Name: 从果蝇幼虫神经肌肉交界处的突触电流的焦 Macropatch 记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: 学习使用焦斑宏膜片钳技术记录果蝇幼虫神经肌肉接头突触电流的方法。该技术可监测单个突触小体的神经活动，研究突触蛋白突变对突触传递的影响，为神经科学和遗传学研究提供重要工具。

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由美国国立卫生研究院资助项目 R01 MH 099557 支持

1. 记录电极的制备
<ol>
	<li>拉制玻璃电极
	<ol>
		<li>使用以下程序设置微电极拉制仪（参见材料表）：
		<ol>
			<li>第1行：加热510，拉制速度30，时间250；第2行：加热490，拉制速度30，时间250。 
			注：时间单位对应每单位0.5 ms，其他单位为相对值。每次更换灯丝后，应通过斜率测试调整加热值。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用显微镜（35倍放大）检查拉制后电极的内径，确保其在7 - 10 µm范围内（图1A）。将毛细管储存在密封容器中，防止灰尘积聚。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>火焰抛光
	<ol>
		<li>使用微加工仪（参见材料表），以最大加热值的80 - 90%对毛细管进行火焰抛光（持续1 - 2秒）。确保抛光后电极的最终内径为5 µm（图1A）27。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>弯曲电极 
	注：需进行两次弯曲，以便在高倍物镜下将电极定位至肌肉上方。
	<ol>
		<li>使用图1B所示装置。将电极固定在操纵器上，并将尖端置于灯丝上方，但不接触灯丝。</li>
		<li>将加热值设为最大值的60 - 70%，踩下微加工仪踏板加热1 - 2秒（参见材料表），使灯丝发热。使用L形针轻轻下拉电极尖端（见图1B放大图），形成约90o的弯曲（图1C）。</li>
		<li>用镊子夹住电极，手动将其置于喷灯火焰上，在距离第一弯7 - 10 mm处进行第二次弯曲，弯曲角度约为120o（图1C）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="毛细管制备、显微镜设置、玻璃操作；实验流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1. 微电极制备的最后步骤。 （A）拉制并火焰抛光后的电极尖端。 （B.1）尖端弯曲的装置设置。 （B.2）右侧为框选区域的放大图。电极与灯丝固定，使电极尖端位于金属丝上方稍高处，且不与之接触。 （C.1）记录电极。 （C.2）右侧为框选区域的放大图。第一个弯折处的角度约为 90°，第一个弯折处与电极尖端之间的距离约为 1 mm。比例尺 = 3 mm。 <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 额外的准备步骤
<ol>
	<li>配制类似血淋巴（HL3）溶液（单位：mM）：70 NaCl，5 KCl，20 MgCl₂，10 NaHCO₃，5 TES，115 sucrose，5 trehalose，0.1 CaCl₂；用 NaOH 调节 pH 至 7.2。2，10 NaHCO₃3，5 蔗糖，115 蔗糖，5 HEPES 和 1 mM CaCl2；调节pH至7.3 - 7.4。将溶液保存在冰箱中，并每周新鲜配制。</li>
	<li>制作刺激电极的方法与制作记录用玻璃电极相同，但无需将其弯曲。 
	注意：刺激电极的制备在文中已有详细描述 28 和 27经火焰抛光后的最终直径应在 5 - 7 µm.</li>
	<li>将刺激移液管插入连接至注射器的微电极夹持器中。</li>
	<li>使用涂有硅橡胶环氧树脂的小型培养皿（35 × 10 mm）制作解剖板（参见 材料表如所述 28. 
	注意：硅橡胶在使用前应完全固化。</li>
	<li>选取一只游走期三龄幼虫，按所述方法进行解剖27,28,29,30. 
	注意：为了可视化突触小结，使用果蝇品系 CD8-GFP（参见 材料表)
	<ol>
		<li>使用镊子（参见 材料表），挑选3个rd 从试剂瓶中取出龄期幼虫。</li>
		<li>将幼虫固定，第一枚针置于后部，另一枚针置于前部（靠近口钩处）。</li>
		<li>加入 HL3 溶液。</li>
		<li>使用弹簧剪进行切割（参见 材料表从幼虫背部的顶端钩针一直到底端钩针。</li>
		<li>将幼虫肌片固定，于幼虫左右两侧各放置两枚固定针。</li>
		<li>用镊子去除内脏和气管。</li>
		<li>使用弹簧剪在腹神经索外侧切断神经。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. EJCs 的电生理记录
<img alt="用于光谱学光学激发的显微镜装置；包括载物台、透镜和有线控制装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2. 记录装置示意图。 样本神经肌肉接头（NMJ）被固定在涂有硅的培养皿中（箭头所示），置于配备落射荧光装置、高倍物镜和两个显微操作器的正置复合显微镜的可移动载物台上。显微镜放置在防震台上。 <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>记录
	<ol>
		<li>将含有标本的培养皿放置在显微镜载物台上（图2）。将参考电极插入浴液中。</li>
		<li>用HL3溶液填充记录电极。在10倍物镜下（见材料表），将电极浸入浴液，并使用显微操作器（见材料表）将其置于第2、3或4腹节的肌肉6和7上方（图3 A.1 和 A.2）。</li>
		<li>切换至60倍物镜（见材料表）。使用落射荧光或微分干涉（DIC）光学系统对目标区域进行聚焦。将电极尖端置于突触小结顶部（图3 B.1-3）。</li>
		<li>将电极极其轻柔地压向肌肉表面。过度施压可能损伤神经肌肉接头（NMJ）或引起自发性突触活动增加。确保电极尖端未被堵塞——若已堵塞，应予以更换。</li>
		<li>打开放大器、A/D转换板和计算机。</li>
		<li>在放大器上选择电压钳模式。</li>
		<li>启动数据采集软件，并选择“无间隙”（gap-free）记录模式。</li>
		<li>在计算机屏幕上观察微型终板电流（mEJCs）的出现。</li>
		<li>确保mEJCs的幅度在0.2 - 0.7 nA范围内。 
		注意：较小的终板电流提示记录电极存在缺陷或位置不当。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="神经组织中的电极插入；光学与显微成像；实验装置与结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. 突触小体的可视化。 （A）在10倍放大倍率下观察到的半节段明场图像（A.1），以及框选区域的放大图，显示肌肉6和7（A.2，箭头标记记录电极）。比例尺 = 50 µm。（B）在携带遗传编码神经元标记物（CD8-GFP）的果蝇（Drosophila）品系中，通过落射荧光成像（B.1）或微分干涉差（DIC）光学（B.2）可视化突触小体。图像使用60倍物镜及GFP成像滤光立方体拍摄（参见材料表）。突触小体以箭头标示，荧光与DIC图像的叠加图显示在B.3中。比例尺 = 10 µm。 <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>刺激
	<ol>
		<li>使用显微操作器，在视觉控制下，将刺激电极放置在支配腹部第2至第4节段的轴突附近。</li>
		<li>通过拉动连接至电极夹持器的注射器活塞施加负压，使轴突被吸入电极内部（图2）。</li>
		<li>打开刺激器。调节隔离单元（见材料表）上的旋钮，将电流设为零，然后缓慢增加电流，直至出现EJCs（或达到阈值）。</li>
		<li>以高于阈值的刺激强度进行刺激，刺激电流约为EJCs观察阈值电流的两倍。 
		注意：根据我们的经验，该刺激强度最适宜避免动作电位失败或动作电位发放。例如，若EJCs在0.2 mA的刺激电流下出现，则在整个实验过程中使用0.4 mA的电流。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封接电阻
	<ol>
		<li>将放大器的电极电阻开关切换至“封接测试”位置，测量记录用大电极的封接电阻。观察“电流”窗口中显示的以GΩ为单位的封接电阻值。</li>
		<li>确保封接电阻在0.5 - 2 MΩ范围内。超出此范围的数值表明电极未充分抛光或位置不正确。</li>
		<li>在整个记录过程中持续监测封接电阻，确保其在实验期间保持恒定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 分析
<ol>
	<li>使用定制软件进行记录分析（参见材料表）。 
	注意：本实验室使用自主研发的软件 Quantan31，该软件专为检测局部记录的 EJCs 和 mEJCs 而设计（图4）。该软件包含高斯数字滤波器，可检测重叠的多量子事件中的量子峰（图4A）。其他方法见文献17。</li>
</ol>
<img alt="电生理学图示，显示在 0.2nA 和 0.5nA 尺度下随时间变化的 mEJC 和 EJC 振幅。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4. 量子分析。 Quantan 软件对 mEJC（A）和 EJC（B）的检测结果。事件区域以绿色标出，峰顶以红色箭头标示。<a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> J Physiol. 262 (1), 189-214 (1976).</li>
<li>Katz, B., Miledi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+temperature+on+the+synaptic+delay+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction.</a> J Physiol. 181 (3), 656-670 (1965).</li>
<li>Macleod, G. T., Gan, J., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle-associated+proteins+and+quantal+release+at+single+active+zones+of+amphibian+%28Bufo+marinus%29+motor-nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Vesicle-associated proteins and quantal release at single active zones of amphibian (Bufo marinus) motor-nerve terminals.</a> J Neurophysiol. 82 (3), 1133-1146 (1999).</li>
<li>Macleod, G. T., Farnell, L., Gibson, W. G., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+secretion+and+nerve-terminal+cable+properties+at+neuromuscular+junctions+in+an+amphibian+%28Bufo+marinus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Quantal secretion and nerve-terminal cable properties at neuromuscular junctions in an amphibian (Bufo marinus).</a> J Neurophysiol. 81 (3), 1135-1146 (1999).</li>
<li>Zefirov, A., Benish, T., Fatkullin, N., Cheranov, S., Khazipov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Localization of active zones.</a> Nature. 376 (6539), 393-394 (1995).</li>
<li>Macleod, G. T., Lavidis, N. A., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dependence+of+quantal+secretion+from+visualized+sympathetic+nerve+varicosities+on+the+mouse+vas+deferens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium dependence of quantal secretion from visualized sympathetic nerve varicosities on the mouse vas deferens.</a> J Physiol. 480 (Pt 1), 61-70 (1994).</li>
<li>Samigullin, D., Bill, C. A., Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+transmitter+release+by+synapsin+II+in+mouse+motor+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of transmitter release by synapsin II in mouse motor terminals.</a> J Physiol. 561 (Pt 1), 149-158 (2004).</li>
<li>Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab3a-mediated+vesicle+recruitment+regulates+short-term+plasticity+at+the+mouse+diaphragm+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rab3a-mediated vesicle recruitment regulates short-term plasticity at the mouse diaphragm synapse.</a> Mol Cell Neurosci. 41 (2), 286-296 (2009).</li>
<li>Atwood, H. L., Parnas, H., Parnas, I., Wojtowicz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+currents+evoked+by+graded+intracellular+depolarization+of+crayfish+motor+axon+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantal currents evoked by graded intracellular depolarization of crayfish motor axon terminals.</a> J Physiol. 383, 587-599 (1987).</li>
<li>Parnas, H., Dudel, J., Parnas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+release+and+its+facilitation+in+crayfish.+I.+Saturation+kinetics+of+release%2C+and+of+entry+and+removal+of+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish. I. Saturation kinetics of release, and of entry and removal of calcium.</a> Pflugers Arch. 393 (1), 1-14 (1982).</li>
<li>Wojtowicz, J. M., Marin, L., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+changes+in+synaptic+release+sites+at+the+crayfish+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-induced changes in synaptic release sites at the crayfish neuromuscular junction.</a> J Neurosci. 14 (6), 3688-3703 (1994).</li>
<li>Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crayfish+neuromuscular+facilitation+activated+by+constant+presynaptic+action+potentials+and+depolarizing+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Crayfish neuromuscular facilitation activated by constant presynaptic action potentials and depolarizing pulses.</a> J Physiol. 241 (1), 69-89 (1974).</li>
<li>Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+statistics+of+transmitter+release+during+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Changes in the statistics of transmitter release during facilitation.</a> J Physiol. 229 (3), 787-810 (1973).</li>
<li>Worden, M. K., Bykhovskaia, M., Hackett, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+at+the+lobster+neuromuscular+junction%3A+a+stimulus-dependent+mobilization+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Facilitation at the lobster neuromuscular junction: a stimulus-dependent mobilization model.</a> J Neurophysiol. 78 (1), 417-428 (1997).</li>
<li>Bykhovskaia, M., Hackett, J. T., Worden, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asynchrony+of+quantal+events+in+evoked+multiquantal+responses+indicates+presynaptic+quantal+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Asynchrony of quantal events in evoked multiquantal responses indicates presynaptic quantal interaction.</a> J Neurophysiol. 81 (5), 2234-2242 (1999).</li>
<li>Bykhovskaia, M., Polagaeva, E., Hackett, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechnisms+underlying+different+facilitation+forms+at+the+lobster+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Mechnisms underlying different facilitation forms at the lobster neuromuscular synapse.</a> Brain Res. 1019 (1-2), 10-21 (2004).</li>
<li>Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+measurement+and+analysis+methods+compared+for+crayfish+and+Drosophila+neuromuscular+junctions%2C+and+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus.</a> J Neurosci Methods. 61 (1-2), 67-78 (1995).</li>
<li>Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+stability+of+Drosophila+larval+neuromuscular+preparations+in+haemolymph-like+physiological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions.</a> J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).</li>
<li>Pawlu, C., DiAntonio, A., Heckmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postfusional+control+of+quantal+current+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Postfusional control of quantal current shape.</a> Neuron. 42 (4), 607-618 (2004).</li>
<li>Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapsin+maintains+the+reserve+vesicle+pool+and+spatial+segregation+of+the+recycling+pool+in+Drosophila+presynaptic+boutons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Synapsin maintains the reserve vesicle pool and spatial segregation of the recycling pool in Drosophila presynaptic boutons.</a> Brain Res. 1178, 52-64 (2007).</li>
<li>Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+endosomal+endocytic+pathway+increases+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the endosomal endocytic pathway increases quantal size.</a> Mol Cell Neurosci. 40 (2), 199-206 (2009).</li>
<li>Vasin, A., Volfson, D., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+the+Complexin+Accessory+Helix+with+Synaptobrevin+Regulates+Spontaneous+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Interaction of the Complexin Accessory Helix with Synaptobrevin Regulates Spontaneous Fusion.</a> Biophys J. 111 (9), 1954-1964 (2016).</li>
<li>Wong, K., Karunanithi, S., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+unit+populations+at+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Quantal unit populations at the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> J Neurophysiol. 82 (3), 1497-1511 (1999).</li>
<li>Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+reduced+calcium+on+quantal+unit+current+and+release+at+the+crayfish+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">The effect of reduced calcium on quantal unit current and release at the crayfish neuromuscular junction.</a> Pflugers Arch. 391 (1), 35-40 (1981).</li>
<li>Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Ca2%2B+inflow+to+quantal%2C+phasic+transmitter+release+from+nerve+terminals+of+frog+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Contribution of Ca2+ inflow to quantal, phasic transmitter release from nerve terminals of frog muscle.</a> Pflugers Arch. 422 (2), 129-142 (1992).</li>
<li>Marrero, H. G., Lemos, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarrero%2C+HG+%22Loose-Patch-Clamp+method%22">Loose-Patch-Clamp method</a>. , 2 ed, Humana Press. (2007).</li>
<li>Wu, W. H., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+recordings+of+high+and+low+output+NMJs+on+the+crayfish+leg+extensor+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Physiological recordings of high and low output NMJs on the crayfish leg extensor muscle.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li>
<li>Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM+1-43+labeling+of+synaptic+vesicle+pools+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19229190">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Imlach, W., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+methods+for+recording+synaptic+potentials+from+the+NMJ+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the NMJ of Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+quantal+analysis+more+convenient%2C+fast%2C+and+accurate%3A+user-friendly+software+QUANTAN%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Making quantal analysis more convenient, fast, and accurate: user-friendly software QUANTAN.</a> J Neurosci Methods. 168 (2), 500-513 (2008).</li>
<li>Huntwork, S., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complexin+fusion+clamp+regulates+spontaneous+neurotransmitter+release+and+synaptic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A complexin fusion clamp regulates spontaneous neurotransmitter release and synaptic growth.</a> Nat Neurosci. 10 (10), 1235-1237 (2007).</li>
<li>Zhong, Y., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+synaptic+plasticity+in+Drosophila+memory+mutants+with+a+defective+cyclic+AMP+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altered synaptic plasticity in Drosophila memory mutants with a defective cyclic AMP cascade.</a> Science. 251 (4990), 198-201 (1991).</li>
<li>Delgado, R., Maureira, C., Oliva, C., Kidokoro, Y., Labarca, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+of+vesicle+pools%2C+rates+of+mobilization%2C+and+recycling+at+neuromuscular+synapses+of+a+Drosophila+mutant%2C+shibire%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Size of vesicle pools, rates of mobilization, and recycling at neuromuscular synapses of a Drosophila mutant, shibire.</a> Neuron. 28 (3), 941-953 (2000).</li>
<li>Melom, J. E., Akbergenova, Y., Gavornik, J. P., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+and+evoked+release+are+independently+regulated+at+individual+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous and evoked release are independently regulated at individual active zones.</a> J Neurosci. 33 (44), 17253-17263 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

Drosophila 是研究突触传递的一种理想模式生物。在幼虫神经肌肉接头（NMJ）上已采用多种记录方式，包括突触电位的细胞内记录、双电极电压钳记录突触电流33,34，以及本文所述的突触电流的局灶性大斑记录。后一种技术可对可视化神经末梢处的突触传递进行精确定量分析。
所述方案的成功关键在于能否清晰地观察目标区域，以及能否定制记录电极的制备。因此，高质量的微分干涉差（DIC）光学系统、高倍率长工作距离的水浸物镜，以及用于电极火焰抛光和弯曲的定制设备都至关重要。
这种方法的优点在于能够监测位于记录电极下方的少数突触的活动。然而需要注意的是，位于电极边缘附近的突触小体也可能对记录到的活动有所贡献。因此，在实验过程中，电极的位置以及封接电阻必须保持稳定。
监测单个突触小结活动的能力可与近期的成像技术相结合。例如，可在单个活性区进行光学检测活动<s...

Drosophila 是研究控制突触传递分子机制的优良模型系统。Drosophila 的神经肌肉系统为谷氨酸能型，因此可利用 Drosophila 神经肌肉接头（NMJ）来研究谷氨酸能释放的保守特性。自 Jan 和 Jan 的研究1以来，三龄幼虫已被广泛用于通过记录兴奋性接头电位（EJPs）或电流（EJCs）来研究诱发性和自发性突触传递。EJPs 通常使用尖锐的玻璃微电极进行细胞内记录，反映的是整个 NMJ 的活动，包括在特定肌纤维上形成突触的所有突触小结。
相比之下，通过将微电极尖端放置在神经末梢或突触膨大附近，可对少量释放位点的活动进行局灶性记录。该技术最初由 Katz 和 Miledi2采用，局灶性细胞外记录已成功应用于多种神经肌肉接头（NMJ）制备，包括蛙3,4,5、小鼠6,7,8、甲壳类9,10,11,12,13,14,15,16以及Drosophila17,18,19,20,21,22,23。Dudel 进一步发展了该方法，优化了大电极记录电极24,25。在 Dudel 的实现中，该技术与松散贴附式膜片钳方法26非常接近。
的 果蝇 幼虫神经肌肉接头具有明确的突触小体，且带有遗传编码的神经元荧光标记的转基因品系（参见 材料表) 均可轻松获得。这些优势使我们能够从选定的突触小体记录EJCs和mEJCs20,21,22在此，我们详细描述这一技术。

<table><tbody><tr><td>Sutter P-97</td><td>Sutter instrument</td><td>P-97</td><td>微电极拉制仪</td></tr><tr><td>Narishige MF-830</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>显微操作器</td></tr><tr><td>WPI MF200</td><td>WPI</td><td>MF200</td><td>显微操作器</td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>WPI</td><td>B150-86-10</td><td>玻璃毛细管</td></tr><tr><td>Microtorch 1WG61</td><td>Grainer</td><td>1WG61</td><td>微型火炬</td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td>用于制备解剖板的硅胶材料</td></tr><tr><td>解剖针</td><td>Amazon</td><td>B00J5PMPJA</td><td>用于固定幼虫的针具</td></tr><tr><td>镊子</td><td>WPIINC</td><td>500342</td><td>用于放置解剖针、移除幼虫内脏和气管</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>WPIINC</td><td>501778</td><td>用于剪开幼虫表皮和神经</td></tr><tr><td>Olympus BX61WI</td><td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td>直立显微镜</td></tr><tr><td>Olympus Lumplan FL N 60x</td><td>Olympus</td><td>UPLFLN 60X</td><td>60倍显微镜物镜</td></tr><tr><td>Olympus UPlan FL N 10x</td><td>Olympus</td><td>Uplanfl N 10X</td><td>10倍显微镜物镜</td></tr><tr><td>Narishige 显微操作器</td><td>Narishige</td><td>MHW-3</td><td>三轴水力显微操作器</td></tr><tr><td>npi Electronic GmbH ELC-03XS</td><td>npi Electronic GmbH</td><td>ELC-03XS</td><td>电生理放大器</td></tr><tr><td>A.M.P.I Master 8</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master 8</td><td>电刺激器</td></tr><tr><td>A.M.P.I Iso-Flex</td><td>A.M.P.I.</td><td>Iso-Flex</td><td>刺激隔离器</td></tr><tr><td>TMC 抗振台</td><td>TMC</td><td>63-9090</td><td>抗振台</td></tr><tr><td>TMC 法拉第笼</td><td>TMC</td><td>81-333-90</td><td>法拉第笼</td></tr><tr><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1322A</td><td>Digidata 数据采集系统</td></tr><tr><td>计算机</td><td>Dell</td><td>Dell Dimension 5150</td><td>安装 Windows XP 操作系统的计算机</td></tr><tr><td>电极夹持器</td><td>WPI</td><td>MEH3SW</td><td>电极夹持器</td></tr><tr><td>光学滤光片</td><td>Omega optical</td><td>XF 115-2</td><td>用于绿色荧光蛋白（GFP）检测的滤光立方体</td></tr><tr><td>pCLAMP 8</td><td>Axon Instruments</td><td>8.0.0.81</td><td>信号记录软件</td></tr><tr><td>Quantan</td><td>实验室内部软件</td><td>-</td><td>信号处理软件</td></tr><tr><td>Canton-S（野生型）</td><td>Bloomington 菌种中心</td><td>64349</td><td>对照果蝇品系</td></tr><tr><td>cpx SH1</td><td>J.T. Littleton 惠赠</td><td>-</td><td>突触融合蛋白敲除果蝇品系，具有增强的自发胞吐作用</td></tr><tr><td>CD8-GFP</td><td>Bloomington 菌种中心</td><td>5137</td><td>神经元表达荧光标记（GFP）的果蝇品系</td></tr></tbody></table>

突触电流的局灶性大斑块记录 黑腹果蝇 幼虫神经肌肉接头

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

果蝇 神经肌肉接头（NMJ）是研究谷氨酸能突触传递的优良模型系统。本文描述了一种对可视化末梢小结进行局灶性大斑块记录突触电流的技术 黑腹果蝇 幼虫神经肌肉接头。该技术需要定制记录用微电极，并使用配备高倍率、长工作距离水浸物镜、微分干涉差（DIC）光学系统及荧光附件的复合显微镜。记录电极置于通过DIC光学、落射荧光或两者结合所观察到的特定突触膨大顶部。该技术的优势在于可监测有限数量释放位点的突触活动。记录电极具有&#160;直径为几微米，且释放位点位于电极边缘之外&#160;不会显著影响记录到的电流。所记录的突触电流具有快速的动力学特征，易于分辨。这些优势对于研究自发性或非同步突触活动增强的果蝇突变品系尤为重要。

局灶性大电极记录可实现对选定突触小体突触活动的监测（图5）。当电极置于突触小体顶部时（图5A，位点1），所记录到的微小终板电流（mEJCs）（图5C，位点1）其幅度显著高于噪声水平，并具有陡峭的上升相（在亚毫秒范围内）。当记录电极从突触小体移开数微米后（图5A，位点2），所记录到的mEJCs幅度几乎降至噪声水平（图5B，位点2）。此时记录到的终板电流（EJCs）难以与噪声区分，且其上升相明显延长（图5C，位点2与位点1对比）。
记录到的EJCs和mEJCs所涉及的释放位点数量有限，以及局部记录的突触...

可以从视觉化的突触小结局部记录突触电流 果蝇 三龄幼虫神经肌肉接头。该技术可实现对单个突触小结活动的监测。

果蝇神经肌肉接头（NMJ）是研究谷氨酸能突触传递的优良模型系统。我们描述了一种局灶性…

该技术的总体目标是监测果蝇幼虫神经肌肉接头处可视化突触小体的突触活动。这是一个优良的模式系统，易于进行遗传操作。该技术可解决您科研中的关键问题。例如突触蛋白的突变如何调控突触传递。该技术的主要优势在于可监测有限数量的释放位点的活动，并且能够轻松分辨出具有快速动力学特性的记录电流。开始实验时：准备微电极拉制仪。使用显微镜在 35 倍放大倍数下确认拉制电极的内径在 7 至 10 微米范围内。将毛细管储存于密闭容器中，以防止灰尘积聚。接下来，使用显微拉制仪对毛细管进行火焰抛光。确保抛光电极的最终内径为5 µm。然后进行弯曲操作。将电极固定在操纵器上，并将尖端置于灯丝上方但不接触灯丝的位置。将加热值设定为最大值的60-70%，踩下微熔炉脚踏板加热灯丝一至两秒。使用L形针轻轻下拉电极尖端，使其弯曲角度约为90度。用手将电极置于喷灯火焰上方，在距第一弯7至10毫米处形成第二个弯，弯曲角度约为120度。配制一种类似血淋巴的 HL3 溶液。将溶液保存在冰箱中，并每周新鲜配制一次。刺激用玻璃微电极的制备方法与记录用玻璃微电极相同，但无需弯曲。接下来，将刺激用移液管插入连接至注射器的微电极夹持器中。使用涂有硅橡胶环氧树脂的小型培养皿制作解剖板。然后，用镊子从试剂瓶中选取一条游走期三龄幼虫。用大头针固定幼虫，第一根针插入后端，另一根针插在靠近口钩的前端。加入HL3溶液。在幼虫背侧，使用弹簧剪从上方的针到下方的针沿直线剪开。将幼虫肌片用大头针固定，在幼虫左右两侧各加一枚大头针。用镊子去除消化道和气管。使用弹簧剪在腹神经索外侧剪断神经。将含有制备样品的培养皿放置在显微镜载物台上。将参考电极插入浴液中。用HL3溶液填充记录电极。在10倍物镜下，将电极浸入浴液中，并使用显微操作器将其置于第二、第三或第四腹节的第六和第七块肌肉上方。接着，切换至60倍物镜，使用落射荧光或微分干涉差（DIC）光学系统对目标区域进行聚焦。将电极尖端置于突触小结顶部，然后非常轻柔地将电极压向肌肉，因为过大的压力可能会损伤神经肌肉接头（NMJ）或诱发自发性突触活动增加。接下来，打开放大器、AD 板和计算机。然后，在放大器上选择电压钳模式。启动数据采集软件，选择连续记录模式，并在计算机屏幕上观察终板微小兴奋性突触电流（MEJCs）的出现。确保微终板电流（MEJCs）的幅度在0.2至0.7纳安范围内。在显微操作器的视觉控制下，将刺激电极放置于支配腹部第二至第四节段的轴突附近。通过拉动连接至电极 holder 的注射器活塞施加负压，使轴突被吸入电极内部。接下来，打开刺激器。旋转隔离单元上的旋钮以设置零电流，然后缓慢增加电流，直至出现终板电流（EJCs）或达到阈值。在超阈值状态下进行刺激。将刺激电流增加至约两倍于观察到EJCs所需的阈值。通过将放大器的电极电阻开关转至封接测试位置，测量记录用大斑块电极的封接电阻。在电流窗口中观察以吉欧姆（giga ohms）为单位显示的封接电阻值。局部大电极膜片记录技术能够监测特定突触小体的突触活动。当电极位于突触小体顶部时，记录到的微型终板电流（MEJCs）幅度显著高于噪声水平，且上升相非常陡峭，时间范围在亚毫秒级别。当记录电极从突触小体移开数微米后，所记录的微型终板电流（MEJCs）幅度几乎下降至噪声水平。记录到的终板电流（EJCs）几乎无法与噪声区分开，且其上升相明显延长。采用聚焦记录技术可准确检测复杂型和侏儒突变体中的微型终板电流（MEJCs）。而对该突变体进行细胞内记录时，所观察到的递质释放事件存在重叠，难以被可靠识别。调节电芯片的角度对于电极的定位至关重要。完成此步骤后，可进行其他方法，例如检测单个释放事件的成像，以回答更多问题，如各个活性区活动的整合。

focal-macropatch-recordings-synaptic-currents-from-drosophila-larval

Research

科研

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Neuroscience

神经科学

从果蝇幼虫神经肌肉交界处的突触电流的焦 Macropatch 记录

本文介绍了用于测量果蝇幼虫神经肌肉接头处突触传递的电生理学方法。通过刺激运动神经元轴突可人工引发递质释放，而神经肌肉接头（NMJ）的传递情况可通过记录肌肉中诱发的突触后反应进行测量。...

果蝇幼虫神经肌肉接头突触电位记录的电生理学方法

将电生理学技术应用于可及的突触，可对突触活动进行量化测量，有助于分析突触突变体。本文描述了一种用于暴露秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans (C.

解剖并记录秀丽隐杆线虫神经肌肉接头

对黑腹果蝇（Drosophila）胚胎进行电生理记录，可分析发育中肌肉和神经元的电学特性，并表征谷氨酸能神经肌肉接头以及中枢胆碱能和GABA能突触的功能性突触形成过程。...

电生理记录在 果蝇 胚胎

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突触电流的局灶性大斑块记录黑腹果蝇幼虫神经肌肉接头

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