一种用于分析成年果蝇攀爬行为的自动化快速迭代负向趋地性实验方法 果蝇 神经退行性疾病模型

本自动化快速迭代负向趋地性实验的总体目标是分析与神经退行性变相关的成年黑腹果蝇（Drosophila）攀爬能力缺陷。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如与神经退行性变相关的运动功能障碍机制。该技术的主要优势在于，果蝇的攀爬活动可实现自动化且高通量的分析。

该技术的应用意义延伸至神经退行性疾病的治疗与诊断，因为神经退行性疾病通常与运动能力进行性丧失、寿命缩短以及年龄依赖性的神经退行性变密切相关。我们首次提出了该方法的构想，旨在以更精确的方式测量果蝇成虫的运动活动能力。

进行果蝇收集时，首先将果蝇饲养在标准果蝇培养基中，条件为25摄氏度、70%湿度，以及12小时光照与12小时黑暗的循环环境。在二氧化碳麻醉下收集UAS-Dicer2 DDC-GAL4果蝇处女蝇。将处女蝇与携带以下基因型的两天龄成年雄蝇按1:2的雌雄比例进行杂交。

每个实验组分别将新羽化的雄性和雌性果蝇收集到三个试剂瓶中，每瓶放入10只果蝇，并添加标准培养基。然后将试剂瓶置于25摄氏度环境中。为进行自动化的RING实验，将每种基因型收集的10只同性别果蝇转移至每个试剂瓶中。

然后用螺旋盖固定小瓶。每组实验需同时分析对照果蝇和携带不同基因型的果蝇。打开放置在仪器前方的数码相机，待果蝇装载完毕并准备就绪后，开始录制。

应将相机水平放置，并使其与 RING 装置保持适当距离，以相对准确地捕捉所有果蝇的位置。让果蝇在小瓶中适应一分钟之后，打开控制步进驱动器的步进控制器。该控制器会驱动小型电动机，从而带动相连的杠杆，在两秒内连续上升并敲击装置四次。

轻敲装置后，注意观察果蝇开始沿壁向上爬行。在持续录制的同时，按照刚刚演示的方法，以60秒为间隔，连续进行三到五次同步操作。分别对5日龄、15日龄、25日龄和35日龄的果蝇重复该实验。

每次实验每组至少进行三次独立重复实验，每次收集至少30只果蝇或三个培养瓶。分析数据时，将录制的视频导入计算机。每次试验中，在敲击后六秒处截取视频图像。

在 R-fly 检测软件中，使用文件菜单导入快照图像。接下来，利用工具栏上的基线图标，精确定义小瓶的上、下基线，然后使用光标在图像上标记上、下基线。在设置栏中的“每瓶果蝇数量”（Flies in Rect）字段输入每只小瓶中的果蝇数量，在“试管高度”（Tube Height）字段输入小瓶长度。

每支试管中果蝇的个体位置均在屏幕上以点标记。注意右侧面板的表格中，软件会自动计算每只果蝇的攀爬距离，并显示每支试管中10只果蝇的平均值。数据以均值±标准误（SEM）的形式呈现。

使用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Bonferroni多重比较检验计算显著性P值。本视频中采用自动化RING实验对Dicer2标记的果蝇进行分析，结果显示雄性和雌性果蝇在六秒时间内的攀爬距离均随年龄增长而下降，表明在多巴胺能或DA神经元中aux的表达对果蝇运动活动至关重要。在DA神经元中过表达auxGFP似乎不影响攀爬能力，而在DA神经元中共同表达auxR和auxGFP可挽救RNAi表型。

一旦掌握，若操作得当，整个过程可在两到三个小时内完成。该技术的发展为神经科学领域的研究人员探索黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中的神经退行性病变提供了有效途径。请注意，使用电动RING装置可能存在极高风险，每次实验前必须仔细检查并确保所有部件均已牢固固定。