天然铀对体外破影响的分析方法
2018年1月30日
众所周知, 铀会影响骨骼的新陈代谢。在这里, 我们提出了一项协议, 目的是研究天然铀暴露对破骨细胞的活性、分化和功能的影响, 这是负责骨质吸收的单元。
该程序的总体目标是研究天然铀暴露对破骨细胞活力、分化和功能的影响。这种方法可以帮助回答环境毒性领域关于铀暴露对骨骼生理和新陈代谢影响的关键问题。这种技术的主要优点是它为筛选铀原产地提供了一个有趣的新工具。
当 RAW 264.7 细胞培养物达到 85% 至 90% 汇合时，使用细胞刮刀将细胞从细胞培养瓶底部机械提起，并将细胞转移到无菌的 50 毫升锥形管中。吸取细胞溶液几次以打碎团块并计数所得的单细胞悬液。在 α 修饰的最低必需培养基中将细胞稀释至每毫升 1 倍 10 到 4 个细胞的浓度，补充有 L-谷氨酰胺和 5% 胎牛血清，并将每孔 1 毫升细胞添加到 24 孔细胞培养板中，在 37 摄氏度下孵育 6 小时。
破骨细胞分化和重吸收测定可重复性的一个重要参数是细胞接种密度。在接种细胞之前，请特别注意细胞计数、细胞悬浮液制备及其均一性。为了制备小便池盐溶液，从经过无菌细胞培养测试的 7.5% 碳酸氢钠水溶液开始，首先在冰上制备并冷却 100 毫摩尔碳酸氢盐溶液，然后加入一体积的 100 毫摩尔小便池乙酸盐溶液，逐滴加入 9 体积的冰冷碳酸氢盐溶液中，轻轻摇晃。
让溶液在室温下平衡。三小时后，将适量的小便池溶液逐滴稀释到含有 50 ng/ml RANKL 的分化培养基中，直至达到所需的小便池工作浓度，并在室温下再平衡 3 小时。每次稀释小便池盐后，漫长的孵育步骤对于稳定溶液中的小便池复合物至关重要。
在第二个平衡期结束时，根据需要用 1 毫升小便池处理过的培养基或对照培养基轻轻更换每个孔中的培养基，然后将细胞放回培养箱中。多核破骨细胞应在培养的第 3 天和第 4 天之间出现。为了评估新分化的破骨细胞的大小和形态，根据制造商的说明，用抗酒石酸盐酸性磷酸酶对细胞进行染色，并以足以区分细胞核的分辨率对每个孔的整个表面进行成像。
当所有孔都成像后，使用开源 ImageJ 软件打开一个孔的图像并验证缩放单元。然后选中弹出窗口中的 Global 框，将新的缩放单位应用于所有后续图像。在 Analyze 菜单下，选择 Set Measurements 并选中 Area 和 Display label 框。
取消选中所有其他框。在"分析"菜单下，打开"工具"，然后打开"感兴趣区域管理器"，然后在 ImageJ 主窗口中选择矩形选择工具。勾勒出大约 1， 000 x 1， 000 微米的感兴趣区域，然后单击添加按钮将选择添加到感兴趣区域管理器中。
然后点击 更多， 优惠 保存区域。要创建要分析的五个区域之一的副本，请在 Region of Interest Manager 中选择感兴趣区域，然后在所选区域内右键单击以复制该区域。选中 Show All 和 Labels 框，然后选择多边形选择工具，以手动勾勒出重复感兴趣区域中的破骨细胞之一。
要将此轮廓添加到 Region of Interest Manager，请单击 Region of Interest Manager 窗口中的 Add。添加完所有破骨细胞后，选择所有轮廓，然后单击 Measure 测量以测量其表面。然后将结果窗口中显示的测量值传输到电子表格中。
为了评估小便池处理的破骨细胞的功能，在添加分化培养基前一天，将 RAW 细胞从 85% 至 90% 汇合的细胞培养物接种到生长培养基中的 24 孔骨测定板上，如刚才所示。第二天，用含有分化小便池的培养基轻轻替换上清液，并让 RAW 细胞分化成破骨细胞，如刚才所示。在破骨细胞生成第 5 天，用 10% 漂白剂溶液替换含小便池的培养基，以去除模拟骨表面的细胞。
在室温下 5 分钟后，用去离子水清洗孔 2 次，然后风干。接下来，用 1% 茜素红 S 钠盐溶液对每个孔的未吸收区域的钙盐进行染色。10 到 15 秒后，取出茜素溶液，用水轻轻清洗孔 3 到 4 次。
要将茜素染色孔的 RGB 图像转换为灰度 8 位格式，请在"图像"菜单下，选择"类型"和"8 位"。然后，使用椭圆选择工具，勾勒出要分析吸收的孔的整个表面，并保存感兴趣的区域，如刚才所示。为了便于选择阈值，请选择 Edit 和 Clear Outside 以清除定义感兴趣区域之外的所有特征。
复制刚才所示的感兴趣区域，然后在 Image 菜单下选择 Adjust Threshold，调整滑动条以选择合适的阈值。所有重新吸收的区域都应高于阈值并显示为白色，而所有未重新吸收的区域都应低于阈值并显示红色。要完成阈值选择，请单击 Threshold 窗口中的 Apply，然后以适当的感兴趣格式保存最终的二进制图像。
要定义要在感兴趣区域内进行的测量，请在 Analyze 菜单下选择 Set Measurements 并选中 Area、Area Fraction 和 Limit to Threshold 框，并取消选中所有其他框。然后，要直接在结果窗口中获得重吸收面积的分数，请在"编辑"菜单下选择"反转"来反转复制的二元图像，并注意在最终的二元图像上选择主要感兴趣区域并测量重吸收面积分数。响应铀的新分化破骨细胞的数量和大小的变化在整个孔的合成图像以及选定感兴趣区域的放大图片中很容易看到。
正如刚才通过概述每个区域内的所有破骨细胞并测量每个轮廓细胞的面积来分析在不同培养条件下生长的破骨细胞的大小。为了研究铀对破骨细胞吸收活性的影响，将 RAW 264.7 细胞接种并分化在模拟骨表面板上。在测定结束时，去除破骨细胞，并对未吸收的区域进行染色和成像，如图所示。
然后将图像转换为 8 位灰度并设置阈值，以便于计算重新吸收的区域。该程序也可应用于研究其他重金属对破骨细胞生成的影响。
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概述
本研究调查了天然铀暴露对破骨细胞活力、分化和功能的影响。该协议旨在增进对铀对骨代谢影响的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 环境毒理学
- 骨生理学
背景
- 已知铀会影响骨代谢。
- 破骨细胞负责骨吸收。
- 了解铀的影响可以为环境健康提供信息。
- 这项研究对环境毒性领域做出贡献。
研究目的
- 调查铀对破骨细胞的影响。
- 评估细胞活力和分化。
- 探索铀暴露对骨骼健康的功能影响。
使用的方法
- 利用RAW 264.7细胞培养进行研究。
- 机械提取细胞并计数以进行分析。
- 将细胞稀释并在受控环境中孵育。
- 该方法允许筛查铀对骨细胞的影响。
主要结果
- 该协议提供了铀暴露下破骨细胞行为的见解。
- 结果可能表明活力和功能的变化。
- 研究结果有助于理解环境对骨代谢的影响。
- 对进一步研究铀的生物学影响的潜力。
结论
- 本研究为研究铀毒性提供了新工具。
- 了解破骨细胞反应对骨骼健康至关重要。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上探索更广泛的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of uranium's effects on osteoclastogenesis enables mechanistic de-risking in bone toxicity studies and supports predictive confidence for environmental hazard assessment. This protocol provides standardized, reproducible workflows for evaluating cytotoxicity and functional impacts on bone-resorbing cells, informing early-stage target validation and risk triage. The approach is directly relevant for biopharma teams investigating bone metabolism, toxicology, and environmental exposure liabilities.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of uranium's mechanistic impact on osteoclast differentiation and function.
- Supports biological de-risking by quantifying cytotoxicity and resorptive activity changes.
- Facilitates predictive confidence in environmental and bone-targeted toxicity models.
Screening & Assay Development
- Establishes validated in vitro systems for screening heavy metal effects on bone cell biology.
- Standardizes cell seeding, media preparation, and image-based quantification for reproducibility.
- Generates quantitative outputs such as osteoclast size and matrix resorption percentage for downstream analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant endpoints in bone metabolism and toxicology.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical hazard identification.
- Enables risk-adjusted advancement of environmental toxicity programs.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for bone toxicity and environmental hazard assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on uranium's cellular effects and pathway clarification in osteoclastogenesis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative assay outputs for compound or exposure evaluation.
- Analytics: Provides image-based measurements of cell size and resorbed matrix area for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro mechanistic data to preclinical toxicology endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for assessing other heavy metals or environmental agents on bone cells.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in bone toxicity studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible assay protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation in environmental and bone-targeted R&D.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of environmental hazard and bone metabolism programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, image analysis, and quantitative assay design.
- Needs access to imaging platforms and analytical software such as ImageJ.
- Demands rigorous standardization of cell seeding and media preparation for reproducibility.
- Adaptable to other cell lines or heavy metal exposures with protocol optimization.
- Limitations include in vitro model constraints and the need for careful thresholding in image analysis.
