用于预防性传播感染的凝集素修饰纤维支架的制备与表征

本实验的总体目标是制备并进行表面修饰含有不同含量抗病毒蛋白Griffithsin的聚乳酸-乙醇酸共聚物静电纺丝纤维。该方法有助于解答药物递送领域中的关键问题，例如如何设计和表征新型递送载体，以预防性传播病毒性感染（如HIV-1）。该技术的主要优势在于，利用聚合物静电纺丝纤维作为固定支架，将Griffithsin高度定位于纤维表面，从而最大化其抗病毒活性。

由于Griffithsin对多种感染类型具有强大的预防和治疗潜力，该技术的应用前景可拓展至其他病毒性和细菌性感染的治疗。尽管该方法可为预防HIV-1感染提供见解，但也适用于Griffithsin已显示出有效性的其他体系，例如其他病毒性或细菌性感染。开始此操作时，称取720毫克50/50 PLGA，放入一个10毫升的闪烁瓶中。

使用血清学玻璃移液管，加入 3.0 毫升 HFIP。用塑料薄膜覆盖小瓶。然后，称量并记录小瓶的质量。

将聚合物悬浮液在 37 摄氏度下孵育过夜，以确保聚合物完全溶解。之后，按照文本方案中的说明准备静电纺丝装置。使用 3 毫升注射器吸取聚合物溶液。

接下来，将一个钝头18号0.5英寸针头连接到注射器上。排出多余溶液，以去除针头内的空隙。将注射器放置在注射泵上，并将仪器流速设定为2.0毫升每小时。

将电源连接到注射器针头。使用正27千伏的电压对聚合物溶液进行静电纺丝。待全部溶液完成静电纺丝后，关闭电源。

让纺锤再旋转30分钟，以完全蒸发溶剂。然后关闭旋转纺锤收集器。使用剃刀刀片，小心地将纤维从纺锤上剥离。

将静电纺丝制备的PLGA纤维收集到标记好的培养皿中。将培养皿置于干燥器中过夜，以去除任何残留溶剂。首先，按照文本方案中的说明配制PBS和MES溶液。

接下来，从冷冻柜中取出 EDC 和 NHS，静置使其平衡至室温。随后，将四毫克 EDC 称量至一个 1.5 毫升的微量离心管中。

将六毫克 NHS 称量至另一支微量离心管中。向每支管中加入一毫升 MES 缓冲液。剧烈涡旋振荡两支管，以确保试剂完全溶解。

然后，称取70毫克羟胺至一个50毫升锥形离心管中。加入20毫升磷酸盐缓冲液（PBS），并涡旋混匀。称取适量PLGA纤维至一个15毫升锥形离心管中。

向纤维中加入 8 毫升 MES 缓冲液。接着，加入 1 毫升 EDC 溶液和 1 毫升 NHS 溶液。使用塑料封口膜密封 15 毫升锥形离心管。

将离心管置于旋转仪上，在室温下轻轻翻转溶液15分钟。随后，加入14 µL β-巯基乙醇以终止反应。反复翻转离心管数次，确保充分混匀。

弃去上清液，每次用 10 毫升 PBS 洗涤 PLGA 纤维，共洗涤两次。根据文本方案，向试管中加入适量的 GRFT 储存液。然后加入足够的 PBS，使最终体积达到 8 毫升。

盖上管盖并倒置，以确保充分混匀。用塑料膜密封管口，将管子置于旋转仪上，轻轻翻转溶液两小时。

随后，加入 2 毫升配制好的羟胺溶液以终止反应，并涡旋振荡 30 秒。弃去上清液。用 10 毫升超纯水将表面修饰的 PLGA 纤维清洗两次，每次清洗均进行涡旋振荡。

接下来，将洗涤后的纤维转移至培养皿中。将培养皿置于干燥器内，直至纤维完全干燥。然后将培养皿储存在4°C条件下。

首先，准备三支1.5毫升的微量离心管。每管中称取2毫克纤维。然后，向每管中加入1毫升DMSO。

在室温下涡旋震荡一分钟，以完全溶解纤维。随后，用TE缓冲液将10微升等分试样至少稀释100倍。在负20摄氏度下保存，直至使用Eliza进行上样表征。

称取5至10毫克表面改性的纤维，转移至微量离心管中。记录每根离心管中纤维的质量。随后，向每根离心管中加入1毫升模拟各样品生理环境的溶液。

将样品置于旋转摇床中，在 200 RPM 及 37°C 条件下孵育 1 小时。随后，取出约 1 毫升含有解吸附 GRFT 的溶液，分装至离心管中。于 -20°C 保存，直至进行蛋白定量分析。

然后将样品转移至新的微量离心管中。加入一毫升新鲜缓冲液，并按照文本方案中所述的时间点进行孵育。本研究考察了制备PLGA电纺纤维的条件。

对空白、0.05 纳摩尔、0.5 纳摩尔和 5 纳摩尔 GRFT 纤维进行 SEM 分析表明，GRFT 修饰对纤维形态无影响。所有结构的平均直径均相似，约为 1.9 微米，证明了修饰后的制备工艺在不同批次间具有良好的一致性。随后测定静电纺丝纤维中偶联的 GRFT 含量。

5 纳摩尔修饰含有 373 纳克 GRFT，而 0.5 和 0.05 修饰分别含有 165 和 42 纳克。这表明，具有较高理论表面修饰密度的纤维会导致更多的 GRFT 与纤维结合。然而，最终的结合效率呈现出相反的相关性。

接下来，评估GRFT共价偶联到纤维上的量。在前四小时内，分别在5纳摩尔、0.5纳摩尔和0.05纳摩尔的理论修饰浓度下，每毫克静电纺丝纤维中检测到113纳克、25纳克和10纳克的GRFT。四小时后，三种配方的释放洗脱液中均未检测到明显的GRFT。

这些数据表明，大多数GRFT共价结合在电纺纤维上，而表面吸附的GRFT在最初四小时内即被释放。一旦掌握该技术，整个过程约需四天完成。制备聚合物纤维支架的电纺过程需要两天时间来配制聚合物溶液并进行电纺。

而表面改性、后续干燥及纤维表征至少需要额外两天时间。在进行该操作时，需注意保持试剂的适当比例，以确保最佳的改性效果。此外，还需确认电纺丝参数设置正确，以保证纤维形态的适宜性。

该技术问世后，为药物递送领域的研究人员提供了制备电纺纤维的新途径，这些纤维不仅能将抗病毒剂包载于内部，还可通过纤维表面共价连接活性分子。观看本视频后，您应能够充分掌握如何进行聚合物纤维的电纺制备、利用抗病毒蛋白Griffithsin对纤维表面进行修饰，以及定性分析Griffithsin与纤维的共轭结合情况。请注意，操作HFIP、β-巯基乙醇、EDC和NHS等试剂时具有极高的危险性。

进行此操作时，应始终采取适当的防护措施，例如正确使用个人防护装备（PPE）以及化学通风橱。