Name: Griffithsin 修饰纤维支架预防性传播感染的制备与表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: 了解Griffithsin修饰PLGA电纺纤维的制备与表征方法，用于预防HIV-1等性传播感染。该技术通过表面修饰最大化抗病毒蛋白活性，为药物递送系统提供新策略。

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我们感谢卓越犹太遗产基金对本研究的资助。感谢斯图尔特·威廉姆斯二世博士&#160;慷慨提供静电纺丝系统的使用。我们还要感谢肯尼斯·帕尔默博士为我们提供甘露糖结合蛋白Griffithsin。此外，我们感谢诺布尤基·松田博士及其实验室团队为我们提供了GRFT ELISA实验技术的培训。

1. 静电纺丝纤维支架的制备与构建
警告：所有涉及溶剂或聚合物溶液的操作均应在化学通风橱中进行。 开始实验前，请参阅每种试剂的材料安全数据表。
<ol>
	<li>为了电纺3 mL 15% w/w PLGA聚合物溶液，将720 mg的50:50聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA；0.55至0.75 dL/g，31-57 kDa）称量至一个10 mL闪烁瓶中。该溶液体积基于当前研究中常用的批次大小。 
	注意：加入给定体积溶剂中的聚合物质量必须首先通过确定用于溶解聚合物的溶剂密度来计算。溶剂六氟异丙醇（HFIP）的密度为1.59 g/mL。因此，基于所需3.0 mL HFIP的体积，溶剂的质量为4.8 g（3.0 mL × 1.59 g/mL）。对于PLGA与HFIP的15% w/w比例，需向3.0 mL HFIP中加入720 mg PLGA（0.15 × 4,800 mg = 720 mg）。使用% w/w聚合物/溶液而非% w/v的优势在于，这提供了最终溶液的明确定义质量。该明确定义的质量可在步骤1.3期间发生溶剂蒸发时，实现更准确的溶剂补充。</li>
	<li>使用血清学玻璃移液管向含有PLGA的玻璃闪烁瓶（来自步骤1.1）中加入3.0 mL HFIP。用塑料薄膜覆盖瓶口，然后测量并记录瓶的质量。</li>
	<li>将聚合物悬浮液在37 °C下孵育过夜，以确保聚合物完全溶解。如果任何溶剂蒸发导致瓶质量减少，则添加HFIP直至瓶恢复步骤1.2中的原始质量。</li>
	<li>孵育后，准备电纺装置（图2A）。尽管可使用任意尺寸的芯轴，此处使用了一个旋转的25 mm外径不锈钢芯轴作为收集器。 
	注意：在电纺溶液体积相同的情况下，较大的芯轴直径将减小纤维厚度。</li>
	<li>用3 mL注射器吸取聚合物溶液。</li>
	<li>将一个钝头18号、½英寸针头连接到注射器上，并排出过量溶液（通常为0.25 mL），以去除针头中的空腔。</li>
	<li>将注射器放置在注射泵上，并将仪器流速设置为2.0 mL/h。 
	注意：该流速已根据此配方的聚合物粘度预先优化。</li>
	<li>将电源连接至注射器针头，并使用+27 kV电压对聚合物溶液进行电纺。针头与收集器之间的距离应设置为约25 cm（图2B）。 
	警告：电纺过程会产生溶剂蒸气。应使用通风橱或封闭装置（图2）以去除有害蒸气。</li>
	<li>当整个溶液完成电纺后，关闭电源，并让芯轴继续旋转额外30分钟，以充分蒸发溶剂。</li>
	<li>关闭旋转芯轴收集器，并使用剃刀片将纤维从芯轴上切割下来。用刀片轻轻剥离芯轴上的纤维。</li>
	<li>将电纺的PLGA纤维收集到标记的培养皿中，并置于干燥器中过夜，以去除残留溶剂。</li>
</ol>
2. 使用 GRFT 对纤维进行表面修饰
<ol>
	<li>配制磷酸盐缓冲液（PBS）和2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES缓冲液）溶液。将8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4溶于1 L超纯水中，制备PBS。类似地，将19.52 g MES（游离酸，分子量195.2）和29.22 g NaCl溶于1 L超纯水中，制备MES缓冲液。使用pH计调节各溶液的最终pH值，分别确保PBS在7.2–7.5之间，MES缓冲液在5.0–6.0之间。</li>
	<li>分别配制EDC（2 mM）和NHS（5 mM）的工作溶液。
	<ol>
		<li>从冷冻柜中取出EDC和NHS，待其恢复至室温后再进行称量。</li>
		<li>将4 mg EDC称入一个1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>将6 mg NHS称入另一个1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>向每个管中加入1 mL MES缓冲液。剧烈涡旋振荡，确保试剂完全溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>称取70 mg羟胺，置于50 mL锥形离心管中，配制羟胺溶液。</li>
	<li>向羟胺中加入20 mL PBS，涡旋振荡至完全溶解。</li>
	<li>称取适量PLGA纤维，放入15 mL锥形离心管中。通常每个反应批次使用75 mg纤维。</li>
	<li>向15 mL离心管中加入8 mL MES缓冲液。</li>
	<li>向该管中分别加入1 mL之前配制的EDC和NHS溶液。最终溶液体积应为10 mL，EDC和NHS的终浓度分别为0.4 mg/mL和0.6 mg/mL。</li>
	<li>盖紧15 mL离心管并用塑料封口膜密封，置于旋转仪上，室温下轻轻翻转混合15分钟（图3B）。此步骤用于活化聚合物上的羧基，以便与GRFT蛋白发生共价修饰（图3A）。</li>
	<li>活化完成后，向管中加入14 µL β-巯基乙醇，小心淬灭反应。反复翻转离心管数次，确保充分混匀。 
	注意：β-巯基乙醇具有高毒性，仅可在化学通风橱中操作。</li>
	<li>弃去上清液，用10 mL PBS洗涤PLGA纤维两次，以去除残留的β-巯基乙醇。</li>
	<li>洗涤后，向管中加入适量GRFT储备液。例如，若目标为每毫克纤维负载5 nmol GRFT，则每毫克纤维需加入6.35 µL GRFT储备液（浓度为10 mg/mL）。因此，75 mg纤维样品需加入476.25 µL的10 mg/mL GRFT储备液。 
	注：已制备理论负载量分别为每毫克纤维0.05、0.5和5 nmol GRFT的GRFT修饰纤维。</li>
	<li>加入适量PBS，使最终体积达到8 mL，盖紧管盖并翻转混匀，确保充分混合。</li>
	<li>用塑料封口膜密封离心管，再次置于旋转仪上，此次反应时间为2小时。</li>
	<li>2小时孵育结束后，向15 mL离心管中加入2 mL羟胺溶液以淬灭反应。根据制造商说明，淬灭反应期间羟胺的终浓度应为0.7 mg/mL。</li>
	<li>充分混匀溶液后，弃去上清液。用10 mL超纯水洗涤表面修饰后的PLGA纤维两次，以去除未结合的GRFT。</li>
	<li>将纤维转移至培养皿中，放入干燥器内直至完全干燥。将培养皿转移至4 °C保存。</li>
</ol>
3. GRFT 表面修饰纤维的扫描电镜表征
<ol>
	<li>将双面导电胶带贴在扫描电镜样品台上。使用永久性记号笔在样品台底部标记样品的识别信息。</li>
	<li>从一根表面改性纤维上截取三个样品，并分别放置在不同的样品台上。每个样品的厚度约为 0.5 mm。</li>
	<li>利用金靶材进行溅射镀膜，通过电子诱导颗粒沉积在样品表面形成导电层。溅射条件为 2.4 kV 下持续 90 秒。 
	注意：溅射时间可能因设备参数（包括电压和电流）不同而有所调整。</li>
	<li>在 8 kV 电压下对样品成像，放大倍数范围为 1,000 至 5,000 倍。</li>
</ol>
4. 从表面修饰的纤维中提取GRFT
<ol>
	<li>取2 mg纤维样品，设三个重复，分别放入1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>向管中加入1 mL二甲基亚砜（DMSO），涡旋混匀，并在室温下孵育1分钟，使纤维完全溶解。</li>
	<li>孵育结束后，取步骤4.2中得到的DMSO-纤维溶液10 µL，用Tris-EDTA（TE）缓冲液（pH = 8.0）至少稀释100倍。</li>
	<li>将样品储存于-20 °C，待用ELISA进行载量表征时取出使用。</li>
</ol>
5. 测定GRFT从纤维上的解吸
<ol>
	<li>为评估纤维释放或解吸的GRFT量，称取5 - 10 mg表面修饰纤维并置于微量离心管中。记录每根管中纤维的质量。</li>
	<li>加入1 mL适当的模拟生理环境的溶液（例如PBS、TE缓冲液、模拟阴道液（SVF） 等等。) 加入每个样品中。</li>
	<li>在37 °C、200 rpm条件下，于旋转摇床中孵育样品1小时。</li>
	<li>孵育后，从离心管中取出约1 mL含有解吸GRFT的TE缓冲液，分装至簇管中，于-20 °C保存，待进行蛋白质定量。</li>
	<li>将样品转移至新的微量离心管中，向管内的纤维中加入1 mL新鲜缓冲液，并孵育至下一个时间点。</li>
	<li>常用的释放量测定时间点包括：1、2、4、6、8、24、48、72 小时和 1 周。在这些研究中，4 小时后观察到的解吸量可忽略不计。</li>
</ol>
6. 通过 ELISA 定量分析 GRFT 的提取与解吸
<ol>
	<li>按照先前所述方法，每孔加入 0.1 mL HA（10 µg/mL）包被 96 孔 ELISA 板51。用塑料膜密封后，于 4 °C 过夜孵育（图 4）。</li>
	<li>移除包被液，每孔加入 0.3 mL 封闭缓冲液（含 0.05% polysorbate 20 的 PBS 中加入 2–3% 牛血清白蛋白（BSA）），于室温孵育至少 2 小时。</li>
	<li>孵育后，用含 0.1% polysorbate 20 的 1×&#160;PBS（PBS-P）清洗 3 次。清洗后，向各孔分别加入 0.1 mL 样品、标准品或作为阴性对照的 PBS，于室温再孵育 1 小时。</li>
	<li>再次用 PBS-P 清洗 3 次。清洗后，每孔加入 0.1 mL 一抗（山羊抗 GRFT 抗血清），于室温孵育至少 1 小时。通常将一抗溶液用 PBS 稀释至 1:10,000。</li>
	<li>一抗孵育后，再次用 PBS-P 将板清洗 3 次。每孔加入 0.1 mL 二抗（辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗山羊 IgG），于室温孵育 1 小时。二抗溶液通常用 PBS 稀释至 1:10,000。</li>
	<li>洗涤 3 次后，每孔加入 0.1 mL TMB 2-过氧化物酶底物。观察显色情况（约 2 分钟），然后每孔加入 0.1 mL H2SO4（1 N）终止反应。使用酶标仪在 450 nm 波长读取吸光度。</li>
	<li>计算仅加入 PBS 的孔的背景 OD 值平均值，并从实验组中减去该值。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于具有多孔结构和较大的比表面积，电纺纤维（EFs）已在医疗健康领域获得多种应用，其中之一是作为治疗剂的递送载体。药物及其他活性物质可被包载于电纺纤维内部，实现可调控的释放；同时，生物分子和化学配体也可共价连接至纤维表面，以实现细胞特异性靶向52或生物传感53。本文描述了表面修饰凝集素GRFT的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）电纺纤维（GRFT-EFs）的制备方法，该纤维可作为预防HIV感染的递送支架。GRFT-EFs通过静电纺丝技术合成，相较于其他纤维制备方法，具有成本低、产量高的优势49,53。
实验方案中的关键步骤 
电纺纤维（EFs）的形成在很大程度上依赖于聚合物溶液的性质，特别是溶液或溶剂的黏度54。影响聚合物溶液黏度的因素包括聚合物的分子量、聚合物浓度以及所用溶剂的种...

将电纺纤维（EFs）用作局部递送平台有望显著降低性传播感染（STIs）的发生率。目前，全球有超过3600万人感染人类免疫缺陷病毒（HIV），仅2015年就报告了超过200万例新发病例1,2。此外，单纯疱疹病毒2型（HSV-2）感染影响着全球数亿人，并已被证明可使HIV感染风险增加2至5倍3。鉴于HSV-2感染与HIV易感性之间的关联，人们迫切希望开发出能够同时预防多种性传播感染的新活性成分。此外，开发新型递送载体以改善这些抗病毒药物的递送效果，有望进一步提高其防护和治疗效力。为此，研究人员已探索将电纺纤维（EFs）作为一种新型递送平台，以降低HIV-1和HSV-2感染的流行率。
在过去的二十年中，电纺丝纤维（EFs）已被广泛应用于药物递送和组织工程领域4。通常选择生物相容性聚合物，以便更顺利地转化为治疗应用。制备聚合物电纺丝纤维时，根据聚合物疏水性的不同，将其溶解于有机溶剂或水溶液中5。在电纺丝过程开始前，将目标活性物质加入该溶剂或水溶液中。随后将聚合物溶液吸入注射器，并在施加电场的情况下缓慢喷出。该过程通常形成具有片状或圆柱状宏观结构的聚合物纤维（图1），其纤维直径范围从微米级到纳米级不等6。在大多数治疗应用中，活性物质在电纺丝过程中被包埋于纤维内部，并通过扩散及纤维后续降解而释放。通过选用不同类型的聚合物或聚合物混合物，可调节降解或释放速率，从而实现理想的释放曲线，赋予纤维独特的化学和物理特性7，并促进几乎所有类型化合物的包封。因此，电纺丝纤维已被证实有利于小分子药物以及生物活性物质的递送，包括蛋白质、多肽、寡核苷酸和生长因子等6,8,9。
在性传播感染（STI）预防领域，电纺纤维（EFs）最近已被用于包载抗病毒药物，并实现药物的持续释放或可诱导释放10,11,12,13,14,15,16,17,18,19。在最早的研究之一中，研究人员开发了pH响应性纤维，可在女性生殖道（FRT）内环境变化时释放活性成分，从而实现按需防护HIV-1感染11。此后，其他研究探索了由聚环氧乙烷（PEO）和聚-L-乳酸（PLLA）组成的聚合物共混体系，以评估抗病毒药物和避孕药物在体外条件下可调控的释放性能，用于HIV-1预防与避孕in vitro12。另有研究已证实电纺纤维具备以下可行性：小分子抗病毒药物的长效释放14、优异且柔韧的机械性能20、三维递送结构21、抑制精子穿透能力12，以及与其他递送技术整合的能力13。最后，既往研究还评估了聚合物纤维对常见共感染病毒（如HSV-2和HIV-1）抗病毒药物的持续递送效果14。在该研究中，聚合物纤维通过在长达一个月的时间内保持其结构完整性，并形成阻止病毒进入的物理屏障，从而在抗病毒递送之外提供了辅助作用。根据这些结果可知，电纺纤维可能通过物理和化学双重机制抑制病毒感染。
尽管可调控的释放特性使聚合物电纺丝纤维（EFs）成为微生物杀灭剂递送的有吸引力的递送平台，但EFs也已在其他应用中被开发为表面改性的支架7。EFs已被用于模拟细胞外基质（ECM）的形态，常作为支架以促进细胞再生22，并增强其在组织工程中的应用价值23,24。由聚-ε-己内酯（PCL）和聚-L-乳酸（PLLA）等聚合物构成的纤维在电纺丝后可通过表面修饰生长因子和蛋白质，赋予其类似ECM的特性，包括增强细胞黏附和增殖能力25,26。此外，具有抗菌功能的表面改性EFs也已被评估，用于抑制特定致病菌的生长27,28。由于其多功能性以及诱导生物学效应的能力，EF技术正持续拓展至多个领域，实现多机制功能。然而，尽管表面改性纤维在多种应用中具有实用性，其在微生物杀灭剂领域的探索却仅始于近期29。
在开发用于预防和治疗性传播感染（STIs）的新型递送技术的同时，新型生物治疗剂也已相继问世。其中最有前景的候选微杀剂之一是具有黏附性的抗病毒凝集素GRFT30。GRFT最初来源于一种红藻，已被证实可有效抑制HIV、HSV-2、SARS以及丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus）31,32,33,34,35,36。事实上，在所有基于生物来源的抑制剂中，GRFT表现出最强的抗HIV活性，几乎在接触后立即灭活HIV-130，并在阴道微生物培养基中保持长达10天的稳定性和活性37。最近研究显示，0.1% GRFT凝胶可保护小鼠免受阴道内HSV-2攻击，使其成为预防HSV-2和HIV-1感染的首选候选制剂之一32,38。针对HIV，GRFT通过直接结合病毒包膜表面的gp120或末端甘露糖N-连接聚糖残基，从而在物理上阻断病毒进入细胞38,39,40,41,42。该抑制作用极为高效，其IC50值接近3 ng/mL43。除抑制HIV感染外，研究还表明GRFT可通过抑制HSV-2病毒的细胞间传播来提供保护作用32。在所有情况下，GRFT均表现出对病毒颗粒的强黏附性，同时具有高度抗变性能力。最后，GRFT与替诺福韦（Tenofovir, TFV）及其他抗病毒药物联用时表现出协同效应44，因此与EF技术联合给药具有可行性且可能更具优势。GRFT强大的生物学特性使其成为一种极具潜力的生物来源抗病毒候选分子，而EF技术有望进一步增强其递送效果。
基于对凝集素GRFT的黏附性和固有抗病毒特性的了解，我们设计了一种聚合物纤维支架，整合这些特性以实现对病毒入侵的第一道屏障抑制作用29。受宫颈阴道黏液主要通过黏蛋白的黏附作用阻碍病毒传播机制的启发，我们提出假设：若以电纺纤维（EFs）作为支架，并在其表面共价修饰GRFT，则高密度的表面结合GRFT可在病毒入侵的初始位置使其失活并丧失感染能力45,46,47。本研究中，EFs被开发为一种固定的支架结构，用以构建基于蛋白质的病毒黏附-失活屏障平台。我们旨在将GRFT强大的抗病毒活性与一种生物相容性好、可修饰且耐用的聚合物平台相结合，从而构建一种新型的病毒&#34;捕获装置&#34;。
为实现这些目标，采用静电纺丝技术制备了由PLGA组成的纤维，并利用EDC-NHS化学方法随后在EF表面修饰GRFT。PLGA被用作模型聚合物，因其在静电纺丝中被广泛使用48，同时具备良好的生物相容性和成本效益。此外，表面修饰可利用EFs的巨大表面积，提供一种有用的方法，可与包埋技术结合使用，以最大化纤维的效用49。与传统包埋方法相比（在传统方法中仅有部分GRFT可用，且在女性生殖道中仅短暂存在），表面修饰可能使GRFT在整个治疗期间保持最大生物活性。此外，通过传统的静电纺丝方法引入亲水性化合物（如蛋白质）可能导致包封效率降低以及蛋白质活性丧失50。因此，经GRFT表面修饰的纤维可能提供一种有前景的递送方法，既可单独使用，也可与静电纺丝技术联合使用，以增强对性传播感染的防护作用。

<table><tbody><tr><td>聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）50:50</td><td>Lactel</td><td>B6013-2P</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>147541000</td><td></td></tr><tr><td>钝头分液针 18g × 1/2</td><td>Brico Medical Supplies</td><td>BN1815</td><td></td></tr><tr><td>BD 3 mL 注射器 鲁尔锁头</td><td>VWR</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm（塑料膜）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES缓冲液）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3671&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>羟基琥珀酰亚胺（NHS）</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Fisher</td><td>BP176</td><td></td></tr><tr><td>裂殖藻素（GRFT）</td><td>Kentucky Bioprocessing</td><td>NA</td><td>定制生产，无产品编号</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Milipore</td><td>317275</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇失水山梨醇单月桂酸酯（吐温20）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris EDTA缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>平底免疫非无菌96孔板</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>3355</td><td></td></tr><tr><td>流感病毒血凝素（HA）</td><td>Kentucky Bioprocessing</td><td>NA</td><td>定制生产，无产品编号</td></tr><tr><td>山羊抗GRFT一抗</td><td>Kentucky Bioprocessing</td><td>NA</td><td>定制生产，无产品编号</td></tr><tr><td>兔抗山羊IgG-HRP二抗</td><td>Santa Cruz</td><td>2056</td><td></td></tr><tr><td>Sure Blue TMB微孔过氧化物酶底物</td><td>KPL</td><td>52-00-00</td><td></td></tr></tbody></table>

用于预防性传播感染的凝集素修饰纤维支架的制备与表征

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

静电纺丝纤维（EFs）已广泛应用于多种治疗领域，但将其用于预防和治疗性传播感染（STIs）的技术尚属新兴。此外，目前许多静电纺丝技术主要关注将活性成分包封于纤维内部，而非利用纤维表面赋予其生物功能特性。本文介绍一种制备并进行表面修饰聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）静电纺丝纤维的方法，使其表面负载强效抗病毒凝集素——Griffithsin（GRFT）。PLGA 是一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的聚合物，因其优异的化学稳定性和生物相容性，已被广泛应用于药物递送系统。GRFT 是一种天然、高效且安全的凝集素，对包括1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）在内的多种病毒具有广谱抑制活性。研究表明，经 GRFT 修饰的纤维可有效灭活 HIV-1。 体外本文描述了制备和表征GRFT修饰电纺纤维（EFs）的方法。首先，采用静电纺丝技术制备聚（乳酸-羟基乙酸共聚物）（PLGA）纤维支架。随后，利用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）化学法对纤维表面进行GRFT修饰。采用扫描电子显微镜（SEM）评估表面修饰后纤维的尺寸与形貌。此外，可使用基于gp120或血凝素（HA）的酶联免疫吸附试验（ELISA）定量测定结合至纤维表面的GRFT含量及其从表面的解吸附情况。该方案可广泛应用于制备多种不同蛋白质表面修饰的纤维材料。

关键词：电纺纤维，PLGA，GRFT，表面修饰，EDC/NHS化学法，扫描电子显微镜，ELISA，gp120，血凝素，蛋白质固定化

纤维形态对表面修饰的电纺纤维（EFs）抵抗病毒的能力具有显著影响。尽管静电纺丝是一种简便直接的方法，但未经优化的聚合物配方可能导致纤维形态不规则（图5B-C）。静电纺丝条件的改变若导致串珠状或无定形膜状结构的形成，通常是由溶剂与聚合物不相容、聚合物黏度低、流速或其他静电纺丝参数不当所致。纤维结构的这些变化可能导致载药纤维的药物释放曲线不同，或影响偶联效率的一致性，从而改变纤维在物理或化学上阻碍病毒穿透的能力。采用所述静电纺丝条件制备的PLGA电纺纤维应具有清晰可辨的纤维形态，直径范围在1.5至2.8 µm之间（图6）。为确定纤维形态及直径，应在进行其他表征或修饰步骤之前，使用扫描电子显微镜（SEM）对电纺纤维进行观察。
空白、0.05、0.5 和 5 nmol GRFT 纤维的扫描电镜图像显示，纤维形...

本文描述了一种制备和表征Griffithsin修饰的聚乳酸-羟基乙酸电纺纤维的方法，该纤维对1型人类免疫缺陷病毒感染具有强效的黏附性和抗病毒活性 体外描述了用于合成、表面修饰以及表征经表面修饰纤维上Griffithsin的形态、偶联和解吸附的方法。

静电纺丝纤维（EFs）已广泛应用于多种治疗领域；然而，将其作为一种技术应用还只是最近才开始……

本实验的总体目标是制备并进行表面修饰含有不同含量抗病毒蛋白Griffithsin的聚乳酸-乙醇酸共聚物静电纺丝纤维。该方法有助于解答药物递送领域中的关键问题，例如如何设计和表征新型递送载体，以预防性传播病毒性感染（如HIV-1）。该技术的主要优势在于，利用聚合物静电纺丝纤维作为固定支架，将Griffithsin高度定位于纤维表面，从而最大化其抗病毒活性。由于Griffithsin对多种感染类型具有强大的预防和治疗潜力，该技术的应用前景可拓展至其他病毒性和细菌性感染的治疗。尽管该方法可为预防HIV-1感染提供见解，但也适用于Griffithsin已显示出有效性的其他体系，例如其他病毒性或细菌性感染。开始此操作时，称取720毫克50/50 PLGA，放入一个10毫升的闪烁瓶中。使用血清学玻璃移液管，加入 3.0 毫升 HFIP。用塑料薄膜覆盖小瓶。然后，称量并记录小瓶的质量。将聚合物悬浮液在 37 摄氏度下孵育过夜，以确保聚合物完全溶解。之后，按照文本方案中的说明准备静电纺丝装置。使用 3 毫升注射器吸取聚合物溶液。接下来，将一个钝头18号0.5英寸针头连接到注射器上。排出多余溶液，以去除针头内的空隙。将注射器放置在注射泵上，并将仪器流速设定为2.0毫升每小时。将电源连接到注射器针头。使用正27千伏的电压对聚合物溶液进行静电纺丝。待全部溶液完成静电纺丝后，关闭电源。让纺锤再旋转30分钟，以完全蒸发溶剂。然后关闭旋转纺锤收集器。使用剃刀刀片，小心地将纤维从纺锤上剥离。将静电纺丝制备的PLGA纤维收集到标记好的培养皿中。将培养皿置于干燥器中过夜，以去除任何残留溶剂。首先，按照文本方案中的说明配制PBS和MES溶液。接下来，从冷冻柜中取出 EDC 和 NHS，静置使其平衡至室温。随后，将四毫克 EDC 称量至一个 1.5 毫升的微量离心管中。将六毫克 NHS 称量至另一支微量离心管中。向每支管中加入一毫升 MES 缓冲液。剧烈涡旋振荡两支管，以确保试剂完全溶解。然后，称取70毫克羟胺至一个50毫升锥形离心管中。加入20毫升磷酸盐缓冲液（PBS），并涡旋混匀。称取适量PLGA纤维至一个15毫升锥形离心管中。向纤维中加入 8 毫升 MES 缓冲液。接着，加入 1 毫升 EDC 溶液和 1 毫升 NHS 溶液。使用塑料封口膜密封 15 毫升锥形离心管。将离心管置于旋转仪上，在室温下轻轻翻转溶液15分钟。随后，加入14 µL β-巯基乙醇以终止反应。反复翻转离心管数次，确保充分混匀。弃去上清液，每次用 10 毫升 PBS 洗涤 PLGA 纤维，共洗涤两次。根据文本方案，向试管中加入适量的 GRFT 储存液。然后加入足够的 PBS，使最终体积达到 8 毫升。盖上管盖并倒置，以确保充分混匀。用塑料膜密封管口，将管子置于旋转仪上，轻轻翻转溶液两小时。随后，加入 2 毫升配制好的羟胺溶液以终止反应，并涡旋振荡 30 秒。弃去上清液。用 10 毫升超纯水将表面修饰的 PLGA 纤维清洗两次，每次清洗均进行涡旋振荡。接下来，将洗涤后的纤维转移至培养皿中。将培养皿置于干燥器内，直至纤维完全干燥。然后将培养皿储存在4°C条件下。首先，准备三支1.5毫升的微量离心管。每管中称取2毫克纤维。然后，向每管中加入1毫升DMSO。在室温下涡旋震荡一分钟，以完全溶解纤维。随后，用TE缓冲液将10微升等分试样至少稀释100倍。在负20摄氏度下保存，直至使用Eliza进行上样表征。称取5至10毫克表面改性的纤维，转移至微量离心管中。记录每根离心管中纤维的质量。随后，向每根离心管中加入1毫升模拟各样品生理环境的溶液。将样品置于旋转摇床中，在 200 RPM 及 37°C 条件下孵育 1 小时。随后，取出约 1 毫升含有解吸附 GRFT 的溶液，分装至离心管中。于 -20°C 保存，直至进行蛋白定量分析。 然后将样品转移至新的微量离心管中。加入一毫升新鲜缓冲液，并按照文本方案中所述的时间点进行孵育。本研究考察了制备PLGA电纺纤维的条件。对空白、0.05 纳摩尔、0.5 纳摩尔和 5 纳摩尔 GRFT 纤维进行 SEM 分析表明，GRFT 修饰对纤维形态无影响。所有结构的平均直径均相似，约为 1.9 微米，证明了修饰后的制备工艺在不同批次间具有良好的一致性。随后测定静电纺丝纤维中偶联的 GRFT 含量。5 纳摩尔修饰含有 373 纳克 GRFT，而 0.5 和 0.05 修饰分别含有 165 和 42 纳克。这表明，具有较高理论表面修饰密度的纤维会导致更多的 GRFT 与纤维结合。然而，最终的结合效率呈现出相反的相关性。接下来，评估GRFT共价偶联到纤维上的量。在前四小时内，分别在5纳摩尔、0.5纳摩尔和0.05纳摩尔的理论修饰浓度下，每毫克静电纺丝纤维中检测到113纳克、25纳克和10纳克的GRFT。四小时后，三种配方的释放洗脱液中均未检测到明显的GRFT。这些数据表明，大多数GRFT共价结合在电纺纤维上，而表面吸附的GRFT在最初四小时内即被释放。一旦掌握该技术，整个过程约需四天完成。制备聚合物纤维支架的电纺过程需要两天时间来配制聚合物溶液并进行电纺。而表面改性、后续干燥及纤维表征至少需要额外两天时间。在进行该操作时，需注意保持试剂的适当比例，以确保最佳的改性效果。此外，还需确认电纺丝参数设置正确，以保证纤维形态的适宜性。该技术问世后，为药物递送领域的研究人员提供了制备电纺纤维的新途径，这些纤维不仅能将抗病毒剂包载于内部，还可通过纤维表面共价连接活性分子。观看本视频后，您应能够充分掌握如何进行聚合物纤维的电纺制备、利用抗病毒蛋白Griffithsin对纤维表面进行修饰，以及定性分析Griffithsin与纤维的共轭结合情况。请注意，操作HFIP、β-巯基乙醇、EDC和NHS等试剂时具有极高的危险性。进行此操作时，应始终采取适当的防护措施，例如正确使用个人防护装备（PPE）以及化学通风橱。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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