用于内耳组织工程的 Decellularizing 小鼠耳蜗协议
January 1st, 2018
本协议的目的是演示一种有效的方法, decellularize 和 decalcify 小鼠耳蜗作为组织工程应用的支架使用。
该程序的总体目标是展示一种使小鼠耳蜗脱细胞和脱钙的有效方法，以将支架用于内耳组织工程应用。这种方法可以帮助回答听觉和组织工程领域的关键问题，例如，3D 耳蜗和细胞外基质的各种成分如何影响干细胞分化？该技术的主要优点是它使研究人员能够研究细胞如何直接与耳蜗的细胞外基质相互作用以形成感觉上皮。
这种方法的视觉演示至关重要，因为仅根据文本描述很难正确可视化颞骨分离和细胞增殖装置。要开始此程序，请使用一把锋利的手术剪刀在矢状面中将颅骨一分为二。接下来，从颅骨中取出脑组织。
然后通过颅骨内部的听觉和前庭神经根以及从外部的耳道来识别颞骨。小心切开颅骨，将颞骨与颅骨的其余部分隔离开来。之后，将细镊子插入耳道开口约 5 毫米，这样尖端就不会有刺穿耳蜗的风险。
轻轻地掰开 bola 的骨头，使其骨折。使用细镊子，从颞骨中撬出剩余的 bola，露出耳蜗的骨迷宫。随后，将颞骨浸入 PBS 中，耳蜗的椭圆形和圆形窗口朝上。
使用一对超细镊子切除穿过镫骨的镫骨动脉。然后将超细镊子的一端插入动脉穿过的镫骨弓，并小心地将镫骨向上提起。之后，刺穿椭圆形和圆形窗户。
然后，将连接到填充 PBS 的 28.5 号注射器的管道放置在椭圆形窗口上。在 PBS 中注入两毫米 10% 抗生素-不菌剂和 10% 青霉素-链霉素，通过耳蜗在 5 分钟内去除外淋巴液。然后去除并丢弃任何剩余的肌肉组织和骨骼碎片。
对于脱细胞，使用移液管轻轻地将耳蜗向上拉入移液管中，使其刚好通过切割边缘几毫米。接下来，将耳蜗排出到充满 1% SDS 溶液的闪烁瓶中。使用移液管将两毫升 1% SDS 在去离子水中通过闪烁瓶中的耳蜗循环。
将闪烁瓶放入旋转器中，使其在室温下以 10RPM 旋转 72 小时。在 72 小时内每 24 小时更换一次新鲜的 1% SDS 溶液，并在更换溶液期间注意不要将耳蜗暴露在空气中。之后，在同一个闪烁瓶中用去离子水洗涤耳蜗 3 次，每次 30 分钟。
在这个阶段，耳蜗应该脱细胞。对于脱钙，从闪烁瓶中去除剩余的去离子水，留下的水分刚好足以使耳蜗浸没。要开始脱钙，将 5 毫升 10% EDTA 和 DI 水添加到含有耳蜗的闪烁瓶中。
使用移液管将两毫升 10% EDTA 在去离子水中通过闪烁瓶中的耳蜗循环。将闪烁瓶放回旋转器中，让闪烁瓶在室温下以 10RPM 的速度旋转 72 小时。在 72 小时内每 24 小时更换一次 10% EDTA 溶液。
更换溶液时要小心，以免耳蜗暴露在空气中。然后用 PBS 冲洗耳蜗 3 次，每次 2 小时。在这个阶段，耳蜗应该脱钙。
在输注细胞之前，首先将脱钙和脱钙的耳蜗在 5% 二氧化碳、37 摄氏度的细胞培养箱中孵育至少 1 小时。为了丰富耳蜗，接下来向每个耳蜗中加入一滴 MSCGM，以防止任何耳蜗变干。使用移液管将它们转移到新的 24 孔板中。
使用超细镊子巧妙地定位耳蜗，使椭圆形和圆形窗口朝上。然后使用带有连接管的无菌 28.5 号胰岛素注射器，吸取 0.2 毫升重新悬浮的人沃顿商学院果冻细胞。随后，使用消毒的细镊子将管子定位在椭圆形窗口上。
在 5 分钟内用 0.2 毫升重新悬浮的人沃顿商学院果冻细胞微妙而缓慢地充斥耳蜗。这个繁衍生息步骤很重要。通过耳蜗成功注入液体会极大地影响该方案的结果。
充注后，将 0.8 毫升 37 摄氏度预热的 MSCGM 添加到含有耳蜗的孔中，使总体积达到 1 毫升。对每个耳蜗重复该过程。每次使用新的注射器和管道。
将 profused 耳蜗放入 37 摄氏度的细胞培养箱中，每周更换培养基 3 次。这里显示的是小鼠耳蜗的成功脱细胞和脱钙，没有任何注射细胞。总体而言，耳蜗解剖结构得以保留，空隙没有斑点染色。
以下是在耳蜗支架上成功培养人沃顿氏胶质细胞的代表性结果。在整个耳蜗和外骨表面观察到丰富的斑点染色。对单个转弯的仔细检查表明，在脱细胞和脱钙后保留了精细的耳蜗结构，并且注射的细胞附着在天然耳蜗细胞外基质上或与之相互作用。
还使用 H&E 染色研究了后续细胞培养物中的脱细胞化。脱细胞的耳蜗不包含天然耳蜗的任何细胞，但保留了 Corti 器官的大部分解剖结构，因为细胞外基质仍然存在。注射到培养细胞中可以通过 Corti 器官观察到，与脱细胞的细胞外基质相互作用。
一旦掌握，如果耳蜗已经准备好并且所需工具布置得当，将细胞大量注入脱细胞的耳蜗可能需要大约 10 到 15 分钟。在尝试此程序时，小心处理耳蜗很重要，因为它很脆弱。避免将空气引入耳蜗也很重要，因为气泡会阻碍充血过程中的液体流动。
这种一般程序可以应用于其他物种的耳蜗，也可以注射多种细胞类型。具体的脱细胞和脱钙时间可能会有所不同，但基本概念将保持不变。明尼苏达大学的 Peter Santi 博士最初开发了我们针对该方案修改的脱细胞技术。
我们希望将我们的技术和耳蜗支架上的细胞培养提供给其他组织工程师。观看此视频后，您应该对如何在注射细胞用于培养实验之前成功分离、脱细胞和脱钙颞骨有很好的了解。
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概览
该协议展示了一种有效的方法，用于去细胞化和去钙化小鼠耳蜗，以用于组织工程应用中的支架。该技术允许研究人员研究细胞与耳蜗细胞外基质之间的相互作用，这对于理解感觉上皮形成至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 组织工程
- 听觉研究
- 细胞相互作用
背景
- 去细胞化和去钙化对于创建支架至关重要。
- 了解耳蜗结构对内耳研究至关重要。
- 细胞外基质影响干细胞分化。
- 视觉方法增强了对复杂程序的理解。
研究目的
- 提供一种可靠的耳蜗支架制备方法。
- 促进对耳蜗细胞相互作用的研究。
- 推进听觉和组织工程领域的知识。
使用的方法
- 从头骨中分离颞骨。
- 耳蜗去细胞化。
- 用于支架制备的去钙化过程。
- 为了清晰起见，对程序进行视觉演示。
主要结果
- 成功去细胞化和去钙化小鼠耳蜗。
- 增强了对细胞-细胞外基质相互作用的理解。
- 改进了研究感觉上皮形成的方法。
- 视觉辅助显著提高了对程序的理解。
结论
- 该方法为内耳研究提供了一个宝贵的工具。
- 它为研究耳蜗支架中的干细胞行为开辟了途径。
- 视觉演示对于复杂的生物学程序至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to generate physiologically relevant cochlear scaffolds for studying stem cell interactions with native extracellular matrix, supporting target validation in auditory regenerative medicine. By preserving extracellular matrix architecture while removing cellular components, the method provides a defined system to de-risk mechanistic hypotheses about matrix-mediated cell behavior in inner ear tissue engineering. The approach supports preclinical model development for hearing loss therapeutics by allowing controlled evaluation of cell-scaffold dynamics in a 3D disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses regarding extracellular matrix influence on stem cell differentiation and sensory epithelium formation.
- Operational Value: Enables biological de-risking of targets by isolating matrix-specific effects from cellular variables in a controlled scaffold system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, reproducible biological systems for quantitative assessment of cell invasion, proliferation, and matrix interaction.
- Operational Value: Supports assay scalability and platform reuse through consistent decellularization and decalcification outputs across multiple cochleae.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Establishes disease-relevant system continuity from discovery through preclinical validation by maintaining native cochlear architecture.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by enabling longitudinal observation of cell-scaffold interactions over 30-day culture periods.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by providing extracellular matrix scaffolds post-isolation, enabling hypothesis testing in lead identification stages before preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking by allowing direct study of cell-extracellular matrix interactions without confounding cellular debris.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized scaffold preparation that preserves structural integrity for reliable compound or cell evaluation.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements via cell invasion depth, proliferation rates, and matrix interaction patterns observable through staining and imaging.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining organ of Corti structure, enabling extrapolation to in vivo-like environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable scaffold platform applicable across cell types and species, reducing redundant isolation efforts in auditory tissue engineering programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in extracellular matrix-mediated cell behavior.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined decellularization (72-hour SDS rotation) and decalcification (72-hour EDTA rotation) protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by enabling early assessment of matrix-dependent cell responses, reducing late-stage biological risk in auditory regenerative programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of stem cell or matrix-modulating candidates based on scaffold-based functional readouts.
Implementation Considerations
- Required expertise in microsurgical temporal bone isolation and sterile cell perfusion techniques.
- Instrumentation needs include ultra-fine forceps, transfer pipets, rotators, and sterile syringe perfusion systems.
- Cross-team standardization requires adherence to solution exchange schedules and air-exposure avoidance during decellularization/decaltification.
- Adaptation considerations include species-specific timing adjustments and validation of scaffold integrity for alternative cell types beyond Wharton's jelly-derived MSCs.
- Practical limitations include cochlear fragility necessitating careful handling to prevent structural damage during isolation and perfusion.
