Name: 用于内耳组织工程的 Decellularizing 小鼠耳蜗协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 学习小鼠耳蜗脱细胞与脱钙技术，用于内耳组织工程支架制备。该方法帮助研究人员研究细胞与耳蜗细胞外基质的相互作用，为听觉生物学和干细胞分化研究提供重要工具。

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本项目由堪萨斯大学概念验证基金资助。我们感谢堪萨斯城（堪萨斯州）堪萨斯大学医学中心的护理人员在获取人脐带方面提供的帮助，同时感谢David Jorgensen在耳蜗培养方面的协助。

所有实验操作，包括动物安乐死，均按照堪萨斯大学医学中心（KUMC）批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）协议（ACUP #2014-2234）进行。
注意：人脐带华通氏胶细胞（HWJCs）取自已签署知情同意书患者的捐赠脐带，样本使用均依照堪萨斯大学人类受试者委员会批准的方案（KU-IRB #15402）进行。
1. 颞骨采集与耳蜗分离
<ol>
	<li>用一把锋利的手术剪，在颅骨与第一颈椎之间剪断，处死一只已适当实施安乐死的15周龄小鼠，然后用70%乙醇喷洒头部进行消毒（图1A).</li>
	<li>使用同一把锋利的手术剪沿正中矢状面将颅骨切开图 1B- C，虚线）。</li>
	<li>使用镊子从颅骨中取出脑组织（图1D，箭头）。</li>
	<li>通过听神经和前庭神经根的存在来识别颞骨图1E- F，箭头）位于颅骨内侧和耳道外侧图1F，箭头）。小心切割颅骨，以分离颞骨与颅骨其余部分（图1G). 
	注意：在某些情况下，可能无需切割，即可小心地将颅骨周围骨骼从颞骨上剥离。</li>
	<li>将精细镊子插入耳道开口处，深度约5 mm（图1H），以免尖端刺破耳蜗。轻轻敲开鼓室的骨壁（图1H，顶部红色阴影区域）发生断裂（图1I，红色虚线。 
	注意：如有必要，可使用解剖显微镜辅助操作，以确保器械的准确定位和操作。</li>
	<li>使用精细镊子将鼓泡的其余部分从颞骨上剥离，暴露耳蜗的骨迷路（图1J，红色方括号</li>
	<li>放置一个足够大的培养皿以容纳颞骨（例如，在解剖显微镜视野下方放置一个直径30 mm或更大的培养皿，并加入足量磷酸盐缓冲液（PBS）以浸没颞骨例如0.5 至 1 mL</li>
	<li>将去除鼓泡后的颞骨浸入PBS中，耳蜗的卵圆窗和圆窗朝上。 
	注意：无需移除耳蜗中的前庭系统，因为前庭系统可作为良好的操作手柄，用于操控和定位耳蜗的结构图1I 和 图2B).</li>
	<li>使用超细镊子移除穿过镫骨的镫动脉。</li>
	<li>将超细镊子的一端从镫骨弓中穿过（此处为动脉穿过的部位），轻柔地向上提起镫骨。脱位的镫骨应随之从卵圆窗抬起。</li>
	<li>使用超细镊子的一个尖端刺破卵圆窗和圆窗。</li>
	<li>使用装有1× PBS的28.5号针头注射器，并连接内径0.28 mm、外径0.61 mm的导管，将导管置于卵圆窗上方（图2A - B). 
	注意：可使用超细镊子调整管口位置，以确保准确放置。
	<ol>
		<li>每次耳蜗操作均需使用新的注射器和管路。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 2 mL 含 10% 抗生素-抗真菌素（anti-anti）和 10% 青霉素-链霉素（pen-strep）的 PBS 溶液，经 5 分钟灌注耳蜗以去除外淋巴液。灌注速度过快或压力过高会损伤耳蜗内的精细结构。 
	注意：手动推动注射器使液体灌注耳蜗是有效的，尽管也可选择使用灌注泵作为替代方法。
	<ol>
		<li>若进行手动灌注，使用一对精细的自闭合镊子固定耳蜗（图2A) 灌注过程中通过夹持颞骨的前庭部分。 
		注意：尽管并非必需，但这样做可使双手均能自由操作器械；一只手可推动注射器（图2A）而另一人可适当地放置管路（图2B).</li>
		<li>从这一步开始，需注意避免耳蜗不必要的空气暴露。将气泡引入液体空间会阻碍液体循环，而进一步干燥则会损伤耳蜗内部的精细结构。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用精细镊子去除并弃去残留的肌肉组织和骨碎片。</li>
	<li>如有需要，可将分离的耳蜗置于含10%抗-抗和10%青霉素-链霉素的PBS溶液中，4 °C保存最多七天，每48小时定期更换抗生素溶液。</li>
</ol>
2. 耳蜗处理
<ol>
	<li>脱细胞化
	<ol>
		<li>对于每个耳蜗，向一个20 mL玻璃闪烁瓶中加入含1%十二烷基硫酸钠（SDS）的去离子（DI）水溶液，用于耳蜗的脱细胞处理。</li>
		<li>使用剃刀片剪去一个塑料7 mL移液管的管尖，使其开口足够大，以便耳蜗顺利通过。</li>
		<li>使用该移液管，轻柔地将耳蜗吸入管内，使其刚好通过剪切边缘数毫米。</li>
		<li>将耳蜗排入盛有1% SDS溶液的闪烁瓶中。</li>
		<li>使用移液管，在闪烁瓶中将2 mL含1% SDS的去离子（DI）水溶液反复通过耳蜗&#160;。</li>
		<li>将闪烁瓶放入旋转仪中，于室温下以10 rpm转速旋转72小时。
		<ol>
			<li>在72小时内每24小时更换一次1% SDS溶液。更换溶液时需注意，切勿使耳蜗暴露于空气中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用去离子水对耳蜗进行三次洗涤，每次30分钟。洗涤步骤在用于SDS处理的同一闪烁瓶中进行；此时耳蜗已完成脱细胞化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱钙
	<ol>
		<li>从闪烁瓶中移除残留的去离子水，仅保留足够浸没耳蜗的液体量。</li>
		<li>开始脱钙处理：向含有耳蜗的闪烁瓶中加入5 mL含10%乙二胺四乙酸（EDTA）（0.02 M）的去离子水溶液。</li>
		<li>使用移液管，在闪烁瓶中将2 mL含10% EDTA的去离子水溶液反复通过耳蜗&#160;。</li>
		<li>将闪烁瓶重新放回旋转仪中，于室温下以10 rpm转速旋转72小时。在72小时内每24小时更换一次10% EDTA溶液。更换溶液时需注意避免耳蜗暴露于空气中。</li>
		<li>用1× PBS缓冲液对耳蜗进行三次冲洗，每次2小时；此时耳蜗已完成脱钙处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保存
	<ol>
		<li>将耳蜗保存于含10%抗-抗（anti-anti）和10%青霉素-链霉素（pen-strep）的PBS溶液中，4 °C条件下最长可保存72小时。 
		注：若定期更换抗生素溶液，可能实现更长时间的保存；但本方案未验证处理后耳蜗的长期保存效果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 人脐带华通氏胶间充质干细胞的获取与扩增
<ol>
	<li>根据先前发表的方案分离人华通氏胶细胞（hWJCs）22。简言之，将脐带切成3 cm长的节段。</li>
	<li>用手术刀沿每个脐带节段纵向小心地做一浅切口，以展开并暴露脐带的华通氏胶。使用镊子去除血管。</li>
	<li>用足量的磷酸盐缓冲液（PBS）（例如，在60 mm培养皿中使用40 mL）清洗脐带节段两次，使组织完全浸没。用手术刀将组织节段切碎。在100 mm培养皿中加入50 mL消化液（含0.2% II型胶原酶、1%青霉素-链霉素的低糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM））进行组织消化。</li>
	<li>将组织置于消化液中，在5% CO2、37 °C的培养箱中以50 rpm的转速在摇床上过夜孵育。次日，用含2%抗生素-抗真菌剂的PBS将消化液按1:16比例稀释，并在室温（~27 °C）下以500 × g离心10分钟收集细胞。弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于间充质干细胞生长培养基（MSCGM）中，并合并细胞。以7 × 103 个细胞/cm2 的密度接种于经组织培养处理的T-75培养瓶中。在MSCGM中培养HWJCs，并扩增至第5代用于实验。 
	注意：传代时可将HWJCs继代至更大的T形培养瓶（例如，T-150、T-300），以提高实验用hWJCs的产量。</li>
</ol>
4. 将人脐带华通氏胶细胞注入脱细胞耳蜗
<ol>
	<li>准备脱细胞耳蜗
	<ol>
		<li>采用无菌技术，将储存的耳蜗用 1× PBS 洗涤三次，每次 30 分钟。</li>
		<li>将耳蜗转移至 24 孔板的各个孔中，并加入 1 mL 37 °C 预热的 MSCGM。</li>
		<li>在接种细胞前，将耳蜗置于 5% CO2、37 °C 的细胞培养箱中孵育至少 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消化 hWJCs 并重悬细胞
	<ol>
		<li>用 37 °C 预热的 1× PBS 洗涤 hWJCs 两次。</li>
		<li>加入足量 37 °C 预热的含 0.5% EDTA 的胰蛋白酶，以覆盖细胞培养容器表面。</li>
		<li>将 hWJCs 置于 5% CO2、37 °C 的细胞培养箱中孵育最多 5 分钟。
		<ol>
			<li>在倒置显微镜下观察细胞，确认约 90% 的细胞已从培养表面脱落。 
			注：轻敲培养容器时发生移动的细胞表示已脱落；保持静止的细胞则尚未脱落。</li>
			<li>轻轻敲击培养瓶侧面，以进一步松动仍附着的细胞。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>采用无菌操作技术，将 hWJCs 从培养容器转移至一个 50 mL 圆底离心管中，管内含有与所用胰蛋白酶体积相等的 MSCGM。</li>
		<li>在室温（约 27 °C）下以 500 × g 离心 5 分钟，使 hWJCs 沉淀。</li>
		<li>吸除上清液，并将 hWJCs 重悬于 MSCGM 中，调整细胞浓度至 500,000 个细胞/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灌注耳蜗
	<ol>
		<li>使用移液器将耳蜗转移至新的 24 孔板中。</li>
		<li>向每个耳蜗滴加一滴 MSCGM，防止耳蜗干燥。</li>
		<li>使用超细镊子小心调整耳蜗方向，使卵圆窗和圆窗朝上。 
		注：直接操作耳蜗时需格外小心，因其极易受损。</li>
		<li>使用连接导管的无菌 28.5 号胰岛素注射器，吸取 0.2 mL 重悬的 hWJCs（含 100,000 个细胞）。</li>
		<li>用灭菌的细镊子将导管置于卵圆窗上方。</li>
		<li>通过连接聚乙烯导管（外径：0.61 mm，内径：0.28 mm）的 28.5 号胰岛素注射器，在约 5 分钟内缓慢、轻柔地向耳蜗灌注 0.2 mL 重悬的 hWJCs。</li>
		<li>灌注完成后，在含有耳蜗的孔中加入 0.8 mL 37 °C 预热的 MSCGM，使孔内总体积达到 1 mL。</li>
		<li>对每个耳蜗重复步骤 4.3.3–4.3.7，每次均使用新的注射器和导管。</li>
		<li>将灌注后的耳蜗置于 5% CO2、37 °C 的细胞培养箱中培养，每周更换培养基三次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 耳蜗的采集与保存
注意：耳蜗可在灌注后30天内的任意时间点进行培养和收获。
<ol>
	<li>为保存耳蜗，将样本置于含4%多聚甲醛的1×PBS溶液中，于4 °C在摇床上固定过夜。</li>
	<li>固定后，用1×PBS溶液洗涤耳蜗3次，每次5分钟。</li>
	<li>用乙醇逐步脱水，并使用脂肪族碳氢化合物溶剂透明处理，然后包埋于石蜡中。</li>
	<li>使用切片机将样本切为10 µm厚度，并贴附于玻璃显微镜载片上。 
	注意：样本现已准备好，可按照标准方案进行组织学或免疫组织化学处理。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们已成功证明，可通过脱细胞过程将内耳耳蜗中的天然细胞从耳蜗中去除，从而将耳蜗用作复杂且具有三维结构的组织支架。Santi et al.15 建立了最初的耳蜗脱细胞方法，并借助光片显微镜技术准确估算了多种耳蜗结构的体积23。这些早期研究为本文所介绍的组织工程与细胞培养技术奠定了坚实基础。脱细胞耳蜗可成功接种细胞，并进行长期培养。理论上，可采用多种动物来源的耳蜗与多种类型的细胞进行组合应用。这些组合使得本文所述技术可用于多种可能的实验设计，例如研究感觉上皮发育的组织工程应用14、新型药物制剂的药效测试24，以及耳蜗修复模型的构建25。然而，尽管这些技术具有广泛的应用前景，但仍存在一定的局限性。
当前技术的一个局限性在于灌注效果因个体而异。开发一种用于耳蜗的固定装置，并使用注射泵进行灌注，可能会提高该过程的准确性和成功率。此外，可通...

耳蜗是位于颞骨内的复杂螺旋结构，由外层的骨迷路和内层同心排列的膜迷路组成1。膜迷路包含三个充满液体的腔隙：前庭阶、中阶和鼓阶1。中阶内含有感觉上皮，其由多种细胞类型构成，其中特别重要的是感受声音刺激的感觉毛细胞（HC），它能将声波中的机械能转化为神经冲动2。暴露于声创伤3,4,5、药物6、疾病7,8以及衰老9等因素均可能导致毛细胞死亡，进而引起听觉功能损伤。在哺乳动物中，毛细胞的丢失是永久性的，而鸟类的毛细胞在受损后具有再生能力10。
尽管具体的实验方法各不相同，但当前许多研究工作都致力于恢复已丧失的毛细胞（HCs）。调控感觉上皮中的基因表达以及植入体外分化的干细胞是该领域的主要策略，此外也有研究尝试通过诱导方法将干细胞分化为耳蜗类器官11,12,13。这些方法要么直接依赖于干细胞，要么依赖于干细胞所使用的发育信号；然而，另一个共同且可能至关重要的因素是耳蜗自身的细胞外基质（ECM）14,15。
细胞外基质（ECM）不仅为细胞和组织提供物理支持，包括为细胞黏附、增殖、存活和迁移提供表面，还在毛细胞（HC）和螺旋神经节的发育过程中发挥关键作用15,16,17。天然存在的ECM可提供诱导性信号，可能引导细胞表型的确定以及/或者细胞的黏附、增殖和存活18。因此，将脱细胞耳蜗与培养的人脐带华通胶间充质干细胞（hWJCs）结合使用，为探索ECM在毛细胞再生中的作用提供了独特的机会。hWJCs是一种易于获取、无伦理争议的细胞类型，来源于人类脐带，其行为特性类似于间充质干细胞19。hWJCs已被证明能够向神经感觉细胞谱系分化20,21。因此，本实验方案详细描述了从C57BL小鼠尸体中分离耳蜗、对其进行脱细胞处理，并用hWJCs灌注，用于内耳组织工程的研究。

<table><tbody><tr><td>Allegra X-14R 离心机</td><td>Beckman-Coulter</td><td>B08861</td><td></td></tr><tr><td>Intramedic 半刚性导管</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 2000 轨道摇床</td><td>Eppendorf</td><td>M1190-0002</td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>超精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>18155-13</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565271</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB087579B</td><td></td></tr><tr><td>U-100 胰岛素注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td></td></tr><tr><td>闪烁瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-73</td><td></td></tr><tr><td>旋转混匀仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-049</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-240-062</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost PLUS 玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046341</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma Series II 3110 水套式 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>间充质干细胞生长培养基</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Lonza</td><td>CC-3232</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-75 培养瓶</td><td>MidSci</td><td>TP90076</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-150 培养瓶</td><td>MidSci</td><td>TP90151</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-300 培养瓶</td><td>MidSci</td><td>TP90301</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ts2R-FL 倒置显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>MFA51010</td><td></td></tr><tr><td>NuAire II 级 A2 型生物安全柜</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>1% SDS 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143-100G</td><td></td></tr><tr><td>10% EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠耳蜗脱细胞方案在内耳组织工程中的应用

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

在哺乳动物中，负责听觉的机械感觉毛细胞缺乏再生能力，这限制了听力损失的治疗手段。目前再生医学的研究策略主要集中在移植干细胞或对内耳周围的支持细胞进行遗传操作，以促进受损毛细胞的替代，从而改善听力损失。然而，细胞外基质（ECM）可能在诱导和维持毛细胞功能方面发挥关键作用，但对此的研究仍不充分。利用耳蜗细胞外基质作为支架来培养成体干细胞，可能有助于揭示细胞外环境的组成与结构如何帮助细胞维持听觉功能。本文介绍一种从小鼠耳蜗中分离并去细胞化以制备可接受灌注成体干细胞的支架的方法。在本方案中，从小鼠耳蜗中分离组织，进行去细胞化和脱钙处理。随后，将来源于脐带的人华通胶细胞（hWJCs）小心地灌注到每个耳蜗中。将耳蜗用作生物反应器，细胞培养30天后进行分析处理。去细胞化的耳蜗保留了可识别的细胞外结构，但未检测到细胞或明显的DNA片段。灌注到耳蜗中的细胞侵入了耳蜗的大部分内外区域，并在30天内正常生长。因此，该方法可用于研究耳蜗细胞外基质对细胞发育和行为的影响。

通过本研究所介绍的方法，采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色检测DNA的存在与否，以评估耳蜗脱细胞是否成功。若在脱细胞耳蜗中未检测到DNA，则认为耳蜗已完全脱细胞。本实验使用先前未进行脱细胞或脱钙处理的小鼠原生耳蜗作为阳性对照，以展示C57BL小鼠耳蜗中传统存在的结构和细胞。未注入人脐带华通胶间充质干细胞（hWJCs）的脱细胞-脱钙耳蜗作为阴性对照。在组织切片的任何区域均未观察到可量化的DAPI染色细胞核（图3）。本研究中，两个耳蜗经脱细胞和脱钙处理后，注入了hWJCs。经hWJCs灌注的脱细胞-脱钙耳蜗在耳蜗内部以及耳蜗外骨壳表面均观察到大量DAPI染色的细胞核（表1）。经细胞灌注的第一个耳蜗在培养30天后的总估算细胞密度为113,759个细胞/耳蜗（图4 和 图5），第二个耳蜗为118,732个细胞/耳蜗（<strong class="xfig...

本实验方案的目的是展示一种有效的方法，用于对小鼠耳蜗进行脱细胞和脱钙处理，以制备可用于组织工程应用的支架材料。

在哺乳动物中，负责听觉的机械感觉毛细胞缺乏再生能力，这限制了听力损失的治疗手段。目前……

本实验的总体目标是展示一种有效的方法，用于对小鼠耳蜗进行脱细胞和脱钙处理，以制备适用于内耳组织工程的支架材料。该方法有助于回答听觉学和组织工程领域中的一些关键问题，例如，三维耳蜗结构及细胞外基质的各个组分如何影响干细胞的分化？该技术的主要优势在于，它使研究人员能够直接研究细胞如何与耳蜗细胞外基质相互作用，进而形成感觉上皮组织。该方法的可视化演示至关重要，因为仅通过文字描述很难准确理解颞骨分离和细胞灌注装置的操作过程。开始此操作时，使用一把锋利的手术剪沿正中矢状面将颅骨切开为两半。接下来，从颅骨中移除脑组织。然后通过颅骨内部的听神经和前庭神经根以及颅骨外部的耳道来识别颞骨。小心地切割颅骨，将颞骨从颅骨其余部分分离出来。随后，将精细镊子插入耳道开口处约五毫米，使镊子尖端不会刺穿耳蜗。轻柔地撬开球囊骨使其发生骨折。使用精细镊子将球囊的其余部分从颞骨上剥离，暴露耳蜗的骨迷路。随后，将颞骨浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中，使耳蜗的卵圆窗和圆窗朝上。使用超细镊子移除穿过镫骨的镫骨动脉。然后将超细镊子的一端从镫骨弓处（即动脉穿行处）插入，并轻柔地向上抬起镫骨。随后，穿刺前庭窗和蜗窗。随后，将连接至装有 PBS 的 28.5 号注射器的导管置于卵圆窗上方。在五分钟内，将两毫米含 10% 抗生素-抗真菌剂和 10% 青霉素-链霉素的 PBS 溶液经耳蜗灌注，以清除外淋巴液。然后去除并丢弃残留的肌肉组织和骨碎片。进行脱细胞处理时，使用移液管轻轻将耳蜗吸入管中，使其刚好超过管口切缘几毫米。接着，将耳蜗排入盛有1%SDS溶液的闪烁瓶中。用移液管将2毫升溶于去离子水中的1%SDS溶液反复通过闪烁瓶中的耳蜗。将闪烁瓶放入旋转仪中，在室温下以10 rpm的速度旋转72小时。在72小时期间内，每24小时更换一次新鲜的1% SDS溶液，并注意在更换溶液时避免耳蜗暴露于空气中。之后，在同一闪烁游戏副本中用去离子水清洗耳蜗三次，每次30分钟。此时，耳蜗应已完成脱细胞处理。进行脱钙时，将闪烁瓶中剩余的去离子水移除，仅保留足以浸没耳蜗的量。开始脱钙时，向含有耳蜗的闪烁瓶中加入5毫升10% EDTA和去离子水。使用移液管将2毫升10% EDTA（溶于去离子水）通过转瓶中的耳蜗进行循环。将转瓶放回旋转器中，在室温下以10转/分钟（RPM）的速度旋转72小时。在72小时内，每24小时更换一次10% EDTA溶液。更换溶液时需小心，避免耳蜗暴露于空气中。随后用 PBS 缓冲液冲洗耳蜗三次，每次两小时。至此阶段，耳蜗应已完成脱钙。在灌注细胞之前，首先将脱细胞和脱钙的耳蜗置于5%二氧化碳、37摄氏度的细胞培养孵箱中孵育至少一小时。接下来，为充分灌注耳蜗，向每个耳蜗滴加一滴MSCGM培养基，以防止耳蜗干燥。使用移液管将耳蜗转移至新的24孔板中。使用超细镊子轻柔地调整耳蜗方向，使卵圆窗和圆窗朝上。然后，使用连接导管的无菌28.5号胰岛素注射器，吸取0.2毫升重悬的人脐带华通氏胶细胞。随后，用无菌精细镊子将导管置于卵圆窗上方。在五分钟内，将 0.2 毫升重悬的人脐带华通氏胶细胞缓慢而轻柔地灌注至耳蜗。此灌注步骤至关重要。通过耳蜗成功灌注液体将极大影响本实验方案的结果。灌流后，向含有耳蜗的孔中加入 0.8 毫升 37 摄氏度预热的 MSCGM，使总体积达到 1 毫升。每个耳蜗均重复此操作，每次使用新的注射器和管路。将富含细胞的耳蜗置于37摄氏度的细胞培养孵育箱中，并每周更换培养基三次。图中显示的是小鼠耳蜗成功完成脱细胞和脱钙处理，且未注入任何细胞。总体而言，耳蜗解剖结构得以保留，空隙区域无明显染色残留。以下是成功在耳蜗支架上培养的人类华通氏胶细胞的代表性结果。在整个耳蜗及外层骨表面均观察到明显的弥散性染色。对各个螺旋部分的进一步观察显示，在去细胞化和脱钙处理后，精细的耳蜗结构得以保留，且注入的细胞已附着于天然耳蜗细胞外基质或与其发生相互作用。后续通过H&E染色也对脱细胞化后的细胞培养进行了研究。脱细胞化的耳蜗不含天然耳蜗的任何细胞，但由于细胞外基质得以保留，因此大部分柯蒂器官的解剖结构仍然存在。在培养中注入的细胞可穿过柯蒂器官被观察到，并与脱细胞化的细胞外基质发生相互作用。一旦掌握该技术，如果耳蜗已经制备好且所需工具已妥善摆放，则向脱细胞耳蜗中进行灌注细胞的过程大约需要10至15分钟。在操作此步骤时，必须小心处理耳蜗，因其结构脆弱。同时应避免将空气引入耳蜗，因为气泡会在灌注过程中阻碍液体流动。该通用步骤也可应用于其他物种的耳蜗，并且还可注射多种不同类型的细胞。具体的脱细胞和脱钙时间可能有所不同，但基本原理保持不变。我们对该方案中所用的脱细胞技术进行了改良，该技术最初由明尼苏达大学的 Peter Santi 博士开发。我们希望将本技术及在耳蜗支架上进行的细胞培养方法提供给其他组织工程领域的研究人员。观看本视频后，您应能够充分掌握如何成功分离、脱细胞及脱钙颞骨，以便在培养实验中接种细胞。

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Research

科研

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生物工程

用于内耳组织工程的 Decellularizing 小鼠耳蜗协议

活体成像哺乳动物胚胎耳蜗具有挑战性，因为相关发育过程在十天内呈现时间梯度变化。本文介绍一种方法，用于培养并连续五天对来自荧光报告小鼠的胚胎耳蜗外植体组织进行成像。...

小鼠耳蜗组织外植体的长期延时成像

我们介绍一种从胚胎小鼠内耳分离和培养耳蜗外植体的方法。同时，我们还演示了通过方波电穿孔法将基因转入耳蜗外植体的技术。体外外植体培养结合基因转移技术，使研究人员能够研究在发育过程中改变基因表达所产生的影响。...

小鼠胚胎耳蜗外植体培养及电穿孔介导的基因转导

存在多种将耳毒性物质导入动物模型耳蜗的方法。本文介绍了一种通过圆窗龛递送耳毒性物质的手术方案。该方法具有良好的可靠性，可产生靶向的耳蜗内损伤，同时避免对微细结构造成机械性损伤。此外，可进一步用于研究耳蜗的自我修复与再生能力。...

小鼠圆窗给药法用于耳毒性药物递送：一种诱导耳蜗细胞退变的快速可靠技术

初级纤毛影响多种信号通路。哺乳动物耳蜗是研究平面细胞极性（PCP）信号通路的理想模型。纤毛功能障碍会影响耳蜗的外向生长、细胞排列模式以及毛细胞的定向，这些均为PCP的表型读数。我们的目标是通过表型分析、免疫组织化学和扫描电子显微镜技术，分析小鼠耳蜗中的PCP信号通路。...

纤毛病小鼠突变体耳蜗中平面细胞极性表型的评估

本文描述了两种用于向内耳局部给药的显微外科手术方法，并在听力参数、耳蜗细胞结构以及炎症标志物表达方面对二者进行了比较。...

靶向小鼠内耳给药方法的比较研究：鼓泡术 与 经鼓室注射

本文介绍了一种改良的耳蜗表面制备方法，该方法需要进行脱钙处理，并使用细胞与组织粘附剂将耳蜗上皮组织片段粘附于10...

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活体功能性小鼠耳蜗毛细胞中葡聚糖的标记与摄取

本研究中，我们采用共聚焦显微镜结合包含科尔蒂器的耳蜗上皮组织体外孵育方法，实时成像观察细胞向受损组织迁移的过程。...

体外延时活细胞成像技术用于探究细胞向耳蜗柯蒂氏器的迁移

本方案更新了以往的实验方法，纳入了相对简便的高质 Cochlear...

新生小鼠耳蜗全组织外植体作为 体外 模型

本文介绍了一种从小鼠中分离和培养原代耳蜗毛细胞的详细方案。首先，在显微镜下从新生小鼠（3-5日龄）耳蜗中分离出柯蒂氏器。随后，通过酶消化法将组织解离为单细胞悬液，并在培养数天后通过免疫荧光鉴定细胞。...

新生小鼠耳蜗毛细胞的分离与原代培养

本方案面向小鼠内耳组织的初学者，全面详述了针对不同发育阶段的小鼠内耳组织进行切片免疫染色的处理步骤。...

冷冻切片与免疫染色小鼠内耳组织：从胚胎期到成年期

学习小鼠耳蜗脱细胞与脱钙技术，用于内耳组织工程支架制备。该方法帮助研究人员研究细胞与耳蜗细胞外基质的相互作用，为听觉生物学和干细胞分化研究提供重要工具。

小鼠耳蜗脱细胞方案在内耳组织工程中的应用

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