Name: 钌线粒体钙吸收抑制剂的合成与评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 学习合成与纯化钌基线粒体钙吸收抑制剂的方法，该方法可制备出比市售产品效力高十倍的类似物。此技术为线粒体钙生物学研究提供了高纯度、高效能的研究工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本研究由康奈尔大学资助。本工作使用了康奈尔材料研究中心共享设施，该设施通过美国国家科学基金会MRSEC项目（资助号DMR-1120296）获得支持。S.R.N. 感谢美国国家科学基金会研究生研究奖学金（资助号DGE-1650441）的支持，并感谢Dave Holowka博士在钙离子实验中提供的帮助。本文所表达的任何观点、发现、结论或建议均为作者（或作者们）的观点，不一定反映美国国家科学基金会的立场。

注意：本合成过程中使用浓酸和浓碱。进行反应时，应采取所有适当的安全措施，包括使用工程控制设备（通风橱）和个人防护装备（PPE），如护目镜、手套、实验服、长裤和封闭式鞋履。
1. [(OH2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5 的制备
<ol>
	<li>[Ru(NH3)5Cl]Cl2的合成3)5Cl]Cl2 12
	<ol>
		<li>溶解 1.00 g RuCl3&#183;nH2O（按重量计含40% Ru，4.1 mmol）溶于5 mL H2O. 将深棕色溶液冷却至 0 &#176;在冰浴中冷却。逐滴加入11 mL（0.23 mol）80%水合肼溶液。初始反应剧烈，伴有气体释放，得到棕色溶液。将所得溶液在室温下搅拌16小时，最终溶液呈深红色。 
		警告：肼具有急性毒性和致癌性。此外，该试剂的无水形式具有爆炸性。操作时务必使用适当的个人防护装备和通风橱。切勿将这些溶液浓缩至干。</li>
		<li>向该溶液中加入约5-10 mL浓盐酸，调节pH至2。此时溶液呈黄褐色。</li>
		<li>将该溶液在105 ℃下加热 &#176;C，搅拌1-2小时。溶液中将析出黄色固体。当不再有明显沉淀生成时，停止加热。</li>
		<li>让反应混合物冷却至室温，然后置于0 ℃ &#176;将反应液在冰浴中冷却10分钟。通过减压过滤收集黄色固体，并分别用5 mL乙醇和5 mL乙醚洗涤。</li>
		<li>将粗产物完全溶解于15–25 mL热水中。取10 mL浓盐酸溶液置于滤瓶中，并将其置于冰浴中冷却。将黄色溶液过滤至预冷的盐酸溶液中，以析出淡黄色纯品固体。过滤所得沉淀，并依次用0.5 M盐酸、乙醇和乙醚各5 mL洗涤。</li>
		<li>使用红外光谱表征该化合物。通过鉴定在 3226 cm⁻¹ 处的伸缩振动频率来验证其纯度。-1，1604 cm-1，1297 cm-1，以及 801 cm-1一种常见的微量杂质，位于 2069 cm⁻¹-1 被指定为 [Ru(NH3)5N2]Cl3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>[(OH₂)(NH₃)₄Ru(µ-O)Ru(NH₃)₄(OH₂)]⁵⁺的合成2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5
	<ol>
		<li>溶解 100 mg (0.34 mmol) [Ru(NH3)5Cl]Cl2 在 50 mL 1 M NH₄OH 中4在200 mL厚壁圆底高压反应釜中加入OH。用塞子 loosely 封住烧瓶，并将反应混合物在75 ℃加热 &#176;室温下搅拌4天，得到深绿色溶液。 
		注意！加热密闭容器会导致压力积聚。务必使用耐压安全的玻璃器皿。本反应中密封容器的目的是尽量减少气态 NH₃ 的挥发损失。3因此，应将塞子 loosely 放置，以释放多余压力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>阳离子交换色谱纯化
	<ol>
		<li>在25 mL烧杯中，悬浮5 g阳离子交换树脂（例如Dowex 50WX2 200-400目（H⁺型））。+ 在10 mL 0.1 M HCl中（以该形式存在）。</li>
		<li>将该悬浊液上样至一个10 mL层析柱（直径10 mm，高15 cm），层析柱连接50 mL溶剂储液器。用约20–30 mL的0.1 M HCl洗涤树脂，直至流出液无色。</li>
		<li>回到步骤1.2.1中分离得到的绿色反应溶液。向该溶液中加入浓盐酸，调节pH至2，此时溶液颜色变为棕色。</li>
		<li>将此酸化溶液用移液管轻轻加至1.3.2步骤中制备的阳离子交换树脂柱顶部。待洗脱液完全流尽后，继续加入溶液。重复此过程，直至全部溶液加完。树脂顶部将变为深棕色至黑色，树脂体积略有减小。</li>
		<li>使用玻璃珠覆盖树脂顶部，以防止添加新溶液时扰动树脂。</li>
		<li>用20 mL 1 M HCl洗脱色谱柱。</li>
		<li>用1.5 M HCl浓度洗脱色谱柱（&#8776; 50 mL）。此时将有黄色溶液开始从柱中流出。将 HCl 浓度提高至 2 M，继续洗脱，直至洗脱液无色或呈极淡的黄绿色。此过程共需 150–200 mL 洗脱液体积。</li>
		<li>将 HCl 浓度提高至 2.5 M（20–50 mL），用试管分段收集洗脱液。再将 HCl 浓度升至 3 M。产物将以绿色至棕褐色溶液的形式从色谱柱中洗脱出来。此时可能开始有红棕色组分流出，这些组分为被氧化的钌红杂质，切勿与绿色至棕褐色组分混合收集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>[(OH₂)(NH₃)₄Ru(µ-O)Ru(NH₃)₄(OH₂)]⁵⁺ 纯度的表征与验证2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5
	<ol>
		<li>对步骤 1.3.8 得到的所有组分进行紫外-可见光谱检测。为完成此操作，加入 100 &#181;将特定组分的溶液1 L加入2 mL 3 M NH3中，通过紫外-可见光谱分析。含有纯产物的组分在360 nm处呈现强吸收峰，在600 nm处吸收较弱。480 nm处的吸收表明存在氧化的钌红，533 nm处的吸收则分别指示钌红杂质的存在。</li>
		<li>合并含有纯产物的馏分，并通过旋转蒸发将溶液蒸干至干燥。产物为绿色至棕色固体。典型产量约为5–15 mg（产率10–20%）。通过将乙醇蒸气扩散至该化合物的水溶液中，可获得适合X射线衍射分析的单晶。</li>
		<li>为验证纯度，将化合物溶解于 pH 7.4 的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中，并通过紫外-可见光谱法进行分析。可通过测定 360 nm 与 600 nm 处吸收峰强度的比值来评估纯度。纯品的该比值为 31，而不纯样品的比值则较小。</li>
		<li>通过红外光谱法对固体样品进行分析。特征吸收峰位于 3234 cm⁻¹。-1，3151 cm-1，1618 cm-1，1313 cm-1，以及 815 cm-1常见的杂质峰出现在 1762 cm⁻¹-1 和 1400 cm-1，NH 的特征4氯化钌红可通过 1404 cm⁻¹ 处的吸收峰进行鉴定-1，1300 cm-1，1037 cm-1 和 800 cm-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光光谱法评估线粒体钙摄取抑制作用 
	注意！以下实验操作涉及哺乳动物细胞。应在经过认证适用于生物安全二级（BSL2）研究的适当层流罩内进行操作。 
	&#8203;注意：[(OH₂)(NH₃)₄Ru(µ-O)Ru(NH₃)₄(OH₂)]⁵⁺2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5 本节中将简称为 [Ru]
	<ol>
		<li>配制含葡萄糖的缓冲盐溶液（BGSS）作为测定介质。BGSS 是一种包含 110 mM KCl、1 mM KH2PO4，1 mM MgCl₂2，20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），5 mM 琥珀酸钠，30 &#181;M 乙二醇双(&#946;-氨基乙基醚-N,N,N',N'-四乙酸（EGTA）。除EGTA外将所有成分混合，调节pH至7.4。加入EGTA后再次调节pH至7.4。配制50 mL检测培养基时，加入0.5 mL浓度为1 mg/mL的葡萄糖。</li>
		<li>在500 cm²培养瓶中培养HeLa细胞2 在含10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，置于含5% CO₂的湿润化培养箱内的培养皿2 37 ℃ &#176;C. 将生长在100 mm培养皿中的HeLa细胞接种至500 cm²培养瓶中进行扩增2 培养皿。大培养皿中的总培养基体积为115 mL。每个大培养皿可获得约1800万细胞，足以进行两次荧光光谱实验。
		<ol>
			<li>将细胞培养至90-95%汇合度。移除培养基，用15 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。加入15 mL含1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS溶液，孵育10分钟以使细胞脱落。将细胞转移至14 mL圆底离心管中</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用台盼蓝和血细胞计数板在倒置显微镜下对细胞进行计数，计算获得每1.8 mL培养基中含有750万个细胞所需的总细胞数及培养基体积。将细胞在5310 × g条件下离心10分钟 &#215; g. 倾去上清液，加入计算好的体积的BGSS，轻轻重悬细胞。
		<ol>
			<li>对于该实验，配制 40 mM 皂苷（digitonin）的二甲基亚砜（DMSO）储备液，以及 1 mM Calcium Green-5N 的 H2O 和 10 mM CaCl2 在 H2O. [Ru] 储备液用纯水配制，浓度范围为 1–3 mM。 
			&#8203;注意：Calcium Green-5N 对光敏感，需避光保存并尽量减少光照暴露。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将荧光分光光度计设置为在506 nm处激发，于532 nm处检测发射光，比色皿架温度控制在37 &#176;C. 准备一个带搅拌子或搅拌轮的丙烯酸比色皿，加入上述1.5.2步骤中的1.8 mL细胞悬液，1.8 &#181;L 洋地黄皂苷溶液，3.6 &#181;L 钙绿-5N（溶液），和 9 &#181;L [Ru]（配制1 mM 储存液，5 &#181;M 终浓度）。将细胞在荧光分光光度计中孵育 15 分钟。
		<ol>
			<li>将数据读取为激发/发射比值，而非原始吸收值。这种做法可最大限度地减少因光源强度波动而产生的误差。</li>
			<li>在不存在[Ru]的情况下进行第一次样品分析，以测量添加CaCl₂对线粒体钙摄取的影响。2 对细胞反应的影响</li>
			<li>使用1.5.4节所述的荧光仪设置开始分析。等待约2分钟以建立稳定的发射基线，然后加入1.8 &#181;CaCl₂ 溶液2 (10 &#181;M 终浓度）。加入 CaCl₂ 后，发射强度将立即增加。2，随后随着钙离子进入线粒体，荧光信号将在数分钟内逐渐衰减。等待直至衰减过程结束（&#8776;5 分钟）。加入额外的钙脉冲，以确定未用 [Ru] 处理的细胞的线粒体钙摄取反应。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在另一个比色皿中加入5 &#181;M [Ru]，按照1.5.4.3节所述重复上述实验。在抑制剂存在下，发射强度将增加但不衰减。该现象表明线粒体钙摄取被阻断。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enjoy+the+trip%3A+Calcium+in+mitochondria+back+and+forth%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth.</a> Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).</li>
<li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+calcium+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the calcium connection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li>
<li>Giorgi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+homeostasis+as+potential+target+for+mitochondrial+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine.</a> Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).</li>
<li>De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+forty-kilodalton+protein+of+the+inner+membrane+is+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).</li>
<li>Baughman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+identifies+MCU+as+an+essential+component+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).</li>
<li>Kamer, K. J., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+era+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).</li>
<li>Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mitochondrial+calcium+ion+transport+by+an+oxo-bridged+dinuclear+ruthenium+ammine+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex.</a> Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).</li>
<li>Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/244437951_The_component_of_ruthenium_red_responsible_for_inhibition_of_mitochondrial_calcium_ion_transport_Spectra_electrochemistry_and_aquation_kinetics_Crystal_structure_of_m-O-HCO2NH34Ru2Cl_3">The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).</li>
<li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-bridged+Dinuclear+Ruthenium+Amine+Complex+Specifically+Inhibits+Ca2%2B+Uptake+into+Mitochondria+in+Vitro+and+in+Situ+in+Single+Cardiac+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes.</a> J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li>
<li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li>
<li>Nathan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Methods+for+the+Preparation+of+a+Functional+Analogue+of+Ru360%2C+a+Potent+Inhibitor+of+Mitochondrial+Calcium+Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake.</a> Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).</li>
<li>Allen, A. D., Senoff, C. V. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/v67-220#.WW5AYYjyvIU">Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III).</a> Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).</li>
<li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li>
<li>Deak, A. T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25631032">Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake.</a> Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

线粒体钙离子摄取抑制剂[(OH2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5可由已知的三价钌起始原料[Ru(NH3)5Cl]Cl2合成，具体方法如本实验方案所述。[Ru(NH3)5Cl]Cl2的合成过程简单，易于实现。将RuCl3在水合肼中搅拌16小时后，需用HCl将溶液pH值调节至2。pH值的降低对于获得目标产物至关重要。如需要，可通过在HBr中回流代替HCl，对本合成方法进行修改以制备[Ru(NH3)5Br]Br2。
在合成线粒体钙摄取抑制剂的过程中，我们观察到一些可减少不期望副产物生成的策略。值得注意的是，保持反应瓶加盖对该反应的成功至关重要；如果反应瓶敞口，会生成包括钌红（RuRed）在内...

线粒体钙是调控多种对正常细胞功能至关重要的生理过程的关键调节因子，包括能量生成和细胞凋亡。1,2,3 线粒体钙单向转运体（MCU）是一种定位于线粒体内膜的离子转运蛋白，负责调控钙离子向线粒体基质内的流入。4,5,6 针对MCU的化学抑制剂是研究该转运蛋白及线粒体钙功能与细胞作用的重要工具。化合物[(HCO2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4(O2CH)]3+（Ru360）是目前已知少数具有选择性的MCU抑制剂之一，其报道的Kd值为24 µM。7,8,9,10 该复合物常作为商业化的三联吡啶红（ruthenium red, RuRed）中的常见杂质存在；RuRed是一种三钌双-µ-氧桥接的六价阳离子化合物，分子式为[(NH3)5Ru(µ-O)Ru(NH3)4(µ-O)Ru(NH3)5)]6+，也曾被用作钙摄取抑制剂。尽管Ru360可从商业途径获得，但其价格极为昂贵。此外，Ru360的合成与分离过程因纯化步骤困难以及表征方法不明确而面临挑战。
我们最近报道了合成 Ru360 类似物 [(OH2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5 的替代方法11。该化合物抑制线粒体钙单向转运体（MCU）的亲和力较高，与 Ru360 相似。在本实验方案中，我们将描述该化合物最有效的合成路线，起始原料为 [Ru(NH3)5Cl]Cl2。文中详细说明了使用强酸性阳离子交换树脂纯化产物的步骤，并列出了该操作中常见的问题。我们还提供了化合物的表征方法和纯度评估手段，并阐述了一种检测其阻断线粒体钙摄取功效的简便方法。

<table><tbody><tr><td>三氯化钌水合物</td><td>Pressure Chemical</td><td>3750</td><td></td></tr><tr><td>浓盐酸</td><td>J.T. Baker</td><td>9535</td><td></td></tr><tr><td>浓氨水</td><td>Mallinckrodt Chemical Works</td><td>A669C-2 1</td><td></td></tr><tr><td>Dowex 50 WX2 200-400 目</td><td>Alfa Aesar</td><td>13945</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Green 5N</td><td>Invitrogen</td><td>C3737</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Aldrich</td><td>260746</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Aldrich</td><td>471267</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>USB</td><td>20598</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fluka</td><td>54466</td><td></td></tr><tr><td>琥珀酸钠</td><td>Alfa Aesar</td><td>33386</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>8993-01</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Aldrich</td><td>G5000</td><td></td></tr><tr><td>200 mL 圆底烧瓶</td><td>ChemGlass</td><td>CG-1506-14</td><td></td></tr><tr><td>玻璃塞</td><td>ChemGlass</td><td>CG-3000-05</td><td></td></tr><tr><td>10 mm × 15 cm 带储液器的玻璃层析柱</td><td>定制 — 类似于 Chemglass 层析柱</td><td>类似于 CG-1203-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>圆底 Falcon 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-11B&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>500 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 培养皿</td><td>Corning</td><td>431110</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酸比色皿</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>58017-875</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Agilent Model Cary 8454&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光分光光度计</td><td>SLM Model 8100C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>红外光谱仪</td><td>Bruker Hyprion FTIR 配备 ATR 附件</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>ALC Model PM140R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置光学显微镜</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>89404-462</td><td></td></tr></tbody></table>

钌基线粒体钙摄取抑制剂的合成与评价

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

我们详细描述了一种线粒体钙摄取抑制剂[(OH2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+的合成与纯化方法。该化合物的优化合成以[Ru(NH3)5Cl]Cl2为起始原料，在密闭容器中使用1 M NH4OH进行反应，得到绿色溶液。通过阳离子交换色谱法完成纯化。该化合物经紫外-可见吸收光谱和红外光谱表征，并确认其纯度。其线粒体钙摄取抑制活性在通透化的HeLa细胞中通过荧光光谱法进行评估。

本方法描述了一种线粒体钙摄取抑制剂[(OH2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5的合成路线，起始原料为[Ru(NH3)5Cl]Cl2，这是一种已知的三价钌起始物料。[Ru(NH3)5Cl]Cl2通过红外光谱进行表征，其振动峰位于3200 cm-1、1608 cm-1、1298 cm-1和798 cm-1（图1）。在2069 cm-1处的微小杂质峰可归因于[Ru(NH3)5N2]Cl3。该Ru(III)化合物与1 ...

本文介绍了一种钌基线粒体钙摄取抑制剂的合成、纯化与表征方法，并演示了其在通透化哺乳动物细胞中评估药效的实验方案。

我们详细阐述了一种线粒体钙离子摄取抑制剂[(OH2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+的合成与纯化方法。该化合物的优化合成路线……

合成与纯化的总体目标是相对简便地制备一种钌红360类似物，该类似物用于线粒体钙摄取检测，其效果比市售的钌红360强10倍。该方法可通过提供一种高纯度的线粒体钙摄取抑制剂，帮助解答线粒体钙生物学领域中的关键科学问题。该技术的主要优势在于最终产物具有极高的活性和纯度。初次使用该方法的研究人员可能会遇到困难，因为纯化过程需要时间和耐心。本实验的示范者为来自我实验室的研究生 Sarah Nathan。请按照文本方案中的描述，首先合成五氨氯化钌二氯化物（pentaammine chloro ruthenium dichloride）。在200毫升圆底烧瓶中，将100毫克五氨氯化钌二氯化物溶于50毫升1摩尔的氢氧化铵溶液中。用玻璃塞松松盖住烧瓶，将反应混合物在75摄氏度下加热6小时。加热密闭容器会导致压力积聚。确保玻璃塞松动，以便释放多余压力。六小时后将反应混合物从加热装置中取出，在室温下继续搅拌四天，得到深绿色溶液。通过阳离子交换色谱法纯化所得的反式二水八氨μ-氧双钌五氯化物时，首先将五克网状阳离子交换树脂悬浮于25毫升烧杯中的10毫升0.1摩尔盐酸溶液内。将此悬浮液加载至装有50毫升溶剂储液器的10毫升层析柱中。用约20至30毫升0.1摩尔盐酸洗涤树脂，直至洗脱液变为无色。接下来，向先前分离的绿色反应溶液中加入浓盐酸，调节pH至2，此时溶液颜色变为棕色。用移液器将该酸化后的溶液轻轻加至阳离子交换树脂柱顶部。待溶液完全流出后，继续加载溶液。重复此过程，直至全部溶液加入完毕。树脂上层将变为深棕色或黑色，树脂体积会略微减小。接下来，用玻璃珠覆盖树脂顶部，以防止添加新溶液时扰动树脂。用 20 毫升 1 摩尔/升盐酸溶液洗脱层析柱，然后用 50 毫升浓度提高至 1.5 摩尔/升的盐酸溶液进行洗脱。将有黄色溶液开始从层析柱中流出。接下来将盐酸浓度提高至2摩尔，并继续用150至200毫升溶液进行洗脱。洗脱液的颜色将从极淡的黄色逐渐变为亮黄色。等待柱子流出的洗脱液再次变为非常浅的颜色。此步骤中耐心至关重要，洗脱液必须非常浅。将盐酸浓度进一步提高至2.5摩尔。用试管分段收集洗脱液。最后将浓度提高至3摩尔盐酸。产物将作为绿色-棕色溶液从柱中洗脱出来。可能会有红棕色组分也开始从柱中流出。这些组分为钌棕色杂质，不应与绿色-棕色组分合并。为了通过紫外-可见光谱法检测所有组分，将100微升特定组分加入2毫升3摩尔氨水中，然后用紫外-可见光谱法分析该混合物。含有纯产物的组分在360纳米处会显示出较强的吸收峰，在600纳米处的吸收峰强度较弱。在480纳米处的吸光度表明存在钌棕，在533纳米处的吸光度代表存在钌红杂质。其他杂质在低于300纳米的吸光度处可见。收集含有纯产物的馏分，并通过旋转蒸发将溶液蒸干，随后对固体样品进行红外光谱分析。按照文本方案中所述，通过荧光光谱法评估线粒体钙摄取的抑制情况。纯

synthesis-evaluation-ruthenium-based-mitochondrial-calcium-uptake

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

钌线粒体钙吸收抑制剂的合成与评价

本方案描述了一种通过荧光成像实时测量线粒体钙流的方法。该方法利用一种基于环状重排黄色荧光蛋白（YFP）的双激发比率型钙离子探针（ratiometric...

利用基因编码钙传感器监测细胞凋亡过程中线粒体钙水平的动态变化

本文介绍了一种利用光谱荧光法测定分离的小鼠心脏线粒体中线粒体通透性转换孔开放的实验方案。该检测方法包括同时测量线粒体的Ca2+处理能力、线粒体膜电位以及线粒体体积。同时，还描述了获取高质量且具有功能活性的心脏线粒体的操作步骤。...

离体小鼠心脏线粒体通透性转换孔开放的多参数测量

本视频介绍了一种基于酶标仪的检测方法，用于测量分离线粒体中的线粒体钙离子摄取。该方法通过分析钙敏感性荧光染料的荧光信号，研究线粒体钙离子摄取的动力学过程以及钙超载现象。...

线粒体钙摄取检测：一种基于酶标仪的分离线粒体钙摄取测量方法

本视频介绍了一种基于共聚焦显微镜成像的检测方法，用于测量培养细胞中的线粒体钙离子摄取。该检测方法利用钙离子敏感的荧光染料...

用于测定培养细胞中线粒体钙摄取的钙离子内流检测法

钌膦配合物广泛用于均相催化反应，如氢化反应。本文报道了一系列含N-三膦配体N(CH2PPh2)3的新型三齿钌配合物的合成。此外，还描述了二氢化钌–N-三膦配合物与乙酰丙酸的化学计量反应。...

一系列钌N-三膦Ph配合物的合成、表征与反应性研究

线粒体可利用其内膜上的电化学势能（ΔΨm）来摄取钙离子（Ca2+），从而调控细胞质内的Ca2+信号。本文介绍一种利用荧光染料和共聚焦显微镜在活细胞中同时检测线粒体Ca2+摄取和ΔΨm的方法。...

活细胞中线粒体钙与线粒体膜电位的荧光显微镜同步检测

本方案旨在逐步描述一种检测SH-SY5Y细胞分离线粒体的Ca2+保留能力及Ca2+诱导线粒体肿胀的方法。...

线粒体 Ca2+ 保留能力检测与 Ca2+ 诱导的线粒体肿胀检测

本文介绍了两种用于测量分离线粒体和培养细胞中线粒体 Ca2+ 内流的实验方案。针对分离的线粒体，我们详细描述了一种基于酶标仪的 Ca2+ 摄取检测方法，该方法使用对 Ca2+ 敏感的染料钙绿素绿-5N（calcium green-5N）。对于培养细胞，我们描述了一种使用 Ca2+ 染料 Rhod-2/AM...

分离线粒体与培养细胞中线粒体钙离子内流的分析

本方案旨在提供一种方法 体外 和 体内 线粒体 Ca2+...

成像线粒体 Ca2+ 星形胶质细胞和神经元中利用基因编码Ca探针检测摄取2+ 指示剂（GECIs）

代谢适应对T细胞至关重要，因其决定了T细胞的分化、存续及细胞毒性。本文介绍一种优化的用于监测线粒体呼吸的方案 离体 展示经细胞因子分化的原代人T细胞。...

细胞因子分化的原代人T细胞中线粒体呼吸的实时监测

我们提出了一种利用共振拉曼光谱法（RRS）无创、实时监测线粒体健康状况的方法。我们采用RRS定量分析线粒体的氧化还原状态，并建立了一种评估线粒体健康的指标——共振拉曼还原线粒体比率（3RMR），该指标对氧合状态变化的响应速度优于传统的血气分析物。...

利用共振拉曼光谱实时无创评估线粒体功能

学习合成与纯化钌基线粒体钙吸收抑制剂的方法，该方法可制备出比市售产品效力高十倍的类似物。此技术为线粒体钙生物学研究提供了高纯度、高效能的研究工具。

钌基线粒体钙摄取抑制剂的合成与评价

探索更多视频