Name: 慢性活性泼斯坦-巴尔病毒感染患者 NK 和 T 细胞系建立的高效简便方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 了解从慢性活性EB病毒感染者外周血中高效建立NK和T细胞系的简便方法。该技术仅需少量血液和低剂量IL-2，为研究CAEBV发病机制和细胞增殖提供可靠的细胞模型。

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本工作得到中国科学院重点部署项目（KFZD-SW-205）、中国科学院战略生物资源技术支撑体系（CZBZX-1 和 ZSSB-004）以及国家自然科学基金（81401640）和&#160; 上海市自然科学基金（14ZR1434800）的资助。

本研究经中国科学院遗传与发育生物学研究所伦理委员会批准，且研究方案遵循该机构关于人类福祉的指导方针。
注意：工作流程示意图参见图1。
1. CAEBV 患者外周血单个核细胞的分离
<ol>
	<li>通过梯度法从2 mL慢性活动性EB病毒感染（CAEBV）患者的全血中纯化原代外周血单个核细胞（PBMC）例如，Ficoll-plaque）密度梯度离心法，具体操作按照制造商说明书进行。或者，将冻存在液氮中的外周血单个核细胞（PBMC）用RPMI 1640培养基解冻。</li>
	<li>加入2 µL台盼蓝（0.4%）至18 µL细胞悬液中，静置3分钟以染色细胞，将悬液转移至细胞计数板，使用自动细胞计数仪测定细胞浓度和活率。</li>
	<li>将细胞悬液调整至密度为 2-3×106 每毫升细胞悬液中加入含20%人血清（56 °C热灭活）、2 mM L-谷氨酰胺和抗生素（100 µg/mL链霉素，100 U/mL青霉素）的完全RPMI 1640培养基。将1 mL外周血单个核细胞（PBMC）悬液接种至24孔细胞培养板的每个孔中。</li>
	<li>每孔加入 150 U rhIL-2。</li>
	<li>将培养皿置于5% CO₂培养箱中2 37 °C 培养箱中孵育。</li>
	<li>第2天，在显微镜下观察细胞形态（200倍放大）；当细胞呈明亮且圆形时，表明细胞状态良好。</li>
</ol>
2. 细胞扩增与活细胞计数
<ol>
	<li>在显微镜下观察细胞形态（200倍放大），并在更换培养基前通过细胞计数监测细胞生长状态：取18 µL细胞悬液加入2 µL台盼蓝（0.4%），计算细胞浓度（见1.2节，图2）。</li>
	<li>弃去24孔板中每孔500 µL培养基，加入500 µL新鲜的完全培养基，每孔添加150U重组人IL-2（rhIL-2）。</li>
	<li>按照步骤2.2的方法，每周更换两次培养基。</li>
	<li>绘制细胞生长曲线（图3）。</li>
	<li>当活细胞浓度超过5×106/mL时，将细胞以每孔1-2×106个细胞/mL的浓度传代至新的孔中。该过程需要2-4周。</li>
</ol>
3. 通过流式细胞术进行细胞表型分析
<ol>
	<li>当细胞扩增后，收集 1×106 个细胞以确定细胞系的表型。在室温下以 240 x g 离心 5 分钟（NK/T 细胞将沉淀至管底）。</li>
	<li>弃去上清液，加入 7 mL PBS 重悬沉淀。在室温下以 240 x g 离心 5 分钟。重复一次。</li>
	<li>向每管中加入 200 µL 人血清，充分混匀，并在室温下孵育 10 分钟。</li>
	<li>在室温下以 240 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，用冷 PBSA（PBS + 0.2% BSA）将细胞重悬至 1×106/mL。将细胞分至 5 支管中，每管含 2×105 个细胞。</li>
	<li>在 4 °C 下以 240 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，用 PBSA 缓冲液或含 10 µL PE（或 PE-Cy7）和 10 µL FITC 标记抗体的 PBSA 重悬细胞，在冰上染色 T 或 NK 细胞的细胞受体，如 图 4 所示。仅用 PBSA 缓冲液重悬的细胞作为阴性对照。</li>
	<li>在冰上避光孵育细胞与抗体 20–30 分钟。</li>
	<li>用冷 PBSA 洗涤细胞两次，最后用 300 µL 冷 PBSA 重悬细胞。</li>
	<li>使用流式细胞仪分析细胞表型。
	<ol>
		<li>在 &#34;创建工作表&#34; 条件下设置流式细胞仪。使用点图（dot plot）设置实验模板，显示前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）。</li>
		<li>加载同型对照管，优化 FSC 和 SSC 电压，并调整 FSC 阈值，以去除碎片信号，同时不干扰目标细胞群。删除除 FSC、SSC、FITC、PE 和 PE-Cy7 之外的所有参数。</li>
		<li>在每组双色分析中，使用同型对照和单一阳性对照进行补偿调节。</li>
		<li>加载样本，创建 HLA-DR 对 CD19、CD4 对 CD8、CD56 对 CD16 以及 CD3 对 CD16 的点图，以显示不同细胞亚群。 
		注：使用 PBMC 进行补偿调节，采用阴性/同型对照和单一阳性对照。常规使用流式细胞仪进行双色免疫荧光分析，以检测表面标志物的表达。所用抗体包括：抗 HLA-DR、抗 CD4、抗 CD16 与异硫氰酸荧光素（FITC）偶联、抗 CD8、抗 CD56、抗 CD3 与藻红蛋白（PE）偶联，以及抗 CD19 与 PE-Cy7 偶联。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. NK/T 细胞的扩增与冷冻保存
<ol>
	<li>完成细胞表型分析后更换培养基。小心移除一半的上清液，避免触碰培养板底部的细胞。向细胞培养板中加入等体积含有300 U/mL重组人IL-2（rhIL-2）的新鲜培养基。</li>
	<li>每3天更换一半培养基（同2.2步骤），直至显微镜下可清晰观察到细胞簇（图2）。该过程通常需要2-3周。</li>
	<li>将同一条系的不同孔中的细胞混合后，从24孔板转移至T25培养瓶。当培养基变黄时，将培养基体积加倍，直至总体积达到10-15 mL，并加入终浓度为150 U/mL的rhIL-2。</li>
	<li>在培养2-3周、肉眼可见细胞团块后，于冻存前24小时更换培养基。使用细胞计数仪测定细胞浓度。</li>
	<li>将细胞悬液在240 × g条件下离心5分钟，用冷冻保存液重悬细胞沉淀，细胞密度为5-10 × 106 个细胞/mL，冷冻保存液含90%胎牛血清和10%二甲基亚砜（DMSO）。以每分钟降低1 °C的速率将样本降温至-80 °C，随后直接转移至液氮中保存。</li>
</ol>

<ol><li>Cohen, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus infection.</a> N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).</li>
<li>Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus-associated+lymphoproliferative+disease+in+non-immunocompromised+hosts%3A+a+status+report+and+summary+of+an+international+meeting%2C+8-9+September+2008%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008.</a> Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).</li>
<li>Oshimi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+and+managing+natural+killer-cell+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies.</a> Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).</li>
<li>Kawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+allergy+and+Epstein-Barr+virus-associated+T%2Fnatural+killer-cell+lymphoproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease.</a> Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).</li>
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<li>Tsuge, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-infected+natural+killer+%28NK%29+cell+proliferation+in+patients+with+severe+mosquito+allergy%3B+establishment+of+an+IL-2-dependent+NK-like+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line.</a> Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+cytological+and+cytogenetic+features+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-positive+natural+killer+%28NK%29+cells+and+cell+lines+derived+from+patients+with+nasal+T%2FNK-cell+lymphomas%2C+chronic+active+EBV+infection+and+hydroa+vacciniforme-like+eruptions%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions.</a> Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).</li>
<li>Oyoshi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+expansion+of+Vgamma9-JgammaP%2FVdelta2-Jdelta3+gammadelta+T+cells+in+nasal+T-cell+lymphoma+and+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).</li>
<li>Imadome, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mouse+xenograft+models+reveal+a+critical+role+of+CD4%2B+T+cells+in+the+proliferation+of+EBV-infected+T+and+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells.</a> PLoS Pathog. 7 (10), e1002326(2011).</li>
<li>Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphokine+requirement+for+the+generation+of+natural+killer+cells+from+CD34%2B+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells.</a> Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).</li>
<li>Spits, H., Yssel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+Human+T+and+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cloning of Human T and Natural Killer Cells.</a> Methods. 9 (3), 416-421 (1996).</li>
<li>Liu, X., Xu, C., Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Red+Blood+Cell+Lysis+Method+for+the+Establishment+of+B+Lymphoblastoid+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li>
<li>Kawabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+flow+cytometric+in+situ+hybridization+assay+to+Epstein-Barr+virus-associated+T%2Fnatural+killer+cell+lymphoproliferative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases.</a> Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).</li>
</ol>

D.Z.、X.Z. 和 X.C. 是正在申请的专利的共同发明人，该专利涉及本方法在建立NK/T细胞系及本研究中所建立的细胞系方面的潜在用途。D.Z.、X.Z. 和 X.C. 宣布在本工作中不存在竞争性财务利益。其余作者声明他们不存在竞争性财务利益。

本方案中，我们建立了一种从慢性活动性EB病毒感染（CAEBV）患者全血中分离NK/T细胞系的新方法。与现有方法相比，该方法的主要优势在于操作简便、仅需少量血液样本，同时具有较高的成功率和良好的细胞活力。此外，该方法无需在培养前预先确定潜伏感染EB病毒的细胞类型，因为此类鉴定过程会消耗更多的血液样本并延长前期准备时间。相反，可在建立细胞系后通过流式细胞术对细胞系进行分析，并分选不同表型的细胞。同时，该方法仅需使用低剂量重组人IL-2（rhIL-2），且无需饲养细胞。利用该方法，我们已从8例CAEBV患者中成功建立了7株细胞系，并在一个月内完成冻存。其中未能成功建系的一例样本仍可维持存活超过5个月，但无明显增殖，其背后机制尚需进一步研究。
需要注意的是，细胞生长严格依赖于重组人IL-2的存在，这一结果与既往报道一致。20,21；若无外源性人IL-2，细胞将在3周内死亡。显然，高质量的IL-2对细胞增殖至关重要，尽管决定细胞增殖能力的具体因素 体外 仍需...

EB病毒（EBV）普遍存在，不仅感染B细胞，还感染T细胞和自然杀伤（NK）细胞，从而导致多种EBV相关的NK/T淋巴细胞增殖性疾病（LPD）以及淋巴瘤/白血病，例如EBV相关性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症、痘疮样淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤鼻型以及侵袭性NK细胞白血病1,2,3。其中一种为严重的慢性活动性EB病毒感染（SCAEBV），主要发生于东亚地区，目前被认为是由EBV感染的T细胞或NK细胞克隆性扩增所致的一种淋巴细胞增殖性疾病4,5,6,7，但与传染性单核细胞增多症（IM）样症状不同，患者无明显免疫缺陷，而是表现为持续性或反复发热、肝脾肿大、淋巴结肿大、肝功能异常，以及外周血中EBV-DNA载量升高8,9。慢性活动性EB病毒感染（CAEBV）患者的预后较差10,11，其发病机制及EBV在其中的作用尚不明确。因此，来源于EBV相关NK/T淋巴细胞增殖性疾病和淋巴瘤的细胞系作为细胞模型，对于阐明EBV诱导NK或T细胞增殖的机制及其与白血病或淋巴瘤高发之间的关系具有重要意义。
迄今为止，已采用不同技术建立了多种细胞系12,13,14,15,16。人NK细胞系NK-YS来源于NK细胞淋巴瘤/白血病，通过与小鼠基质细胞系共培养作为饲养细胞，并在含20 U/mL浓度的重组人IL-2（rhIL-2）的条件下建立15。KAI3是另一株NK细胞系，来源于患有严重蚊虫过敏或慢性活动性EB病毒感染（SCAEBV）的患者，采用自体EB病毒转化的B细胞（即淋巴母细胞样细胞系，LCL）作为饲养细胞，并添加100 U/mL的rhIL-2建立16。SNK6和SNT8则通过向鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者的肿瘤组织中添加高剂量rhIL-2（700 U/mL）而获得12。采用类似技术，SNK-1细胞系由CAEBV患者外周血单个核细胞（PBMC）去除T细胞后，添加700 U/mL的rhIL-2培养建立13,17。SNT13和SNT15则是通过去除CD4+和CD8+细胞后建立的18。迄今为止，所有来自EBV相关NK/T淋巴增殖性疾病的T细胞和NK细胞系均采用该方法建立19。
上述现有方法的缺点包括使用饲养细胞、需要高剂量的IL-2、需使用多达10 mL全血，或需纯化NK/T细胞，而在临床实践中，由于在开始培养前必须验证EBV潜伏感染的细胞类型，这些步骤均极具挑战性。由于CAEBV主要发生在亚洲儿童中，10 mL血液在所有地区均不易获取。在本研究中，我们开发了一种新的简便方法，仅需2 mL全血、低剂量重组人IL-2（rhIL2），无需饲养细胞，即可通过培养CAEBV患者的外周血单个核细胞（PBMC）高效建立NK和/或T细胞系。该方法的成功率高，已被证实具有高效性和节省时间的优势。

<table><tbody><tr><td>人 HLA-DR FITC</td><td>BD</td><td>560944</td><td>FACS 用抗体</td></tr><tr><td>人 CD4 FITC</td><td>BD</td><td>555346</td><td>FACS 用抗体</td></tr><tr><td>人/非人灵长类 CD8 PE</td><td>BD</td><td>557086</td><td>FACS 用抗体</td></tr><tr><td>人 CD3 PE</td><td>BD</td><td>555340</td><td>FACS 用抗体</td></tr><tr><td>人 CD16 FITC 3G8</td><td>BD</td><td>555406</td><td>FACS 用抗体</td></tr><tr><td>人/非人灵长类 CD56 PE MY31</td><td>BD</td><td>556647</td><td>FACS 用抗体</td></tr><tr><td>人 CD19 PE-Cy7</td><td>BD</td><td>560728</td><td>FACS 用抗体</td></tr><tr><td>人 IL-2</td><td>Roche</td><td>11147528001</td><td></td></tr><tr><td>人血清</td><td>MRC</td><td>CCC118-125</td><td></td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td>SANYO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Techcomp</td><td>CT6T</td><td>用于离心</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>OLYMPUS CKX53</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>自动细胞计数仪</td><td>Countstar</td><td>IC 1000</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>24 孔细胞培养板</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>聚苯乙烯板</td></tr><tr><td>25 cm² 细胞培养瓶</td><td>Nest</td><td>707001</td><td>聚苯乙烯</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>细胞培养基组分</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>life</td><td>22400089</td><td>用于配制细胞培养基</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Amresco</td><td>374</td><td>细胞培养基组分</td></tr><tr><td>100 倍链霉素-青霉素溶液 BioRoYeeBRY-2309</td><td>BioRoYee</td><td>BRY-2309</td><td>细胞培养基组分</td></tr><tr><td>Ficoll paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>用于体外分离淋巴细胞</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>用于细胞冻存</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD</td><td>BD FACSAria II</td><td></td></tr><tr><td>软件</td><td>BD</td><td>BD FACSDiva 软件</td><td>用于 FACS 分析</td></tr></tbody></table>

一种从慢性活动性eb病毒 感染患者建立nk和t细胞系的高效简便方法

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

已有多种方法被用于从淋巴瘤或淋巴增殖性疾病患者中建立NK/T细胞系。这些方法通常需要使用饲养细胞、纯化的NK或T细胞，并采集多达10 mL的血液，或使用高剂量的IL-2。本研究提出一种高效且简便的新方法，仅需2 mL全血，通过在重组人IL-2（rhIL-2）存在下培养外周血单个核细胞（PBMC），即可建立NK和T细胞系。细胞可在两周内快速增殖，并可维持培养超过3个月。采用该方法，已成功建立了7株NK或T细胞系，成功率较高。该方法操作简便、结果可靠，适用于更多慢性活动性EB病毒感染（CAEBV）或NK/T细胞淋巴瘤病例的细胞系建立。

细胞系建立培养3天后，开始出现多形性细胞（图2）。培养7天后，细胞增殖迅速，细胞数量和活率均显著提高（图3）。培养10至14天后可明显观察到小的细胞簇，此时细胞浓度可超过3-6 × 106。在此阶段，应将细胞按两到三个培养孔的比例进行传代扩增。约一个月后，当细胞数量达到3-5×107时，即可进行保存。
另一个重要问题是确定细胞成功培养后的表型。我们的结果表明，T（L196）细胞和NK（M296）细胞可通过上述方法进行培养（图4），并且利用该技术可建立细胞系，因为这些细胞在良好状态下生长超过3个月。
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建立了一种高效获取慢性活动性EB病毒感染（CAEBV）患者NK细胞和T细胞克隆的简易方法，该方法仅需少量外周血和低剂量IL-2。

一种从慢性活动性EB病毒 感染患者建立NK和T细胞系的高效简便方法

已有多项方法被用于从淋巴瘤或淋巴增殖性综合征患者中建立NK/T细胞系。这些方法采用了……

本实验的总体目标是从慢性活动性EB病毒感染（CAEBV）患者中获得NK细胞或T细胞系，这对于研究这种致命性疾病具有重要意义。该方法有助于获取NK或T细胞系，用于研究CAEBV的发病机制，例如分析EB病毒对细胞增殖的影响，筛选能够抑制NK/T细胞增殖的抑制剂。该技术的主要优势在于操作简便、效率高，仅需少量外周血及低剂量的白细胞介素-2，即可成功建立来自CAEBV患者的NK或T细胞系。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为培养最初两周的细胞存活情况具有不确定性，而本方法将指导您如何确定早期培养阶段的细胞增殖情况。当我们首次提出该方法时，我们发现人血清铁二可将外周血单个核细胞（PBMC）维持培养长达两周。本方法的演示至关重要，因为它能够展示细胞的形态及其增殖的原因。然后进行细胞的扩增并计数Y-bar细胞。开始此操作时，通过密度梯度离心法从传染性单核细胞增多症病毒（CAEBV）患者的2毫升全血中分离外周血单个核细胞（PBMC）。或者，将保存于液氮中的冻存PBMC用RPMI-1640培养基解冻。接着，将2微升0.4%台盼蓝加入18微升细胞悬液中，染色3分钟，随后将悬液转移至细胞计数板，使用自动细胞计数仪测定细胞浓度和活率。将细胞悬液配制为每毫升含2×10⁶至3×10⁶个细胞的密度，加入含20%人血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺及抗生素的完全RPMI-1640培养基。随后，将1毫升PBMC悬液接种至24孔细胞培养板的每个孔中。接着，向每孔中加入150单位/毫升的重组人IL-2（rhIL-2）。将培养皿置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中。第二天，在200倍显微镜下观察细胞形态。当细胞呈明亮且圆形时，表明细胞状态良好。在此步骤中，向18微升细胞悬液中加入2微升0.4%台盼蓝，计算细胞浓度。接着，在更换培养基前，通过细胞计数观察细胞形态并监测细胞生长状态。监测细胞形态和生长状态非常重要。我们可以通过培养早期阶段的多形性细胞及细胞状态来判断细胞是否存活。随后，从24孔板的每个孔中移除500 µL培养基，并向其中加入500 µL新鲜的完全培养基。然后向每孔加入150 单位/毫升的rhIL-2。每周更换两次培养基。绘制细胞生长曲线。当活细胞浓度超过每毫升5 × 10⁶个细胞时，将细胞以每毫升1 × 10⁶至2 × 10⁶个细胞的浓度分种到新的孔中。该过程需要两到四周。当细胞扩增后，收集1 × 10⁶个细胞以确定细胞系的表型。在室温下以240 × g离心五分钟，沉淀NKNT细胞。随后，弃去上清液，加入7毫升PBS洗涤沉淀。在室温下以240 × g离心5分钟。重复此步骤一次后，向每根试管中加入200微升人血清，充分混匀，并在室温下孵育10分钟。然后在室温下以240 × g离心5分钟。弃去上清液，用预冷的PBSA缓冲液重悬细胞，使细胞浓度为每毫升1×10⁶个细胞。随后，将细胞分装至五个离心管中，每管含2×10⁵个细胞。接着，在4°C条件下以240×g离心5分钟。弃去上清液，用PBSA缓冲液或含有10 µL PE标记抗体和10 µL FITC标记抗体的PBSA缓冲液重悬细胞，置于冰上孵育，以标记T细胞或NK细胞的细胞表面受体。使用 PBSA 缓冲液悬浮的细胞作为阴性对照。接下来，将细胞与抗体在冰上避光孵育 20 至 30 分钟。用预冷的 PBSA 洗涤细胞两次，然后在使用流式细胞仪分析前，将细胞重新悬浮于 300 微升预冷的 PBSA 中。当完成细胞表型分析后，小心移除一半上清液，避免触碰培养板底部的细胞。向培养板中加入等体积含有300单位/毫升rhIL-2的新鲜培养基，之后每三天更换一半培养基，直至在显微镜下可清晰观察到细胞簇。随后，将同一系列不同孔中的细胞混合后，从24孔板转移至T-25培养瓶中。当培养基变黄时，将其体积加倍，直至培养基体积扩大至10至15毫升。随后，加入浓度为150单位/毫升的rhIL-2。在培养两到三周、肉眼可见细胞团块后，于冻存前24小时更换培养基。使用细胞计数器测定细胞浓度。随后，将细胞悬液在240 × g条件下离心5分钟，并用冷冻储存液重新悬浮细胞沉淀，细胞密度为每毫升5×10⁶至10×10⁶个细胞，冷冻储存液含有90%胎牛血清和10%二甲基亚砜（DMSO）。以每分钟1°C的速率将细胞冻存至-80°C，然后直接转移至液氮中保存。细胞系建立后培养三天，开始出现多形性细胞。培养七天后，细胞数量和活力均快速增加，细胞生长迅速。培养10至14天后，细胞浓度超过每毫升3×10⁶至6×10⁶时，可清晰观察到细胞形成的小细胞簇。在此期间，细胞应通过分裂扩增至培养板中的两到三个孔。大约一个月后，当细胞数量达到 3 × 10⁷ 至 5 × 10⁷ 时，数量已足够用于保存。另一个重要问题是确定细胞成功培养后的表型。我们的结果表明，T细胞和NK细胞可通过上述方法进行培养，并可利用该技术建立细胞系，因为细胞在良好状态下生长超过三个月。该方法、该技术还可进一步拓展应用。其操作简便，易于正确实施。在进行该实验操作时，重要的是要牢记PBMC的变异性。对于本实验，可采用MTT法检测试剂盒8等方法，以回答其他相关问题，例如可能用于过继性免疫治疗的NK细胞或T细胞系的毒性。每次实验改进后，该技术将为CAEBV领域的研究人员探索EBV相关NK/T细胞在细胞模型系统中涉及致病机制提供途径。观看本视频后，您应充分了解如何根据本方案建立并扩增NK细胞和T细胞系。请务必注意，操作病原体可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，必须始终采取适当的防护措施。

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免疫学与感染

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一种从慢性活动性EB病毒感染患者建立NK和T细胞系的高效简便方法

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