突触电流的局灶性大斑块记录 黑腹果蝇 幼虫神经肌肉接头

该技术的总体目标是监测果蝇幼虫神经肌肉接头处可视化突触小体的突触活动。这是一个优良的模式系统，易于进行遗传操作。该技术可解决您科研中的关键问题。

例如突触蛋白的突变如何调控突触传递。该技术的主要优势在于可监测有限数量的释放位点的活动，并且能够轻松分辨出具有快速动力学特性的记录电流。开始实验时：准备微电极拉制仪。

使用显微镜在 35 倍放大倍数下确认拉制电极的内径在 7 至 10 微米范围内。将毛细管储存于密闭容器中，以防止灰尘积聚。接下来，使用显微拉制仪对毛细管进行火焰抛光。

确保抛光电极的最终内径为5 µm。然后进行弯曲操作。将电极固定在操纵器上，并将尖端置于灯丝上方但不接触灯丝的位置。

将加热值设定为最大值的60-70%，踩下微熔炉脚踏板加热灯丝一至两秒。使用L形针轻轻下拉电极尖端，使其弯曲角度约为90度。用手将电极置于喷灯火焰上方，在距第一弯7至10毫米处形成第二个弯，弯曲角度约为120度。

配制一种类似血淋巴的 HL3 溶液。将溶液保存在冰箱中，并每周新鲜配制一次。刺激用玻璃微电极的制备方法与记录用玻璃微电极相同，但无需弯曲。

接下来，将刺激用移液管插入连接至注射器的微电极夹持器中。使用涂有硅橡胶环氧树脂的小型培养皿制作解剖板。然后，用镊子从试剂瓶中选取一条游走期三龄幼虫。

用大头针固定幼虫，第一根针插入后端，另一根针插在靠近口钩的前端。加入HL3溶液。在幼虫背侧，使用弹簧剪从上方的针到下方的针沿直线剪开。

将幼虫肌片用大头针固定，在幼虫左右两侧各加一枚大头针。用镊子去除消化道和气管。使用弹簧剪在腹神经索外侧剪断神经。

将含有制备样品的培养皿放置在显微镜载物台上。将参考电极插入浴液中。用HL3溶液填充记录电极。

在10倍物镜下，将电极浸入浴液中，并使用显微操作器将其置于第二、第三或第四腹节的第六和第七块肌肉上方。接着，切换至60倍物镜，使用落射荧光或微分干涉差（DIC）光学系统对目标区域进行聚焦。将电极尖端置于突触小结顶部，然后非常轻柔地将电极压向肌肉，因为过大的压力可能会损伤神经肌肉接头（NMJ）或诱发自发性突触活动增加。

接下来，打开放大器、AD 板和计算机。然后，在放大器上选择电压钳模式。启动数据采集软件，选择连续记录模式，并在计算机屏幕上观察终板微小兴奋性突触电流（MEJCs）的出现。

确保微终板电流（MEJCs）的幅度在0.2至0.7纳安范围内。在显微操作器的视觉控制下，将刺激电极放置于支配腹部第二至第四节段的轴突附近。通过拉动连接至电极 holder 的注射器活塞施加负压，使轴突被吸入电极内部。

接下来，打开刺激器。旋转隔离单元上的旋钮以设置零电流，然后缓慢增加电流，直至出现终板电流（EJCs）或达到阈值。在超阈值状态下进行刺激。

将刺激电流增加至约两倍于观察到EJCs所需的阈值。通过将放大器的电极电阻开关转至封接测试位置，测量记录用大斑块电极的封接电阻。在电流窗口中观察以吉欧姆（giga ohms）为单位显示的封接电阻值。

局部大电极膜片记录技术能够监测特定突触小体的突触活动。当电极位于突触小体顶部时，记录到的微型终板电流（MEJCs）幅度显著高于噪声水平，且上升相非常陡峭，时间范围在亚毫秒级别。当记录电极从突触小体移开数微米后，所记录的微型终板电流（MEJCs）幅度几乎下降至噪声水平。

记录到的终板电流（EJCs）几乎无法与噪声区分开，且其上升相明显延长。采用聚焦记录技术可准确检测复杂型和侏儒突变体中的微型终板电流（MEJCs）。而对该突变体进行细胞内记录时，所观察到的递质释放事件存在重叠，难以被可靠识别。

调节电芯片的角度对于电极的定位至关重要。完成此步骤后，可进行其他方法，例如检测单个释放事件的成像，以回答更多问题，如各个活性区活动的整合。