小鼠耳蜗脱细胞方案在内耳组织工程中的应用

本实验的总体目标是展示一种有效的方法，用于对小鼠耳蜗进行脱细胞和脱钙处理，以制备适用于内耳组织工程的支架材料。该方法有助于回答听觉学和组织工程领域中的一些关键问题，例如，三维耳蜗结构及细胞外基质的各个组分如何影响干细胞的分化？该技术的主要优势在于，它使研究人员能够直接研究细胞如何与耳蜗细胞外基质相互作用，进而形成感觉上皮组织。

该方法的可视化演示至关重要，因为仅通过文字描述很难准确理解颞骨分离和细胞灌注装置的操作过程。开始此操作时，使用一把锋利的手术剪沿正中矢状面将颅骨切开为两半。接下来，从颅骨中移除脑组织。

然后通过颅骨内部的听神经和前庭神经根以及颅骨外部的耳道来识别颞骨。小心地切割颅骨，将颞骨从颅骨其余部分分离出来。随后，将精细镊子插入耳道开口处约五毫米，使镊子尖端不会刺穿耳蜗。

轻柔地撬开球囊骨使其发生骨折。使用精细镊子将球囊的其余部分从颞骨上剥离，暴露耳蜗的骨迷路。随后，将颞骨浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中，使耳蜗的卵圆窗和圆窗朝上。

使用超细镊子移除穿过镫骨的镫骨动脉。然后将超细镊子的一端从镫骨弓处（即动脉穿行处）插入，并轻柔地向上抬起镫骨。随后，穿刺前庭窗和蜗窗。

随后，将连接至装有 PBS 的 28.5 号注射器的导管置于卵圆窗上方。在五分钟内，将两毫米含 10% 抗生素-抗真菌剂和 10% 青霉素-链霉素的 PBS 溶液经耳蜗灌注，以清除外淋巴液。然后去除并丢弃残留的肌肉组织和骨碎片。

进行脱细胞处理时，使用移液管轻轻将耳蜗吸入管中，使其刚好超过管口切缘几毫米。接着，将耳蜗排入盛有1%SDS溶液的闪烁瓶中。用移液管将2毫升溶于去离子水中的1%SDS溶液反复通过闪烁瓶中的耳蜗。

将闪烁瓶放入旋转仪中，在室温下以10 rpm的速度旋转72小时。在72小时期间内，每24小时更换一次新鲜的1% SDS溶液，并注意在更换溶液时避免耳蜗暴露于空气中。之后，在同一闪烁游戏副本中用去离子水清洗耳蜗三次，每次30分钟。

此时，耳蜗应已完成脱细胞处理。进行脱钙时，将闪烁瓶中剩余的去离子水移除，仅保留足以浸没耳蜗的量。开始脱钙时，向含有耳蜗的闪烁瓶中加入5毫升10% EDTA和去离子水。

使用移液管将2毫升10% EDTA（溶于去离子水）通过转瓶中的耳蜗进行循环。将转瓶放回旋转器中，在室温下以10转/分钟（RPM）的速度旋转72小时。在72小时内，每24小时更换一次10% EDTA溶液。

更换溶液时需小心，避免耳蜗暴露于空气中。随后用 PBS 缓冲液冲洗耳蜗三次，每次两小时。至此阶段，耳蜗应已完成脱钙。

在灌注细胞之前，首先将脱细胞和脱钙的耳蜗置于5%二氧化碳、37摄氏度的细胞培养孵箱中孵育至少一小时。接下来，为充分灌注耳蜗，向每个耳蜗滴加一滴MSCGM培养基，以防止耳蜗干燥。使用移液管将耳蜗转移至新的24孔板中。

使用超细镊子轻柔地调整耳蜗方向，使卵圆窗和圆窗朝上。然后，使用连接导管的无菌28.5号胰岛素注射器，吸取0.2毫升重悬的人脐带华通氏胶细胞。随后，用无菌精细镊子将导管置于卵圆窗上方。

在五分钟内，将 0.2 毫升重悬的人脐带华通氏胶细胞缓慢而轻柔地灌注至耳蜗。此灌注步骤至关重要。通过耳蜗成功灌注液体将极大影响本实验方案的结果。

灌流后，向含有耳蜗的孔中加入 0.8 毫升 37 摄氏度预热的 MSCGM，使总体积达到 1 毫升。每个耳蜗均重复此操作，每次使用新的注射器和管路。

将富含细胞的耳蜗置于37摄氏度的细胞培养孵育箱中，并每周更换培养基三次。图中显示的是小鼠耳蜗成功完成脱细胞和脱钙处理，且未注入任何细胞。总体而言，耳蜗解剖结构得以保留，空隙区域无明显染色残留。

以下是成功在耳蜗支架上培养的人类华通氏胶细胞的代表性结果。在整个耳蜗及外层骨表面均观察到明显的弥散性染色。对各个螺旋部分的进一步观察显示，在去细胞化和脱钙处理后，精细的耳蜗结构得以保留，且注入的细胞已附着于天然耳蜗细胞外基质或与其发生相互作用。

后续通过H&E染色也对脱细胞化后的细胞培养进行了研究。脱细胞化的耳蜗不含天然耳蜗的任何细胞，但由于细胞外基质得以保留，因此大部分柯蒂器官的解剖结构仍然存在。在培养中注入的细胞可穿过柯蒂器官被观察到，并与脱细胞化的细胞外基质发生相互作用。

一旦掌握该技术，如果耳蜗已经制备好且所需工具已妥善摆放，则向脱细胞耳蜗中进行灌注细胞的过程大约需要10至15分钟。在操作此步骤时，必须小心处理耳蜗，因其结构脆弱。同时应避免将空气引入耳蜗，因为气泡会在灌注过程中阻碍液体流动。

该通用步骤也可应用于其他物种的耳蜗，并且还可注射多种不同类型的细胞。具体的脱细胞和脱钙时间可能有所不同，但基本原理保持不变。我们对该方案中所用的脱细胞技术进行了改良，该技术最初由明尼苏达大学的 Peter Santi 博士开发。

我们希望将本技术及在耳蜗支架上进行的细胞培养方法提供给其他组织工程领域的研究人员。观看本视频后，您应能够充分掌握如何成功分离、脱细胞及脱钙颞骨，以便在培养实验中接种细胞。