一种从慢性活动性EB病毒 感染患者建立NK和T细胞系的高效简便方法

本实验的总体目标是从慢性活动性EB病毒感染（CAEBV）患者中获得NK细胞或T细胞系，这对于研究这种致命性疾病具有重要意义。该方法有助于获取NK或T细胞系，用于研究CAEBV的发病机制，例如分析EB病毒对细胞增殖的影响，筛选能够抑制NK/T细胞增殖的抑制剂。该技术的主要优势在于操作简便、效率高，仅需少量外周血及低剂量的白细胞介素-2，即可成功建立来自CAEBV患者的NK或T细胞系。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为培养最初两周的细胞存活情况具有不确定性，而本方法将指导您如何确定早期培养阶段的细胞增殖情况。当我们首次提出该方法时，我们发现人血清铁二可将外周血单个核细胞（PBMC）维持培养长达两周。本方法的演示至关重要，因为它能够展示细胞的形态及其增殖的原因。

然后进行细胞的扩增并计数Y-bar细胞。开始此操作时，通过密度梯度离心法从传染性单核细胞增多症病毒（CAEBV）患者的2毫升全血中分离外周血单个核细胞（PBMC）。或者，将保存于液氮中的冻存PBMC用RPMI-1640培养基解冻。接着，将2微升0.4%台盼蓝加入18微升细胞悬液中，染色3分钟，随后将悬液转移至细胞计数板，使用自动细胞计数仪测定细胞浓度和活率。

将细胞悬液配制为每毫升含2×10⁶至3×10⁶个细胞的密度，加入含20%人血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺及抗生素的完全RPMI-1640培养基。随后，将1毫升PBMC悬液接种至24孔细胞培养板的每个孔中。接着，向每孔中加入150单位/毫升的重组人IL-2（rhIL-2）。

将培养皿置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中。第二天，在200倍显微镜下观察细胞形态。当细胞呈明亮且圆形时，表明细胞状态良好。

在此步骤中，向18微升细胞悬液中加入2微升0.4%台盼蓝，计算细胞浓度。接着，在更换培养基前，通过细胞计数观察细胞形态并监测细胞生长状态。监测细胞形态和生长状态非常重要。

我们可以通过培养早期阶段的多形性细胞及细胞状态来判断细胞是否存活。随后，从24孔板的每个孔中移除500 µL培养基，并向其中加入500 µL新鲜的完全培养基。然后向每孔加入150 单位/毫升的rhIL-2。

每周更换两次培养基。绘制细胞生长曲线。当活细胞浓度超过每毫升5 × 10⁶个细胞时，将细胞以每毫升1 × 10⁶至2 × 10⁶个细胞的浓度分种到新的孔中。

该过程需要两到四周。当细胞扩增后，收集1 × 10⁶个细胞以确定细胞系的表型。在室温下以240 × g离心五分钟，沉淀NKNT细胞。

随后，弃去上清液，加入7毫升PBS洗涤沉淀。在室温下以240 × g离心5分钟。重复此步骤一次后，向每根试管中加入200微升人血清，充分混匀，并在室温下孵育10分钟。然后在室温下以240 × g离心5分钟。

弃去上清液，用预冷的PBSA缓冲液重悬细胞，使细胞浓度为每毫升1×10⁶个细胞。随后，将细胞分装至五个离心管中，每管含2×10⁵个细胞。接着，在4°C条件下以240×g离心5分钟。弃去上清液，用PBSA缓冲液或含有10 µL PE标记抗体和10 µL FITC标记抗体的PBSA缓冲液重悬细胞，置于冰上孵育，以标记T细胞或NK细胞的细胞表面受体。

使用 PBSA 缓冲液悬浮的细胞作为阴性对照。接下来，将细胞与抗体在冰上避光孵育 20 至 30 分钟。用预冷的 PBSA 洗涤细胞两次，然后在使用流式细胞仪分析前，将细胞重新悬浮于 300 微升预冷的 PBSA 中。

当完成细胞表型分析后，小心移除一半上清液，避免触碰培养板底部的细胞。向培养板中加入等体积含有300单位/毫升rhIL-2的新鲜培养基，之后每三天更换一半培养基，直至在显微镜下可清晰观察到细胞簇。随后，将同一系列不同孔中的细胞混合后，从24孔板转移至T-25培养瓶中。

当培养基变黄时，将其体积加倍，直至培养基体积扩大至10至15毫升。随后，加入浓度为150单位/毫升的rhIL-2。在培养两到三周、肉眼可见细胞团块后，于冻存前24小时更换培养基。

使用细胞计数器测定细胞浓度。随后，将细胞悬液在240 × g条件下离心5分钟，并用冷冻储存液重新悬浮细胞沉淀，细胞密度为每毫升5×10⁶至10×10⁶个细胞，冷冻储存液含有90%胎牛血清和10%二甲基亚砜（DMSO）。以每分钟1°C的速率将细胞冻存至-80°C，然后直接转移至液氮中保存。

细胞系建立后培养三天，开始出现多形性细胞。培养七天后，细胞数量和活力均快速增加，细胞生长迅速。培养10至14天后，细胞浓度超过每毫升3×10⁶至6×10⁶时，可清晰观察到细胞形成的小细胞簇。

在此期间，细胞应通过分裂扩增至培养板中的两到三个孔。大约一个月后，当细胞数量达到 3 × 10⁷ 至 5 × 10⁷ 时，数量已足够用于保存。另一个重要问题是确定细胞成功培养后的表型。

我们的结果表明，T细胞和NK细胞可通过上述方法进行培养，并可利用该技术建立细胞系，因为细胞在良好状态下生长超过三个月。该方法、该技术还可进一步拓展应用。其操作简便，易于正确实施。

在进行该实验操作时，重要的是要牢记PBMC的变异性。对于本实验，可采用MTT法检测试剂盒8等方法，以回答其他相关问题，例如可能用于过继性免疫治疗的NK细胞或T细胞系的毒性。每次实验改进后，该技术将为CAEBV领域的研究人员探索EBV相关NK/T细胞在细胞模型系统中涉及致病机制提供途径。

观看本视频后，您应充分了解如何根据本方案建立并扩增NK细胞和T细胞系。请务必注意，操作病原体可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，必须始终采取适当的防护措施。