完整、全小鼠乳腺的分离及细胞外基质表达及腺体形态学分析

这种全乳腺收获技术的总体目标是促进对来自完整腺体离体的乳腺组织的组织学表现的分析。这种方法可以帮助回答肿瘤生物学领域的关键问题，例如基质组织如何在肿瘤中重塑或异常基因或蛋白质表达如何改变乳腺导管结构。该技术的主要优点是它使研究人员能够表征和量化健康和患病小鼠整个乳腺中的蛋白质表达和导管结构。

演示这项技术的将是我实验室的研究生 Chris Thompson。根据文本方案处死 8 至 10 周龄雌性未产小鼠后，将尸体固定在仰卧位并使用 70% 乙醇使其饱和。用镊子捏住耻骨上方的毛皮，然后用小手术剪刀划伤。

然后，旋转剪刀，沿腹侧中线剪下毛皮，将尾部移动到颅骨。用较大的剪刀或止血钳钝地解剖双侧皮下筋膜，小心不要刺穿腹膜。沿切口两端的水平边缘切割。

接下来，将毛皮瓣固定打开并用 PBS 喷洒组织以保持湿润。然后，找到感兴趣的乳腺，将手术刀刀片沿着毛皮瓣内侧滑动，将乳腺和相关的皮下脂肪从真皮中切开。在将腹腺与腹股沟分离之前，请注意尽可能清楚地识别腺体。

立即将新分离的腺体浸入含有约 6 毫升 10：1 溶液的锥形管中，该溶液与组织体积为 10% 中性缓冲福尔马林，并孵育 24 至 48 小时。融化载玻片上的石蜡并根据文本方案重新水化切片后，在热板或微波炉中煮沸 10 毫摩尔柠檬酸钠溶液，然后将溶液倒入 Coplin 罐中。将玻片缓慢放入 Coplin 染色缸中，确保完全浸没，并在 100 摄氏度下孵育玻片 10 分钟以取回表位。

然后，取出并小心擦干载玻片。接下来，用疏水记号笔在组织周围画一个屏障。干燥后，用 PBS 冲洗玻片 1 到 2 秒。

然后，加入足够的内源性酶阻滞剂以覆盖组织，并将玻片孵育 10 分钟。将玻片浸入 1X PBS 中 10 分钟。然后，加入足够的 10% 驴血清和 PBS 以覆盖组织，并将样品在室温下在加湿室中孵育 1 小时。

从载玻片上倒出多余的阻断剂，并将适当稀释的 1% 血清一抗直接添加到载玻片中，确保组织均匀地被溶液覆盖。将玻片在室温下在加湿室中孵育 30 分钟。在组织上流过约 1 mL 的去离子水，小心洗涤玻片，然后将玻片放入 1X PBS 中孵育 5 分钟。

倒出过量的 PBS 并加入足够的辣根过氧化物酶偶联二抗，并将样品在加湿室中孵育 30 分钟。在组织上流过约 1 mL 的去离子水，小心洗涤载玻片，然后像以前一样，将组织在 1X PBS 中孵育 5 分钟。制备 DAB 加色原剂溶液后，从载玻片中倒出多余的缓冲液，并将两到三滴色原染料直接添加到组织中。

将样品在加湿室中孵育 5 分钟。然后，通过在组织上流出约 1 毫升的去离子水来小心洗涤载玻片。色原菌孵育后进行最后一次冲洗后，将玻片浸入 Harris 苏木精中 2 到 2 分半钟。

然后，在自来水下轻轻冲洗玻片 1 到 2 分钟。将玻片浸入分化溶液中 2 到 3 秒。然后，用自来水轻轻冲洗玻片约一到两分钟。

将玻片浸入蓝色试剂中 60 秒。然后，用 95% 乙醇冲洗玻片 30 秒。将玻片转移到酒精伊红 Y 中 2 到 3 分钟，然后用 95% 乙醇分两次脱水组织，每次 1 分钟。

然后，最后，将组织在 100% 乙醇中脱水一次 1 分钟。用无绒抹布小心擦干载玻片。然后，将一滴合成的非水性树脂基封固剂滴在载玻片上并盖上盖玻片。

要进行导管分析，请选择 α SMA 染色的载玻片。然后，使用装有相机安装物镜的光学显微镜，以 20 倍放大倍率收集代表性图像。要对每张图像中的管道进行计数，请手动计数或打开 ImageJ 并选择插件。

接下来，选择 analyze，然后从下拉菜单中选择单元格计数器。单击 initialize（初始化），然后高亮显示键入 1 以开始标记风管。完成后，选择 Results （结果） 以查看导管计数。

首先使用线条工具在图像的比例尺上绘制一条线。然后，单击 analyze 并 set scale （分析并设置比例）。在下一个窗口中，键入 已知距离 和 单位 长度 。

然后，单击 Ok.接下来，在 set measurement options 中，检查 area 和 perimeter。然后，使用手绘多边形工具，在肌上皮隔室的每个导管周围画一条线。

选择 measure（度量），并记录周长和面积。再次使用手绘多边形工具，在管腔内部沿导管上皮的顶端侧画一条线。然后，选择 measure （度量），并记录周长和面积。

从肌上皮隔室的面积中减去管腔隔室的面积，得到导管上皮的面积。从肌上皮隔室的周长中减去管腔隔室的周长，得到导管上皮的周长。要进行免疫组织化学分析，请将明场图像上传到分析软件，例如 ImageJ 或 Fiji Suite。

使用 ImageJ 中的插件菜单，打开 IHC 工具箱。在打开的 select model （选择模型） 组合框中，选择相应的染色。选择颜色选项以隔离污点。

这将打开一个结果窗口。使用颜色选择器载玻片确保正确隔离污渍，无背景夹杂或过度排除污渍。转到图像类型，16 位，将图像转换为 16 位。

然后，通过转到 image， adjust threshold 来对图像进行阈值处理。最后，转到 analyze，设置 measurement 以测量结果面积和平均灰度值，然后选择 analyze， measure， 以收集测量值。在 4 号乳腺的这些固定切片中，分析了胶原蛋白、纤连蛋白和 tenascin-C 的表达。

箭头表示这些组织中存在导管。为了量化导管的形态学特征，重要的是要小心处理组织学切片，因为处理不当可能会导致组织和导管受损，无法测量。此处显示了无法用于分析的受损组织示例。

该面板显示了导管可测量和可量化的完整组织标本。导管的特征不仅在于周围纤连蛋白染色的基质，还在于导管腔内有致密的上皮细胞群。在这个纤连蛋白染色切片中，几个完整的导管包含由箭头指示的分支。

出于此分析的目的，不应将这些导管分支视为单独的导管结构。在评估和测量导管时，区分导管和血管结构很重要。血管结构用红色箭头表示，导管结构用黑色箭头表示。

血管结构不仅可以通过管腔内衬内皮单层的存在来识别，还可以通过表明管腔内红细胞的核嗜酸性粒细胞结构的存在来识别。一旦掌握，每只动物的组织收获可以在大约 15 分钟内完成，切片染色可以在大约 7 到 8 小时内完成，如果一切正常，第二天会拍摄载玻片图像。在尝试这些过程时，请务必记住，实验的各个目标可能需要在特定步骤进行优化。

按照此程序，可以执行其他方法，如二次谐波产生或相干反斯托克斯拉曼散射，以回答有关组织基质组成或结构的其他问题。开发后，这项技术为肿瘤生物学等许多领域的研究人员铺平了道路，以探索人类疾病和病理的众多动物模型中的组织组织和蛋白质表达模式。看完这个视频，您应该对如何解剖和分离小鼠乳腺有很好的了解。

您还应该了解组织切片免疫组织化学染色的程序，包括复染的使用。不要忘记，与动物及其组织和化学物质（如二甲苯和 DAB 色原）一起工作可能非常危险，因此在执行这些程序时应始终采取预防措施，例如适当的饲养培训和使用个人防护设备。