Name: 小鼠垂直套胃切除术的动物模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 了解小鼠垂直套胃切除术的动物模型，用于研究肥胖症及其并发症的治疗机制。该方法通过模拟减重手术的健康益处，帮助识别肥胖治疗的新靶点，为代谢疾病研究提供重要工具。

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本研究得到了美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（NIH/NCI）R21CA195002-01A1项目、康奈尔大学女性总统委员会以及纽约州立大学研究生多样性奖学金的支持。Cummings博士的实验室在项目期间还获得了康奈尔大学比较癌症生物学培训项目和礼来公司（Eli Lilly and Company）的资助。

所有实验方案均已获得康奈尔大学机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 术前准备
注意：研究小鼠通常采用C57BL饮食诱导肥胖背景，以使研究结果更贴近人类肥胖和胰岛素抵抗的实际情况。雄性和雌性小鼠均可按照后续步骤进行研究。
<ol>
	<li>2个月大时，将小鼠置于45%或60%高脂饮食中喂养2个月（参见 材料表). 
	注意：小鼠喂食高脂饮食以诱导肥胖和胰岛素抵抗表型。根据研究目标，高脂饮食喂养时间可适当缩短或延长。</li>
	<li>继续喂养小鼠 随意摄取 直至手术。如果需要基线测量，在高脂饮食喂养7周后，禁食小鼠6小时或过夜，采集基线血液样本用于检测目标代谢物（例如， 葡萄糖</li>
	<li>继续让小鼠维持高脂饮食，并在采血后给予一周恢复时间，随后进行假手术或袖状胃切除术（VSG）。将小鼠转为液体饮食（参见 材料表手术前4天 
	注意：小鼠在手术前后需维持液体饮食，以清除消化道内的颗粒物质，避免影响愈合反应。</li>
	<li>手术前对以下物品进行灭菌：铝箔、纱布、棉签、手术器械（止血钳、手术剪、虹膜剪、杜蒙特镊、带齿布朗-阿德森镊、灌胃针、微针驱动器、弹簧剪）。</li>
</ol>
2. 垂直袖状胃切除术与假手术操作
<ol>
	<li>手术当天称量小鼠体重，以获得基线体重数据。</li>
	<li>在手术室内配备麻醉系统、加热水浴锅和加热垫。将水浴锅温度设定为 37 °C，用于预热0.9%生理盐水以备灌洗。用70%乙醇清洁手术区域，并采用无菌技术打开经高压灭菌的手术包及器械。 
	注意：加热垫用于在手术期间及麻醉恢复过程中保持动物体温。</li>
	<li>使用诱导室，以5%异氟烷和O₂麻醉小鼠2 1 L/min 的流速。通过脚趾夹捏确认小鼠处于适当的麻醉平面。使用 1–3% 异氟烷和 O2 在达到稳定的麻醉平面后，以0.6 L/min的流速给药。</li>
	<li>小鼠麻醉后，将眼药膏（见材料表）涂抹于其眼睛上，以保持手术期间角膜湿润。同时给予镇痛药物，如美洛昔康（2 mg/kg，皮下注射）。从脐部至腋窝区域剪毛，剪毛时轻轻拉紧皮肤以提供适当张力。
	<ol>
		<li>由于小鼠皮肤薄而脆弱，剪毛时需小心避免造成皮肤损伤。用聚维酮碘和酒精清洁皮肤。</li>
		<li>戴上无菌手套，准备无菌手术区域和器械。后续操作均需采用无菌技术进行。通过在小鼠两侧放置无菌手术巾来建立无菌手术区域。使用经高压灭菌的锡箔为小鼠制作手术巾。</li>
		<li>在锡箔上剪一个小孔，以便接触小鼠的腹部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从腹部中线（脐部）至剑突水平，使用虹膜剪在皮肤上做一切口。辨认白线，并用虹膜剪沿白线剪开腹壁。使用组织钳（CTAs）轻柔地将胃从腹腔中提起，随后钝性分离胃大弯上的大网膜。</li>
	<li>结扎位于胃底与脾脏之间走行的胃短动脉，使用7-0单丝可吸收缝线放置两道结扎线。用弹簧剪在两道结扎线之间剪断血管。动脉离断后，将胃完全外置于腹腔外。在胃下方垫置纱布并以生理盐水润湿，以保持组织湿润。</li>
	<li>假手术操作
	<ol>
		<li>假手术操作中，使用6-0单丝可吸收缝线配合锥形针，以疏松的单纯连续缝合方式缝合。进针点始于食管右侧（术者视角右侧）2 mm处，缝合线沿胃腹侧壁走行，随后延续至胃背侧壁。 
		注意：所有胃部操作均应仅使用单丝可吸收缝线，以降低感染风险。此外，所有胃部操作均应仅使用带圆针（taper needle）的缝线，因为使用带刃针（cutting needle）会增加缝线撕裂组织的风险。 &#34;拉出法&#34; 导致胃组织损伤和伤口裂开。</li>
		<li>在放置缝线时，将针完全穿过一侧胃壁。确保缝线平贴，但不要限制胃部活动。轻柔地打结，使用3-4次绕线，然后跳至步骤2.9。</li>
		<li>对于VSG手术，跳过步骤2.7，继续进行步骤2.8。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>VSG 手术
	<ol>
		<li>对于VSG手术，使用7-0单丝可吸收缝线配合锥形针，以三重结结扎胃动脉和胃静脉的显著分支。结扎位置应位于（下方）即朝向胃小弯处的预定切断线。 
		注意：预定的切线始于胃贲门切迹上方约 2 mm 处（即朝向胃大弯方向），并位于齿状线至少 2 mm 以下，延伸至胰腺右叶近端。通常每侧胃壁有 4 条血管需要结扎；然而，该数目在不同小鼠之间可能存在差异。</li>
		<li>为防止胃切除术中胃内容物溢出，使用6-0单丝可吸收缝线配圆锥形针，在预定横断平面下方穿过胃前后壁，行单纯连续缝合。缝合起始于食管右侧、齿状线以下，终止于胰腺上方。</li>
		<li>在缝合线以上放置细尖止血钳，使用弹簧剪在缝合线与止血钳之间进行剪切。将切除的胃组织从无菌手术区域移除。使用CTAs清理胃表面的血液和消化物。</li>
		<li>使用6-0单股可吸收缝线和圆锥形针，以单纯间断缝合方式加强胃壁的对合。 
		注意：推荐使用简单的间断缝合模式，因为与连续缝合模式相比，该方法可提供更牢固的闭合效果。</li>
		<li>在整个操作过程中，用生理盐水冲洗胃残端，以保持组织湿润和清洁。使用连接20 mL注射器的20G灌胃针进行生理盐水洗胃。选择此规格可确保提供足够的压力，同时避免因压力过大或使用普通尖头针而导致胃组织损伤。</li>
		<li>使用至少20个结来牢固闭合胃部；注意沿食管侧进行闭合，因为该侧较难操作，常成为裂开的部位。</li>
		<li>通过轻轻按压腹部的CTA检查是否存在渗漏。如果发现渗漏，应在渗漏部位加做额外的间断单纯结扎，然后再次进行渗漏测试。重复测试直至未检测到渗漏为止。</li>
		<li>使用至少60 mL生理盐水对胃进行最终的彻底灌洗，以确保无任何感染性颗粒物质残留。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用CTA将胃放回肝脏下方的腹腔内。沿腹腔背侧放置CTA以吸收所有多余液体。在关闭腹腔前，使用钝头18G针头将乳酸林格液（LRS）（0.5 mL LRS ± 20 mg/kg 恩诺沙星）直接注入腹腔。 
	注意：这可以补充手术过程中流失的体液，并提供一种将抗生素直接应用于手术部位的方法，以促进恢复。</li>
	<li>使用6-0单丝可吸收缝线配合圆锥形针，以单纯间断缝合法关闭腹肌层。随后使用6-0单丝可吸收缝线，以单纯连续缝合法关闭皮肤层。</li>
	<li>将组织粘合剂涂抹于皮肤表面，然后将皮肤覆盖在缝合线上，以埋藏缝线，防止小鼠术后抓挠破坏伤口闭合。</li>
	<li>关闭异氟烷，将小鼠留在加热垫上恢复10-15分钟，然后放回其原代饲养笼。在动物恢复意识并能够自主活动之前，不得无人看管。</li>
	<li>手术后将动物单独饲养，直至完全恢复。 
	注意：若需在整个研究过程中获得准确的摄食量测量数据，小鼠在整个研究期间应持续单只饲养。食用笼内垫料可能导致异物阻塞风险。除提供丰富环境的筑巢材料外，动物应饲养在无垫料的笼具中（参见 材料表).</li>
</ol>
3. 小鼠术后护理与测量
<ol>
	<li>将小鼠放回其饲养笼，并将笼子置于加热垫上。术后至少7天内维持小鼠液体饮食。术后连续2天给予镇痛药，例如美洛昔康（2 mg/kg，皮下注射）。
	 
	注意：可根据需要在术后最多7天内给予抗生素，例如恩诺沙星（20 mg/kg）。抗生素的使用旨在降低手术过程中感染的风险，是否使用取决于整个操作过程中无菌条件的维持水平。然而，若使用抗生素，则必须对同一研究中的所有小鼠均给予抗生素，以保持实验一致性。</li>
	<li>术后期间应至少每天评估一次小鼠的体重、摄食量、排便情况、活动水平和精神状态，以确保其正常愈合与恢复。术后监测应持续14天。
	 
	注意：手术失败通常在术后立即或术后三天内出现。若小鼠在术后第二天仍未进食或饮水，需密切监测是否存在手术相关并发症。</li>
	<li>成功完成术后恢复期后，在整个研究过程中应定期测量小鼠体重和摄食量，以确保其表型维持在预期状态。</li>
	<li>进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT），以评估葡萄糖耐受能力、葡萄糖刺激的胰岛素分泌以及肠道激素分泌情况。
	<ol>
		<li>在禁食6小时后对小鼠进行口服葡萄糖耐量试验，通过灌胃给予50%葡萄糖溶液，剂量为1 g/kg。</li>
		<li>在灌胃后0、2.5、5、15、30、60和120分钟时采集尾部血液样本。使用血糖仪测定各时间点的血糖水平。同时在每个时间点收集血清样本，用于检测多种激素，如胰岛素和GLP-1。</li>
		<li>在安乐死前对小鼠禁食6小时。采集最后一次血液样本并测定血糖值。将最终血糖测量值与基线值进行比较。通过腹腔注射戊巴比妥（200 mg/kg）实施安乐死。</li>
		<li>利用基线和最终采集的血清样本检测其他分析物，并比较手术前后各项指标的变化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Ryan, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FXR+is+a+molecular+target+for+the+effects+of+vertical+sleeve+gastrectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">FXR is a molecular target for the effects of vertical sleeve gastrectomy.</a> Nature. 509 (7499), 183-188 (2014).</li>
<li>Wilson-Perez, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical+sleeve+gastrectomy+is+effective+in+two+genetic+mouse+models+of+glucagon-like+Peptide+1+receptor+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Vertical sleeve gastrectomy is effective in two genetic mouse models of glucagon-like Peptide 1 receptor deficiency.</a> Diabetes. 62 (7), 2380-2385 (2013).</li>
<li>Pressler, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical+sleeve+gastrectomy+restores+glucose+homeostasis+in+apolipoprotein+A-IV+KO+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Vertical sleeve gastrectomy restores glucose homeostasis in apolipoprotein A-IV KO mice.</a> Diabetes. 64 (2), 498-507 (2015).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突，但Cummings博士获得了礼来公司（Eli Lilly and Company）的资助。

减重手术是治疗肥胖最有效的长期方法，并能带来其他健康益处，例如2型糖尿病和高血压的高缓解率1,9,15。减重手术的小鼠模型为揭示减重手术如何快速且显著改善肥胖相关合并症的机制提供了有力工具。此外，减重手术的小鼠模型也为研究肠道调控多种生理过程（如代谢、心血管功能和致癌作用）的基础生物学提供了新的研究范式10,11,12。
我们开发了一种小鼠垂直袖状胃切除术模型，用于研究减重手术改善肥胖相关合并症（如2型糖尿病和高血压）的机制10,11,12...

随着全球肥胖流行病的持续加剧，减重手术因其作为治疗肥胖最有效的长期手段而日益普及1。遗憾的是，通过饮食和运动减重在长期效果上难以实现且相对无效2,3。减重手术（如垂直袖状胃切除术，VSG）是指通过对外胃肠道进行操作以达到减重目的的手术方式1,4。尽管减重是减重手术显著的结果之一，但该手术还能带来其他健康益处，例如改善肥胖相关合并症并延长寿命5。例如，减重手术可显著提高2型糖尿病和高血压的缓解率，并降低某些类型癌症终生发病风险1,6,7。值得注意的是，减重手术对2型糖尿病和高血压的缓解作用通常在术后不久即出现，早于体重下降的发生8,9。这表明，手术后观察到的健康益处中存在独立于体重变化的机制。目前已建立并广泛应用减重手术的动物模型，用于研究这些健康益处发生的潜在机制10,11,12。
我们已验证了一种VSG小鼠模型，并将其应用于多种基因修饰小鼠模型，以研究减重手术改善肥胖相关共病（如2型糖尿病、高血压和结直肠癌）的机制10,11,12。啮齿类动物模型可实现更严格的实验控制，并允许进行基因或药物干预，从而明确特定基因或信号通路的功能。我们主要聚焦于VSG，因为VSG是美国临床实践中最常开展的减重手术术式13。此外，与其他术式（如Roux-en-Y胃旁路术或胆胰分流术）相比，VSG是一种解剖结构改变较少的简单手术模型。
我们的VSG小鼠模型重现了在人体中观察到的减重手术的以下效应：体重减轻、摄食量减少、葡萄糖调节改善、胰岛功能改善、餐后胰高血糖素样肽-1（GLP-1）分泌增加、动脉血压降低以及循环胆汁酸浓度升高10,11,12,13,14,15。因此，该模型是研究VSG改善或缓解肥胖相关合并症的体重依赖性和非依赖性机制的理想模型。此外，该模型具有良好的可靠性，可与其他手术操作联合使用，从而能够在多种疾病条件下更深入地探究VSG的作用机制12。

<table><tbody><tr><td>45% 高脂饮食</td><td>Research Diets</td><td>D12451</td><td></td></tr><tr><td>60% 高脂饮食</td><td>Research Diets</td><td>D12492</td><td></td></tr><tr><td>Boost</td><td>雀巢</td><td>160-67538</td><td>浓郁巧克力味</td></tr><tr><td>6-0 缝合线</td><td>Ethicon</td><td>Z432</td><td>单丝可吸收/锥形</td></tr><tr><td>7-0 缝合线</td><td>Covidien</td><td>8866127-01</td><td>单丝可吸收/锥形</td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-118</td><td>小号</td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisherbrand</td><td>233-400-101</td><td>大号</td></tr><tr><td>纱布</td><td>Various</td><td></td><td>4×4 四层和 2×2 四层</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术铺巾</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9% 生理盐水溶液</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LRS</td><td>Hospira</td><td>170RX</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酒精</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>眼药膏</td><td>Paralube&amp;reg; Vet Ointment</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>组织粘合剂</td><td>Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>美洛昔康（Metacam）</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>141-213</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>恩诺沙星</td><td>Baytril</td><td>08713254-186599</td><td>22.7 mg/ml</td></tr><tr><td>细头止血钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>13021-12</td><td></td></tr><tr><td>梅岑鲍姆剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14018-18</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>杜蒙特镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>有齿镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11020-12</td><td></td></tr><tr><td>灌胃针</td><td>Fine Science Tools</td><td>18060-20</td><td></td></tr><tr><td>微针驱动器</td><td>Fine Science Tools</td><td>12075-14</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 mL 注射器</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血糖仪（One Touch Ultra Mini）</td><td>Lifescan</td><td>70021208</td><td></td></tr><tr><td>多重胰岛素和 GLP-1 检测试剂盒</td><td>Meso Scale Discovery</td><td>K15171C-1</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.00</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestlets</td><td>Ancare</td><td>NES3600</td><td></td></tr></tbody></table>

一种小鼠垂直袖状胃切除术模型

A Murine Model of Vertical Sleeve Gastrectomy

减重手术（如垂直袖状胃切除术，VSG）是一种为减重目的而实施的胃肠道手术。目前，减重手术是治疗肥胖最有效的长期手段。除了减轻体重外，减重手术还能带来其他健康益处，例如2型糖尿病缓解、高血压缓解，以及降低某些类型癌症的发病风险。这些益处中超出减重本身的作用机制尚未完全阐明。因此，研究人员正在开发和验证减重手术的动物模型，以明确产生这些益处的机制，从而增进对胃肠道生理学的理解，并发现新的治疗靶点。在美国临床实践中，VSG已成为最常见的减重手术术式，因其在减轻体重和改善代谢方面效果显著，且操作较其他减重手术更为简便。为此，我们开发并验证了一种小鼠VSG模型。该小鼠VSG模型可重现人类VSG的多种效应，包括改善血糖和血压调节。该方法基于胃的游离、胃血管结扎，并沿胃大弯横断切除约70%的胃组织。我们已成功将该手术方案应用于多种基因修饰小鼠品系，以明确介导VSG益处的机制性因素。此外，该小鼠VSG模型还可与其他外科技术联合使用，以获得更深入的机制性认识。因此，这是一种简单且用途广泛的模型，可用于研究胃肠道生理学及减重手术带来的健康益处。

假手术和垂直袖状胃切除术（VSG）的操作过程如图1所示。图1A展示了假手术期间缝合线沿胃壁放置的位置，该位置也正是VSG手术中进行胃切割的部位。图1B展示了VSG手术后所保留的管状胃残余部分。
统计学与数据分析 
数据以均值 ± 标准误表示。根据所示，采用带 Tukey 事后检验的方差分析（ANOVA）或学生 t 检验进行数据分析。当 P&lt;0.05 时认为差异具有统计学显著性。
VSG 降低能量摄入和体重，并改善葡萄糖耐量 
饲喂高脂饮食的雄性C57BL...

以下描述了在小鼠中进行垂直袖状胃切除术的操作过程。这是一种减重手术，需切除大约70%的胃组织。

减重手术（如垂直袖状胃切除术，VSG）是一种针对胃肠道的外科手术，旨在减轻体重。

本实验的总体目标是在小鼠中建立垂直袖状胃切除术的健康益处模型。该方法有助于回答肥胖研究中的关键问题，即减重手术改善肥胖及其共病的具体机制。该技术的优势在于，它为研究这些机制提供了模型，有助于发现治疗肥胖及其共病的新型靶点。开始操作前，将麻醉小鼠的眼睛涂抹兽用眼膏，并将小鼠置于加热垫上。从脐部至腋窝区域小心去除毛发，拉紧皮肤以避免造成皮肤损伤；使用棉签依次以聚维酮碘和乙醇对暴露的皮肤进行消毒。佩戴无菌手套并采用无菌操作技术，在动物两侧放置无菌手术巾。在铝箔上剪一个小孔，以便接触小鼠的腹部，并使用一片经高压灭菌的铝箔作为手术巾。从腹部中线至剑突软骨处做皮肤切口。在解剖显微镜下，用虹膜剪沿腹白线剪开体壁。使用新的棉签轻轻将胃从腹腔中抬起。钝性分离大网膜与胃大弯。然后使用7-0单丝可吸收缝线，在胃底与脾脏之间走行的短胃动脉周围放置两道结扎线。放置两条结扎线后，使用弹簧剪在两条缝线之间剪开，将胃完全从腹腔内翻出。在胃下方放置纱布，并用生理盐水湿润器官。对于假手术操作，使用带圆锥形针头的6-0单丝可吸收缝线，在食管右侧2毫米处的胃腹侧壁开始，沿胃背侧壁进行宽松的连续单纯缝合。确保缝线平放，不要限制胃部，并用三到四个结轻柔地打结固定。对于垂直袖状胃切除术，使用带圆锥形针头的7-0单丝可吸收缝线，在预定切断线稍下方结扎胃动脉和静脉的显著分支。在预定切断线稍下方，通过两层胃壁使用6-0单丝可吸收缝线进行连续单纯缝合，以防止胃内容物溢出。将细尖止血钳置于缝合线之上，使用弹簧剪在缝合线与止血钳之间进行剪切。移除被切断的胃组织，并使用新的棉签清洁胃部的血液和消化物。采用带圆针的6-0单股可吸收缝线，以单纯间断缝合法加强胃壁的对合。使用连接20毫升注射器的20号灌胃针，用新鲜生理盐水进行胃灌洗，并用不少于20个结牢固闭合胃部。然后用棉签轻轻按压胃部，检查是否有泄漏。若未检测到泄漏，再用至少60毫升新鲜生理盐水灌洗胃腔，以清除任何感染性颗粒物。经过任一操作后，使用棉签将胃部复位于肝脏下方并放回腹腔内，并将棉签置于腹腔背侧以吸收任何过量液体。使用钝头18号针头将乳酸林格液（可含或不含抗生素）直接注入腹腔内，然后使用6-0单股可吸收缝线以单纯间断方式缝合腹肌层，以单纯连续方式缝合皮肤层。随后在皮肤上涂抹组织粘合剂，并将皮肤褶皱覆盖于缝合线之上，以防止动物活动导致缝线断裂。接受垂直袖状胃切除术并饲喂高脂饮食的小鼠，其能量摄入和体重均低于自由进食且接受假手术的小鼠。与假手术且自由进食的对照小鼠相比，垂直袖状胃切除术可改善葡萄糖耐量，增加葡萄糖刺激的胰岛素分泌，并提高餐后胰高血糖素样肽-1的分泌水平，这些结果与在人类及其他肥胖手术啮齿动物模型中观察到的效应一致。一旦掌握该手术技术，整个操作应在90分钟内完成。学习该操作步骤时，重要的是要牢记在处理胃肠道时动作务必轻柔。胃肠道是小鼠体内非常敏感的器

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生物学

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一种小鼠垂直袖状胃切除术模型

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