利用流式细胞术分析单只小鼠单侧坐骨神经和背根神经节中的免疫细胞

本实验的总体目标是从单只小鼠的背根神经节和坐骨神经中获取足够数量的细胞，以便能够进行细胞流式分析。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为外周神经组织在消化过程中会产生大量碎片。该方法的主要优势在于可同时使用多种标记物来鉴定多种细胞类型。

该技术的应用前景涉及神经病变过程中炎症与免疫病理的诊断。尽管该方法可为小鼠模型提供研究依据，但经过微小修改后，也可应用于其他生物体，如人和猪的神经组织。通常，初次接触该方法的研究人员会因消化过程中产生的大量碎片而遇到困难。

该方法的可视化演示至关重要，因为每只小鼠提供的神经组织量有限，使得解剖和细胞分离步骤难以操作。我们最初产生该方法的想法，是源于看到了Steve Lacroix实验室发表的一项从坐骨神经中分离雪旺细胞的实验方案。首先，按照配套文字版实验方案所述准备小鼠，并将其腹侧朝下放置，同时伸展其下肢。

接下来，使用镊子双侧分离完整的坐骨神经。首先从大腿背侧上方分离肌肉组织，并沿脊柱方向追踪神经走向。在神经从脊柱发出的位置以及另一端膝关节上方的位置立即切断神经。

然后将切除的神经转移至含有1毫升冰上预冷的PBS的1.5毫升离心管中，将神经置于冰上保存。接下来，分离背根神经节。

首先沿脊柱两侧平行且紧邻脊柱的方向切开肋骨。然后，在后侧于股骨水平位置横向切断脊柱，在前侧靠近颅骨处横向切断脊柱。移除脊柱，并使用虹膜剪从脊柱上剪除所有肌肉、脂肪及其他软组织。

接下来，将脊柱腹侧朝上放置，从尾端开始剪开。将剪刀的一侧刀尖从12点钟位置插入椎管，剪断骨骼。沿脊柱继续操作，直至完全切开；随后在6点钟位置重复此步骤，将脊柱完全分为两半。分离脊柱的两半后，将样本置于解剖显微镜下。

取出脊髓以暴露脊神经，然后通过轻拉背根将其拉入椎管，找到并摘除腰段背根神经节。接着，使用虹膜剪剪断背根神经节周围的神经和结缔组织。用镊子将背根神经节转移至一个1.5毫升离心管中，并置于冰上保存。

定位背根神经节，将其完整无损地分离并去除脊神经，需要练习和技巧。准备消化液，加入终浓度为每毫升100微克的脱氧核糖核酸酶，并置于冰上保存。然后，向每支含有坐骨神经和背根神经节的试管中加入500微升消化液。

对于坐骨神经，使用弹簧剪将组织剪切15至20次，然后将组织悬液置于37摄氏度的摇床培养箱中，轻柔振荡孵育20分钟。孵育结束后，用1,000微升移液枪头反复吹打细胞悬液，以机械方式解离任何未完全消化的组织。重复使用1,000微升移液枪头进行吹打操作。

然后在37摄氏度下轻轻振荡，将样品额外孵育10分钟。配制冰冻的FACS缓冲液，并用其冲洗并浸泡置于冰上60毫米培养皿中、孔径为140微米的不锈钢滤网。接着，用钝头镊子夹住140微米的筛网滤器，使其覆盖在培养皿上方，反复将组织悬液通过滤器过滤。

从培养皿中收集细胞悬液，并转移至同一置于冰上的1.5毫升离心管中。使用1,000微升移液器枪头反复吹打，将滤膜上残留的未完全消化的组织推过滤膜。随后，用500微升FACS缓冲液冲洗滤膜两次，并将冲洗液合并至1.5毫升离心管中的细胞悬液中。

如果样本消化不充分的部分过多并穿过滤网，可能导致细胞丢失，从而无法进行流式细胞术分析。将细胞悬液离心并弃去上清液，然后用一毫升 FACS 缓冲液重悬细胞沉淀。

重复此洗涤步骤一次，将最终的细胞沉淀重悬于 150 至 350 微升的 FACS 缓冲液中。细胞现在已准备好进行染色。在计算机上，选择用于检测目标荧光染料的适当通道、样品的合适流速，以及每份样品需采集的总事件数。

最低事件数应为一百万。接下来，在全局工作表中创建侧向散射A对前向散射A的散点图，以及每种目标荧光染料对前向散射A的散点图。同时创建一个统计视图，以显示所选荧光染料的事件数量和平均荧光强度。根据仅用DAPI染色的对照样本的散点图确定父门P1。

将样本连接至流式细胞仪并点击采集。观察DAPI与FSC的散点图，逐步降低DNA Pacific Blue通道的电压，直至DAPI+细胞群可见。使用矩形圈门工具，在DAPI+细胞群周围绘制一个矩形门。

这代表 P1 门。选择每种荧光染料的散点图，并仅显示 DAPI+ 事件。这代表每种荧光染料的背景荧光。

使用矩形门控工具，在每种荧光染料的散点图中绘制一个方框，从 y 轴的 103 处开始。该门控区域表示所述各标记物阳性事件应出现的范围。利用仅用 DAPI 染色的对照样本，调整每种荧光染料的电压。

将样本连接至流式细胞仪并点击采集。观察每种荧光染料对应的 DAPI+ 群体的位置，并调整相应的电压，使这些群体位于矩形门控区域之外。流式细胞仪设置完成后，运行样本并导出前向散射文件以供进一步分析。

在流式细胞术分析前洗去DAPI染色剂可降低无核碎片的荧光强度。这使得位于前向散射轴高端、含有未完全消化组织的物质能够在单细胞群体的选中过程中被排除。总体而言，两条完整的坐骨神经通常可获得超过30,000个单细胞，而背根神经节可获得超过200,000个单细胞。

从坐骨神经中，约有5%的单细胞在其表面表达CD45，而在背根神经节中，约有5%至10%的细胞表达CD45，据此可将这些细胞定义为起源于造血系统的白细胞。大部分CD45阳性的单细胞也以渐进的方式表达MHC II类分子。在背根神经节中，CD11b可用于检测类似小胶质细胞的细胞，然而这类小胶质细胞群体在坐骨神经中并不存在。

在坐骨神经和背根神经节中，2%至5%的单个细胞表达CD68。在坐骨神经中，大约60%至80%的CD68阳性巨噬细胞表达CD206，而在背根神经节中，CD68阳性细胞共表达CD206的比例较小。

在执行该操作过程中，保持恒定的温度至关重要，以确保结果的一致性。该技术建立后，使得糖尿病领域的研究人员能够探索用于诱导小鼠糖尿病的链脲佐菌素的毒性作用。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对外周神经组织进行流式细胞术分析。

请勿忘记，使用多聚甲醛可能存在危险，因此应始终采取预防措施，例如佩戴手套和安全护目镜。