Name: 完整、全小鼠乳腺的分离及细胞外基质表达及腺体形态学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: 学习完整分离小鼠乳腺并进行组织学分析的方法，用于评估细胞外基质蛋白表达和导管结构。该技术适用于发育生物学和肿瘤研究，支持对健康和病变组织的定量分析。

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作者谨此感谢 April Wiles 和 Roger Broderson 博士在动物尸检和腺体分离方面的协助。本研究的资金由费城骨科医学院衰老相关慢性疾病研究中心提供支持。

本方案中涉及动物实验的操作已通过费城骨科医学院机构动物护理和使用委员会的审查与批准，所有技术操作均在严格的伦理准则下进行。
1. 样品获取与处理
<ol>
	<li>选择合适的动物实验对象并放入 CO2 麻醉室。本实验使用 8–10 周龄雌性未产 B6.Cg-Cav1tmMIs/J 和 C57BL/6J 小鼠。</li>
	<li>开启气体流量至 30–40%。约 2 分钟后，当动物明显失去意识时，将气体阀门调至全压，再持续 5 分钟。 
	注意：在停止输送 CO2 后，需观察动物至少 10 分钟，通过可见呼吸迹象（例如胸部运动）确认其死亡。若动物仍有生命体征，可将其重新放回 CO2 麻醉室。也可采用颈椎脱位法处死，但不推荐，因为血液可能积聚于乳腺周围，干扰后续解剖及实验结果。</li>
	<li>处死后，将尸体仰卧固定，并用 70% 乙醇充分浸润。</li>
	<li>用镊子夹住耻骨上方的皮肤，用小型手术剪刀剪开一小口。旋转剪刀，沿腹侧中线从尾端向头端剪开皮肤。</li>
	<li>使用较大的剪刀或止血钳，沿切口两侧钝性分离皮下筋膜，注意避免刺破腹膜。在切口两端的横向边缘处进行剪切。</li>
	<li>将皮肤瓣固定张开，并再次喷洒 70% 乙醇。 
	注意：尽管使用 70% 乙醇有助于更清晰地区分腺体与周围皮下组织，但需注意避免因使用该溶液导致组织干燥。为防止干燥，应在不超过 4 分钟的时间内完成腺体分离。作为 70% 乙醇的替代方案，研究者也可使用通用隔离缓冲液（如 1× PBS）以避免组织脱水。</li>
	<li>定位目标乳腺组织，将 #4 手术刀片沿皮肤瓣内侧滑动，将乳腺及其相关的皮下脂肪从真皮层完整切割分离。 
	注意：使用 3.5 倍外科手术放大镜有助于更清晰地观察腺体结构。</li>
	<li>立即将新分离的腺体浸入含有 10:1（固定液:组织体积）的 10% 中性缓冲福尔马林溶液的锥形管中，固定 24–48 小时。 
	注意：根据研究目的，也可选用其他多种替代固定剂，如用于基因组研究的多聚甲醛、乙醇，或商业化的 RNA 保存缓冲液。</li>
	<li>按照机构规定的流程进行石蜡包埋，或将样品送至外包服务商进行处理、包埋及切片/载玻片制备。组织切片厚度为 5 µm。 
	注意：由于腺体周围存在过量脂肪组织，建议在切片和染色前先去除 100–200 µm 的组织。</li>
</ol>
2. 组织染色
<ol>
	<li>免疫组织化学
	<ol>
		<li>将待染色的切片置于58 ˚C的加热板上1小时，以熔化石蜡。 
		警告：熔化的石蜡可能会从载玻片上流下。需密切监控，或在载玻片下方放置吸水纸以收集流下的石蜡。 
		注意：此步骤并非必需，可选择跳过。如果结果未达预期，重新加入此步骤可能有助于改善结果。</li>
		<li>将切片置于盛有100%二甲苯的切片架中，孵育30分钟，确保完全浸没；重复一次。 
		注意：此时应进行肉眼检查，以确保组织切片中无脂肪组织和石蜡残留。若仍可见脂肪组织或石蜡，应将玻片重新浸入二甲苯中。操作时需谨慎，尽量减少二甲苯暴露时间，以免引起组织收缩。</li>
		<li>在含有100%乙醇的切片缸中复水组织，每次10分钟，重复一次。</li>
		<li>将切片转移至含有95%乙醇的切片缸中，孵育10分钟。重复一次。</li>
		<li>将载玻片移至含有75%乙醇的染色缸中，放置5分钟。</li>
		<li>将载玻片转移至含有50%乙醇的玻片缸中，孵育5分钟。</li>
		<li>将10 mM柠檬酸钠溶液（pH 6.0）在电热板或微波炉中煮沸，倒入考普林瓶中。 
		警告：加热溶液时需密切监控，注意防止暴沸。容器将变得非常烫，应使用防护措施以避免烫伤。</li>
		<li>将切片缓慢放入考普林瓶中，确保完全浸没，于100 °C孵育10分钟以恢复表位。取出后小心干燥切片。</li>
		<li>用疏水性标记笔在组织周围画出屏障。加入足量内源性酶阻断剂（过氧化氢和叠氮化钠，可商业获取），以覆盖组织，孵育10分钟。</li>
		<li>将载玻片浸入1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，孵育10分钟。</li>
		<li>加入足量的10%驴血清至1×PBS中以覆盖组织，在湿盒中室温孵育1小时。 
		注意：实验可在此处暂停，将载玻片置于湿润孵育盒中于 4 °C 过夜保存。尽管驴血清被发现可产生最佳染色效果，研究者也可尝试其他血清（如牛血清白蛋白（BSA）、山羊血清或马血清）以确定最佳条件。若使用 BSA，研究者应在使用前新鲜配制。</li>
		<li>倾去切片上多余的封闭液，将用1%血清适当稀释的一抗直接加至切片上，确保组织被溶液均匀覆盖。在湿盒中室温孵育30分钟。 
		注意：此步骤可根据需要延长孵育时间，将湿盒置于 4 °C 保存。务必设置适当的阴性对照切片（例如 无一抗的切片，已知抗原阴性组织 等等。）在此步骤中。</li>
		<li>小心地用约1 mL去离子水冲洗载玻片2O过组织，于1×PBS中孵育5分钟，期间更换一次PBS。</li>
		<li>弃去多余的PBS，加入足量的辣根过氧化物酶标记物以覆盖组织，在湿盒中孵育30分钟。 
		注意：在此步骤中，研究者可选择使用荧光标记的二抗进行荧光染色。若需进行荧光染色，应相应调整下述步骤。</li>
		<li>小心地用约1 mL去离子水冲洗载玻片2O过组织，用1×PBS更换一次，孵育5分钟。</li>
		<li>按照制造商建议的比例配制二氨基联苯胺（DAB）显色液，并用涡旋振荡器混匀。 
		注意：除本方案所用试剂盒外，市面上还可购得多种即用型试剂盒。</li>
		<li>从切片上倾去多余的缓冲液，直接向组织滴加2-3滴（10–50 µL）显色剂，于湿盒中孵育5分钟。用约1 mL去离子水轻轻冲洗切片2O 过组织。 
		警告：DAB显色剂具有高度毒性。避免染色剂与皮肤直接接触，并将废液收集至危险废物容器中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>苏木精和伊红（H&amp;#38;E)
	<ol>
		<li>染色剂孵育后的最后一次漂洗完成后，将切片浸入 Harris 苏木精液中 2-2.5 分钟。用自来水轻轻冲洗切片 1-2 分钟。 
		注意：避免将水流直接喷射到组织上。</li>
		<li>将切片浸入分化液（100 mL 70%乙醇中含0.25 mL盐酸）中2-3秒。用自来水轻轻冲洗切片约1-2分钟。</li>
		<li>将载玻片浸入蓝色试剂（100 mL 自来水中含 4.5 mg 碳酸钙，pH 调至 9.4）中 60 秒。用 95% 乙醇冲洗载玻片 30 秒。</li>
		<li>将载玻片浸入醇溶伊红Y染液中染色2-3分钟。</li>
		<li>在95%乙醇中更换两次，每次1分钟，对组织进行脱水。</li>
		<li>在100%乙醇中脱水1次，每次1分钟。</li>
		<li>用无绒布小心擦干载玻片。向载玻片滴加1滴（约100–200 µL）合成性、非水性、树脂基封片介质，然后加盖盖玻片。 
		注意：如果选择了不同的染色方法，可能需要使用不同的封片介质。例如，如果研究者选择了荧光标记的二抗，则更适合使用水溶性封片剂。</li>
		<li>让载玻片在室温下静置过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>苦味酸-天狼星红（PSR）染色
	<ol>
		<li>选择待染色的切片，并按照免疫组织化学实验方案进行至第6步（50%乙醇浸泡）。</li>
		<li>将切片浸入PSR染液中染色1小时。</li>
		<li>将载玻片浸入0.5%乙酸中1-2秒，重复两次以分化染色。</li>
		<li>用95%乙醇分两次脱水，每次1分钟。</li>
		<li>用100%乙醇脱水组织，更换一次，持续1分钟。</li>
		<li>用100%二甲苯短暂浸泡约3-4秒以清除玻片。</li>
		<li>用无绒布小心擦干载玻片。向载玻片滴加1滴（约100–200 µL）合成性、非水性、树脂基封片介质，盖上盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 样品分析
<ol>
	<li>导管分析
	<ol>
		<li>选择经 α-SMA 染色的切片。使用配备相机连接镜头的光学显微镜，以 20 倍放大倍数采集具有代表性的图像。</li>
		<li>使用 ImageJ（NIH）区分并计数每张图像中的导管。可手动计数，也可为单个导管分配数值评分。若要进行数值评分，打开 ImageJ 后选择 Plugins，然后选择 Analyze，并从下拉菜单中选择 Cell Counter。点击 Initialize，然后高亮 Type 1 以开始标记导管。完成后，选择 Results 查看导管计数结果。 
		注意：务必确认结构为导管而非血管。</li>
		<li>在“设置测量”选项中，勾选“周长”和“面积”&#34;.</li>
		<li>使用手绘多边形工具，在每个导管的肌上皮区室（通过α-SMA染色辅助识别）周围绘制轮廓。选择“测量”功能，记录周长和面积。</li>
		<li>再次使用自由多边形工具，在管腔内部沿导管上皮的顶端侧绘制一条线。选择“测量”以记录周长和面积。</li>
		<li>用肌上皮区室的周长减去管腔区室的周长，以得到导管上皮的周长。用肌上皮区室的面积减去管腔区室的面积，以得到导管上皮的面积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫组织化学分析
	<ol>
		<li>将明场图像上传至分析软件，例如 ImageJ 或 FIJI Suite。 
		注意：本方案概述了使用 ImageJ 及 IHC Toolbox 插件进行染色分析的步骤。</li>
		<li>从插件菜单中打开 IHC 工具箱。在 &#34;选择模型&#34; 下拉框打开后，选择适当的染料（即 H-DAB，PSR 等等。）。选择 &#34;颜色&#34; 选择分离染色。这将打开一个结果窗口。 
		注意：如果目标蛋白位于细胞外或胞质空间，或与质膜结合，则该方法适用。如果目标蛋白位于细胞核内，应选择 &#34;细胞核&#34; 将提示插件分析图像中呈阳性染色的细胞核。</li>
		<li>使用颜色选择滑块，确保准确分离染色区域，避免包含背景信号或过度排除染色信号。 
		注意：如果自动模式无法检测到染色区域或未能生成可接受的图像，请在已识别的染色区域上绘制一个方形感兴趣区域（ROI）。在 IHC Toolbox 窗口中，选择 &#34;训练&#34; 以引导插件指向适当的目标。</li>
		<li>将图像转换为16位。前往 图像 → 类型 → 16 位</li>
		<li>对图像进行阈值处理。前往 图像 → 调整 → 自动阈值。</li>
		<li>通过在图像的标尺上直接绘制一条线形感兴趣区域（ROI），然后指定其长度，以设定图像测量比例尺。要设置比例尺，请前往 分析 → 设置比例尺 输入每个期望长度单位所对应的像素数量（例如 每50 µm 120像素</li>
		<li>测量所得区域的面积和平均灰度值。前往 分析 → 设置测量 并单击以收集测量数据 分析 → 测量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种用于分离完整小鼠乳腺组织的方法，以便对细胞外基质（ECM）表达和导管形态进行后续组织学分析。在导管形态分析方面，该方法能够基于染色的组织切片快速评估导管结构。其他导管分析方法依赖于染料注射以实现导管树的可视化，而这些方法可能在技术上具有挑战性且耗时较长。
在乳腺癌中，已有报道称细胞外基质（ECM）存在异常1,2,6,9。具体而言，ECM的丰度和/或交联模式的改变已被报道可影响肿瘤进展、转移及治疗耐药性3,4,6,7,<sup class="...

乳腺癌的特征之一是存在显著程度的组织纤维化1,2,3,4。这种非细胞成分被称为细胞外基质（ECM），在所有组织中均以不同程度存在，主要由纤维性和非纤维性胶原蛋白、弹性蛋白、糖蛋白以及被隔离于该基质中的多种信号分子构成的复杂网状结构组成。在稳态条件下，ECM 的沉积与降解受到严格调控5。在乳腺肿瘤发生过程中，ECM 的沉积与降解平衡被打破。因此，已有报道指出乳腺肿瘤会大量表达多种 ECM 蛋白，如胶原蛋白、纤连蛋白和腱生蛋白-C 等6。这些蛋白质的异常表达，以及基质交联模式的增加，已被证实可促进乳腺肿瘤的进展、转移及治疗耐药性1,3,4,7,8,9。
为评估细胞外基质（ECM）成分和导管形态，需分离完整乳腺组织。本研究采用雌性未产、缺乏小窝蛋白-1（caveolin-1）的小鼠，该蛋白是一种跨膜蛋白，已被证实与侵袭性乳腺肿瘤特征相关10,11,12，同时使用雌性未产的B6对照小鼠。通过对这些组织进行组织学处理和染色，可鉴定多种细胞外基质蛋白，并对导管形态进行表征。
总体而言，分离完整乳腺组织使研究人员能够研究在外界或内在因素作用下组织层面的形态学或细胞变化。该技术的局限性在于其分析依赖于二维（2D）组织切片，而非三维（3D）视角，而后者能更全面地呈现导管树复杂形态的全貌。鉴于乳腺组织中细胞间及细胞与细胞外基质（ECM）间相互作用的复杂性，分离完整的乳腺组织对于高效分析小鼠乳腺不同区域的导管形态和蛋白质表达具有显著优势。

<table><tbody><tr><td>光学显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>显微镜相机</td><td>Olympus</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td>Olympus</td><td>cellSens Entry software</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>3.5x-R 外科手术显微放大镜</td><td>Rose Micro Solutions</td><td></td><td>根据研究人员的偏好选择放大倍数</td></tr><tr><td>梅奥剪刀</td><td>Medline</td><td>DYND04035</td><td></td></tr><tr><td>染色架</td><td>Fisher Scientific</td><td>121</td><td></td></tr><tr><td>染色皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>112</td><td></td></tr><tr><td>科布林瓶（Coplin Jar）</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-4</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>根据组织大小选择合适尺寸</td></tr><tr><td>IHC EnVision+ 试剂盒（HRP，小鼠，DAB+）</td><td>Dako</td><td>K400611-2</td><td></td></tr><tr><td>苦味酸天狼星红染色试剂盒</td><td>Abcam</td><td>AB150681</td><td></td></tr><tr><td>醇溶伊红 Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>哈里斯苏木精染液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HHS16</td><td></td></tr><tr><td>驴血清</td><td>EMD Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯，试剂级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，200 证明</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792780</td><td>适用于分子生物学</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，1x</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202932</td><td></td></tr><tr><td>永久封片介质</td><td>Dako</td><td>S1964</td><td></td></tr><tr><td>EuKitt 封片介质</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>AB23750</td><td></td></tr><tr><td>腱生蛋白-C 抗体</td><td>Abcam</td><td>AB108930</td><td></td></tr><tr><td>α-平滑肌肌动蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>AB124964</td><td></td></tr><tr><td>Dako Envision 双链系统 HRP</td><td>Dako</td><td>K4065</td><td></td></tr></tbody></table>

完整小鼠乳腺腺体的分离及其细胞外基质表达与腺体形态学分析

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

本实验的目的是采集雌性未产小鼠的第4对腹乳腺，以评估细胞外基质（ECM）的表达及导管结构。操作中使用梅奥剪刀在皮肤下方创建一个小腔隙，从而将皮下组织中的乳腺与下方的腹膜分离。借助3.5倍外科手术显微放大镜可更清晰地观察腺体。将皮张翻转并固定，以便识别完整的乳腺脂肪垫。使用解剖刀片在皮下层与腺体之间横向滑动，对每一对第4腹乳腺进行钝性解剖分离。采集后立即将其置于10%中性缓冲福尔马林溶液中，用于后续组织处理。完整切除整个腺体的优势在于，可最大程度避免遗漏导管上皮细胞与其他微环境细胞群体之间重要的组织层面相互作用，而这些信息在部分活检样本中可能被忽略。该方法的一个局限性在于使用固定组织的连续切片，这使得对导管形态发生和蛋白表达的分析仅限于腺体内的特定位置，因此难以获得导管结构和蛋白表达在三维（3D）空间中的变化情况。总体而言，该技术适用于需要完整小鼠乳腺组织进行下游研究的实验，例如发育过程中的导管形态发生或乳腺癌相关研究。

雌性小鼠有5对乳腺，具体包括一对颈乳腺（#1）、两对胸乳腺（#2和#3）、一对腹乳腺（#4）以及一对腹股沟乳腺（#5）。图1A）。在此，我们分离了第4对腺体，因为它们易于识别。在某些情况下，由于第4与第5对腺体难以区分，因此将两者一并分离。为获取完整的第4对腹部乳腺，将皮瓣固定并小心地与下方腹膜分离，从而暴露由箭头所示的第4对腺体位置（图1B). 小心切除第4对腺体，并检查是否存在任何残留的皮下或肌肉组织。尽管在我们分离的腺体中未发现此类组织（图1C），我们确实注意到，在未切除组织而直接切片的组织块中，经纤维连接蛋白染色的腺体显示出明显更多的皮下组织例如 浅层）（图1D）与含有100-...

本文介绍了一种分离完整小鼠乳腺组织以研究细胞外基质（ECM）表达及导管形态的实验方案。从小鼠第4对腹部乳腺中获取8至10周龄未产雌性小鼠的乳腺组织，经中性缓冲甲醛固定后进行切片，并采用免疫组织化学方法对细胞外基质蛋白进行染色。

本实验的目的是采集雌性未产小鼠的第4对腹部乳腺，以评估细胞外基质（ECM）的表达及导管结构……

本全乳腺组织收获技术的总体目标是促进对完整乳腺组织离体后组织学形态的分析。该方法有助于回答肿瘤生物学领域中的关键问题，例如肿瘤中基质组织如何被重塑，或异常的基因或蛋白表达如何改变乳腺导管结构。该技术的主要优势在于，它使研究人员能够对健康和患病小鼠的完整乳腺组织中的蛋白表达水平及导管结构进行表征与定量分析。本技术的示范者为我实验室的研究生 Chris Thompson。根据文本方案，处死8至10周龄的雌性未产小鼠后，将尸体仰卧固定，并用70%乙醇浸润。用镊子夹住阴阜上方的皮肤，再用小型手术剪将其剪开。然后，旋转剪刀，沿腹侧中线从尾端向头端方向剪开皮瓣。使用较大的剪刀或止血钳，沿两侧钝性分离皮下筋膜，注意避免刺破腹膜。在切口两端的远端水平边缘处进行剪切。接下来，将皮瓣固定张开，并用 PBS 喷洒组织以保持湿润。然后，找到目标乳腺，将手术刀片沿皮瓣内侧滑动，将乳腺及其相关的皮下脂肪从真皮层上分离下来。在分离腹部腺体与腹股沟腺体之前，需尽可能清晰地辨认各腺体。立即将新分离的腺体浸入含有约六毫升10%中性缓冲福尔马林溶液（溶液体积与组织体积比为10:1）的锥形管中，孵育24至48小时。根据文本方案，脱去切片上的石蜡并进行切片复水后，将10毫摩尔柠檬酸钠溶液在电热板上或微波炉中煮沸，然后倒入Coplin染色缸中。将切片缓慢放入Coplin染色缸内，确保完全浸没，于100摄氏度孵育10分钟，以进行抗原修复。然后，取下玻片并小心干燥。接着，用疏水性标记笔在组织周围画出屏障。待其干燥后，用 PBS 冲洗玻片一到两秒。然后，加入足量内源性酶阻断剂以覆盖组织，将切片孵育10分钟。将切片浸入1× PBS中，孵育10分钟。接着，加入足量10%驴血清与PBS混合液以覆盖组织，在湿盒中室温孵育样本1小时。将切片上多余的封闭液倾去，直接加入用1%血清适当稀释的一抗，确保组织被溶液均匀覆盖。将切片置于湿盒中，室温孵育30分钟。用约一毫升去离子水轻轻冲洗切片上的组织，然后将切片在一份1×PBS溶液中孵育5分钟。倾去多余的PBS，加入足量的辣根过氧化物酶标记的二抗，将样本置于湿盒中孵育30分钟。用约一毫升去离子水轻轻冲洗载玻片上的组织，然后将组织在1X PBS中更换一次缓冲液，孵育5分钟，操作同前。配制DAB增强型显色液后，倾去载玻片上多余的缓冲液，直接向组织滴加2至3滴显色液。将样本置于湿盒中孵育五分钟。然后，小心地将约一毫升去离子水流过组织，以洗涤载玻片。在显色剂孵育后的最终漂洗步骤完成后，将载玻片浸入 Harris 苏木精液中染色两至两分半钟。然后，用自来水轻轻冲洗载玻片1到2分钟。将载玻片浸入分化液中2到3秒。接着，再次用自来水轻轻冲洗载玻片约1到2分钟。将切片浸入蓝色试剂中60秒。随后用95%乙醇冲洗切片30秒。将切片转移至醇溶性伊红Y中染色2至3分钟，然后将组织置于两份95%乙醇中脱水，每次1分钟。然后，最后用100%乙醇脱水一次，持续一分钟。用无绒布小心擦干载玻片。接着，向载玻片上滴加一滴合成的、非水性树脂封片介质，并加盖盖玻片。为了进行导管分析，选择经α-SMA染色的切片。然后，使用配备有相机连接物镜的光学显微镜，在20倍放大倍数下采集具有代表性的图像。对每张图像中的导管进行计数时，可采用手动计数，或打开ImageJ软件并选择插件进行分析。接下来，选择“分析”，然后从下拉菜单中选择细胞计数器。单击“初始化”，随后高亮“类型一”以开始标记导管。完成后，选择“结果”以查看导管数量。首先使用线条工具在图像的比例尺上画一条线。然后点击“分析”并设置比例尺。在下一个窗口中，在“已知距离”栏输入距离数值，并在“长度单位”栏输入相应的单位。然后，点击“确定”。接下来，在“设置测量选项”中，勾选面积和周长。随后，使用自由多边形工具，在每个导管的肌上皮区周围绘制轮廓线。选择“测量”，并记录周长和面积。再次使用自由多边形工具，在管腔内部沿导管上皮的顶端侧绘制一条线。然后，选择“测量”，并记录周长和面积。用肌上皮区室的面积减去管腔区室的面积，得到导管上皮的面积。用肌上皮区室的周长减去管腔区室的周长，得到导管上皮的周长。进行免疫组织化学分析时，将明场图像上传至分析软件，例如 ImageJ 或 Fiji Suite。在 ImageJ 的插件菜单中打开 IHC 工具箱。在随后打开的“选择模型”下拉框中，选择适当的染色类型。选择颜色选项以分离该染色。这将打开一个结果窗口。使用颜色选择滑块，确保染色区域被正确分离，避免包含背景或过度排除染色信号。转到图像类型，选择16位，将图像转换为16位。然后，通过点击图像，调整阈值来对图像进行阈值处理。最后，进入分析，设置测量以测量所得面积和平均灰度值，并选择分析，测量，以收集数据。在这些固定的第四乳腺组织切片中，分析了胶原蛋白、纤连蛋白和腱生蛋白-C的表达。箭头指示这些组织中导管的存在。为了定量分析导管的形态学特征，必须谨慎处理组织学切片，因为不当操作可能导致组织和导管受损，从而无法进行测量。此处展示了一个不能用于分析的受损组织示例。本图展示了一个结构完整的组织标本，其中导管可被测量和定量。这些导管不仅由周围纤维连接蛋白染色的间质组织所界定，还表现为导管腔内衬有密集的上皮细胞群。在此张纤维连接蛋白染色切片中，多个完整的导管可见分支结构，由箭头指示。在进行此项分析时，不应将这些导管分支视为独立的导管结构。在评估和测量导管时，重要的是区分导管结构与血管结构。血管结构由红色箭头指示，导管结构由黑色箭头指示。血管结构不仅可以通过管腔内衬的单层内皮细胞来识别，还可以通过管腔内无核、嗜酸性结构的存在来识别，这些结构提示有红细胞。一旦掌握，每只动物的组织取材大约可在15分钟内完成，切片染色约需7至8小时，若操作得当，次日即可拍摄载玻片图像。在进行这些操作时，重要的是要记住，实验的具体目标可能需要在特定步骤中进行优化。完成此操作后，还可进行其他方法，如二次谐波生成或相干反斯托克斯拉曼散射，以进一步探究组织间质的组成或结构问题。该技术建立后，为肿瘤生物学等多个领域的研究人员提供了探索多种人类疾病及病理动物模型中组织结构和蛋白质表达模式的途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何解剖并分离小鼠乳腺组织。还应了解组织切片免疫组化染色的操作流程，包括复染剂的使用。请注意，操作动物及其组织以及二甲苯和DAB显色剂等化学品时可能存在极高风险，因此在进行这些操作时，必须采取适当防护措施，例如接受规范的动物饲养培训并使用个人防护装备。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

完整、全小鼠乳腺的分离及细胞外基质表达及腺体形态学分析

本方法介绍了如何对小鼠乳腺组织进行解剖，并评估其发育情况和功能。通过整体封片法评估切除的乳腺组织的发育程度，同时采用基于催产素的肌上皮细胞收缩实验来评价泌乳功能。...

小鼠模型中乳腺发育与功能的评估

采用延时成像技术来评估源自乳腺癌风险转基因小鼠模型的原发性癌前乳腺上皮细胞的行为，以确定特定行为参数与不同基因损伤之间是否存在相关性。...

乳腺癌基因工程小鼠模型来源的原发性癌前乳腺上皮细胞的延时成像

本文所述的间接免疫荧光实验方案可用于检测和定位小鼠乳腺组织中的蛋白质。文中提供了完整的实验方法，包括乳腺组织样本的制备、免疫组织化学染色、荧光显微镜下组织切片的成像，以及图像的重建。...

小鼠乳腺组织冰冻切片的间接免疫荧光染色

本方案描述了从非贴壁/间充质型乳腺上皮细胞中分离、定量和表征细胞外囊泡（EVs）/外泌体的方法，并介绍了利用这些囊泡将乳腺腺体形成能力转移至管腔型乳腺上皮细胞的技术。来源于具有干细胞样特性的乳腺上皮细胞的EVs/外泌体，能够将此类细胞特性传递给摄取这些EVs/外泌体的细胞。...

通过细胞外囊泡/外泌体在乳腺基底上皮细胞与乳腺腔上皮细胞之间转移乳腺腺体形成能力

啮齿类动物乳腺发育通常通过描述性评估或测量基本物理特征来进行评价。分支密度是乳腺发育的一个指标，但难以进行客观量化。本方案描述了一种可靠的方法，用于定量评估乳腺腺体的分支特征。...

使用Sholl分析法对大鼠乳腺全组织切片中的分支密度进行定量

我们建立了一种方法，可成功地将原本以整体封片方式固定的乳腺组织进行取材、处理、切片和染色，用于组织病理学评估。该方法可能促进在生殖和发育毒性试验指南研究中对乳腺腺体整体封片的采集与评估。...

切片乳腺组织整体标本以识别病灶

乳腺是一种双层结构，由外层的肌上皮细胞和内层的腔面 epithelial...

通过差异性胰蛋白酶消化法生成嵌合型乳腺类器官

本文所述的活体成像方法利用胶原蛋白的二次谐波生成以及代谢辅因子NAD(P)H的内源性荧光，对未标记的肿瘤微环境进行无创分割，将其划分为肿瘤、间质和血管等区域，从而实现对4D活体成像数据的深入分析。...

一种用于活体成像乳腺肿瘤微环境的无标记分割方法

本实验方案描述了一种利用激光扫描共聚焦显微镜和多光子显微镜对哺乳期小鼠乳腺进行活体成像的简便技术。...

活体乳腺组织亚细胞显微成像

本方案介绍了一种通过差速离心法从原代正常及肿瘤乳腺组织中生成上皮类器官的方法。此外，还包括对包埋类器官进行三维培养以及免疫荧光成像的操作说明。...

无需传代培养的小鼠与人正常及肿瘤乳腺组织上皮类器官的生成与成像

本方案描述了一种可扩展的导管内CRISPR筛选方法，可实现并行 体内...

平行 体内 小鼠乳腺中基因敲除与激活的筛选

学习完整分离小鼠乳腺并进行组织学分析的方法，用于评估细胞外基质蛋白表达和导管结构。该技术适用于发育生物学和肿瘤研究，支持对健康和病变组织的定量分析。

完整小鼠乳腺腺体的分离及其细胞外基质表达与腺体形态学分析

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