盖挑针上的金属丝。

黏稠的培养物覆盖在金属丝尖端，可使线虫黏附在凹槽的尖端。因此，使用轻扫动作可轻柔地挑取选定的线虫。待选定线虫收集完毕后，通过轻轻将培养物在琼脂表面扫过，将其转移至新的培养板上。

然后将接种环放入火焰中，以烧除其上残留的培养物。取约20只成虫，通过单个挑取或小块转移的方式，将其转移至含有50微升大肠杆菌OP50菌株的培养板上。在1至2天后，向培养板中加入10毫升M9缓冲液，以收集卵。

然后使用玻璃血清移液管轻轻搅动琼脂平板中的内容物，以释放粘附在OP50上的成虫或卵。收集含有卵和成虫的所有液体。将M9和OP50溶液转移至15毫升锥形管中。

将离心管在2,100 × g条件下离心两分钟。然后吸取约九毫升上清液，注意不要扰动沉淀。接着，用两毫升无菌水、一毫升次氯酸钠溶液和一毫升0.25摩尔氢氧化钠溶液重悬沉淀。

轻轻颠倒混匀，直至约70%的成虫裂解。由于卵壳的存在，短时间漂白处理通常不会破坏卵的完整性。此步骤中必须严格控制漂白剂的暴露时间。

长时间暴露于漂白剂会破坏卵。如果卵的制备失败，可缩短漂白剂处理时间或稀释溶液。将锥形管在990 × g下离心2分钟。

吸除上清液，注意不要扰动沉淀。然后用10毫升M9缓冲液重悬沉淀。再次离心后，在不扰动沉淀的情况下弃去上清液，加入200微升M9缓冲液重悬沉淀。

向无菌试管中加入三到五毫升 YPD 培养基，并用无菌接种环接种一单个白色念珠菌菌落。将试管置于 30 摄氏度的旋转摇床中培养约 16 至 18 小时。标记一个 1.5 毫升微量离心管用于盛放 C.albicans，另一个用于盛放 OP50，并记录每个空管的重量。

将500微升过夜培养的白色念珠菌（C.albicans）菌液转移至标记为C.Albicans的离心管中，将1500微升过夜培养的OP50菌液转移至标记为OP50的离心管中。在16,100 × g条件下离心10分钟，然后小心吸除上清液，避免扰动沉淀。

使用 500 µL 无菌水重悬每个沉淀。然后以 16,100 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，注意不要扰动沉淀。

然后记录微量离心管的最终重量。通过从最终重量中减去微量离心管的初始重量，确定每个沉淀物的重量。使用无菌水将白色念珠菌（C.albicans）沉淀物重悬至 10 毫克/毫升，将 OP50 沉淀物重悬至 20 毫克/毫升。

然后通过混合以下成分制备主感染混合液：10 微升浓度为 50 毫克/毫升的链霉素溶液、2.5 微升 OP50 菌液、0.5 微升白色念珠菌（C. Albicans）菌液以及 7 微升无菌水。

对于对照组平板，通过用无菌水替代白色念珠菌（C.albicans）培养物的体积来制备总混合液。然后使用微量移液器将20 µL感染混合液或OP50对照溶液接种到NGM平板的中心。按照本视频前面演示的方法制备卵后，在解剖显微镜下计数卵的数量。

然后用M9稀释卵溶液，直至达到每微升约5到6个健康卵的浓度。使用移液器将含有约30个卵的20微升样品滴加到已准备好的NGM平板上，位置位于细菌培养区域与平板边缘之间的区域。将平板在20°C下孵育48小时。

然后，在解剖显微镜下，统计每块培养板上存活和死亡的成虫线虫数量。若线虫在用铝丝轻触头部或轻敲培养板后无任何反应，则判定为死亡。同时统计具有滞育表型（Dar）的线虫数量，并通过快速轻敲解剖显微镜载物台上的培养板，确认该线虫是否确实表现为Dar表型。

没有Dar的动物会立即向后移动，而具有Dar的动物则需要反复敲击才能使其改变方向，或者完全无法改变方向。每隔一天，通过挑取将剩余的成虫转移到新的感染板或对照板上。此时，如有需要，可通过每天记录存活、死亡和丢失的线虫数量来进行生存分析实验。

至少应每隔一天转移一次线虫。这可以确保在此实验中被计数的成年线虫不会与其子代混淆。秀丽隐杆线虫（C.elegans）暴露于白色念珠菌（C.albicans）中持续六天，并观察其感染迹象、疾病进展及死亡情况。

在生存实验的第四天，Dar表型最为明显，其特征是肛门区域突出，在未感染的线虫中则不可见。感染白色念珠菌（C.albicans）的线虫还表现出阴门区域肿胀。在这两种情况下，线虫一旦达到此阶段便无法清除感染。

为了观察白色念珠菌在肠道腔内的定植情况，将表达红色荧光蛋白（RFP）标记的野生型白色念珠菌喂给线虫，使定植区域呈现红色荧光。在实验的第三天，白色念珠菌已定植于肠道腔内。如图所示，感染线虫的肠道扩张程度较未感染的对照组更为严重。

在本实验中，检测了线虫对白色念珠菌无毒 efg1/efg1 cph1/cph1 双重突变株感染的存活能力。感染双重突变株的线虫存活时间显著长于对照组，表明这两个基因对于白色念珠菌对秀丽隐杆线虫的致病性是必需的。

一旦掌握，该技术的每个步骤均可在蠕虫生命周期内的每一天耗时一到两个小时完成。在进行该操作时，重要的是要记住，实验中可能涉及感染性试剂，因此应采取适当的生物安全防护措施。

可以对该基本实验流程进行一些小的修改，例如引入额外的微生物因子，以研究在活体宿主环境中微生物之间的相互作用。该技术建立后，为感染性疾病领域的研究人员探索微生物的致病性、宿主天然免疫反应的机制以及发现新型抗菌因子提供了重要途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何培养和操作秀丽隐杆线虫（C. elegans），并利用该模式生物在分子水平上研究宿主与微生物的相互作用。

请注意，操作微生物病原体和化学试剂（如叠氮化钠）可能存在危险，应采取适当的防护措施，如使用个人防护装备（PPE）和规范的废物处理方法。