TUNEL 检测

TUNEL 检测法最常用于检测正在经历凋亡的细胞，凋亡是一种程序性细胞死亡形式。凋亡是在发育过程中以及维持组织稳态中重要的生物学过程。TUNEL 染色可实现对凋亡细胞的可视化和定量分析。这有助于科学家评估新疗法在凋亡受到抑制（如癌症）或增强（如神经退行性疾病）的疾病中的有效性。

本视频将解释如何使用 TUNEL 检测法标记正在发生凋亡的细胞，详细演示在组织切片中执行该方法的逐步操作流程，并介绍研究人员如何应用此技术来理解细胞死亡的机制。

在深入探讨TUNEL检测的操作步骤之前，我们先来讨论该技术背后的原理。

细胞凋亡的众多典型特征之一是DNA片段化。DNA片段化是如何发生的？细胞凋亡由存在于细胞质中的一类称为caspase的酶执行。它们的主要作用是切割蛋白质，从而瓦解细胞。此外，caspase通过将caspase激活的脱氧核糖核酸酶（caspase-activated DNase，简称CAD）从其抑制蛋白ICAD上解离，从而激活CAD。被激活的CAD是一种内切核酸酶，可进入细胞核并切割染色体DNA。

DNA的切割最终导致产生大量带有切口末端的DNA片段，而TUNEL检测则通过荧光标记这些断裂DNA的切口末端，使科研人员能够检测细胞凋亡。但这具体是如何实现的？这就需要理解TUNEL反应。TUNEL是末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling）的缩写。TUNEL检测的两种主要试剂是末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，简称TdT）和脱氧尿苷三磷酸（deoxyuridine triphosphate，简称dUTP），其中dUTP可被荧光标记以便于检测。

为了理解TUNEL反应，让我们回到含有DNA片段的凋亡细胞。这些带有切口的DNA片段具有游离的3′羟基（3′ hydroxyl）基团。当将TUNEL试剂加入含有凋亡细胞的样本后，在催化剂酶TdT的作用下，荧光标记的dUTP会连接到这些3′羟基基团上。通过该方法染色的细胞被称为TUNEL阳性细胞，随后可通过荧光显微镜进行观察。

现在您已经了解了TUNEL检测背后的基本原理和概念，接下来我们将概述在组织切片中进行该技术的一般性实验方案。TUNEL检测的主要步骤包括：固定目标组织、组织通透化、加入TUNEL试剂、终止TUNEL反应，以及最终的分析。

首先，必须对目标组织进行固定，以保存其生物学结构。固定的作用机制是通过在细胞内交联蛋白质来实现的。对于TUNEL检测，可将组织置于含有4%多聚甲醛的溶液中，在4°C条件下固定4–24小时。固定完成后，将组织冷冻切片至厚度为10 µm或更薄的切片。

下一步是通透化处理，以便TdT酶等试剂能够进入细胞核。组织切片的通透化可通过在37°C条件下将其置于蛋白酶K溶液中处理5–15分钟来实现。随后，在室温下将组织切片置于摇床上，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗15–30分钟。

通透化完成后，向组织切片中加入TdT酶和荧光标记的dUTP，并同时加入含有作为TUNEL反应辅因子的钴离子的标记缓冲液。将TUNEL反应混合物与组织切片在37°C条件下避光孵育1–3小时，以防止荧光信号衰减。

孵育结束后，向组织切片中加入终止缓冲液以停止TUNEL反应，短暂孵育后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤切片。最后，使用荧光显微镜观察经荧光标记dUTP染色的组织切片，并评估TUNEL阳性细胞在特定组织中的定位情况。通过计算特定组织切片中TUNEL阳性细胞所占的百分比，即可对细胞死亡程度进行定量分析。

现在您已经了解了如何进行TUNEL检测以识别凋亡细胞，接下来让我们讨论该检测方法如何用于回答细胞生物学家所关注的问题。

细胞死亡是组织和结构发育过程中正常的一部分，用于形态塑造以及清除不必要的细胞。因此，研究这一现象的科学家会探讨产前暴露于不同物质对发育过程中细胞凋亡的影响。在此项研究中，科学家旨在考察产前酒精暴露对大脑发育的影响。对胎儿脑组织进行TUNEL染色的结果显示，与对照动物相比，产前暴露于酒精的组织中细胞凋亡显著增加。

科学家还利用TUNEL检测来研究细菌感染引发的细胞凋亡。在本实验中，研究人员通过向小鼠注射Pseudomonas aeruginosa建立肺炎模型，该菌可诱导肺部炎症。随后，取出肺组织并进行TUNEL染色，以检测细菌感染引起的细胞凋亡。结果显示，与对照动物相比，感染细菌的小鼠体内凋亡性细胞死亡明显增加。

最后，TUNEL染色也可应用于人类肿瘤样本，以评估肿瘤对药物的反应性。在此例中，研究人员从患者体内获取肿瘤样本，并在体外进行培养。接着，用临床前药物处理样本，并通过TUNEL检测评估其反应。所得数据表明，使用热休克蛋白90抑制剂处理可显著增加肿瘤组织中的细胞凋亡。

您刚刚观看了 JoVE 关于使用 TUNEL 检测法检测凋亡细胞的视频。本视频回顾了 TUNEL 染色的原理，以及在组织切片上进行 TUNEL 检测的逐步操作流程。我们还探讨了该方法在研究发育和疾病过程中程序性细胞死亡方面的应用。一如既往，感谢您的观看！