Name: 应用流式细胞仪分析单侧坐骨神经和背根神经节的免疫细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: 了解如何使用流式细胞仪分析小鼠坐骨神经和背根神经节中的免疫细胞。该方法可同时检测多种标志物以识别不同细胞类型，有助于研究神经炎症和免疫病理学。

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本研究由德国研究基金会（DFG；SFB1118）资助。作者感谢Axel Erhardt完成了大部分解剖操作，并热心传授了相关知识，同时感谢Dr. Volker Eckstein在流式细胞仪技术方面的协助。

野生型 C57BL/6 小鼠（雄性；10–12 周龄）饲养于标准的 12 小时光照/12 小时黑暗循环环境中，可自由摄取标准饲料和水。所有动物实验均按照当地动物护理和使用委员会的相关指南进行，并经德国卡尔斯鲁厄地区主管部门的动物护理和使用委员会批准（G216/10）。
1. 小鼠灌注
<ol>
	<li>使用 CO₂ 处死小鼠（C57BL/6；雄性；10–12 周龄）2 或根据当地法规。 
	注意：可采用经EDTA包被的1.5 mL离心管通过眶后静脉丛采血获取对照组白细胞。该采血方法仅在动物处死后立即操作时有效。此外，可通过腹腔灌洗（PCL）获取对照组巨噬细胞，灌洗时应使用预热至37 °C的磷酸盐缓冲液（PBS），以避免血液发生冷凝集，从而影响灌注效果。</li>
	<li>用70%（v/v）乙醇充分喷洒小鼠腹部毛发进行消毒，并用带有棉纱布的纸巾反复擦拭。使用钝头剪刀沿纵轴切口剪开腹部皮肤。</li>
	<li>使用弯头钝头剪刀在膈肌上做一切口，随后沿整个肋骨全长延伸切口，以暴露胸膜腔。在对侧进行类似切口，直至可小心抬起胸骨。</li>
	<li>在清晰暴露心脏及主要血管后，将连接有50 mL冰浴PBS注射器的23¾号蝶形针插入心脏左心室。</li>
	<li>使用虹膜剪在心脏右心房做切口，尽可能扩大出口，但不得损伤降主动脉，然后轻轻按压注射器，推动约 30 mL PBS。流出液应变得澄清。肝脏和/或肾脏的澄清可作为灌注良好的指标。</li>
</ol>
2. 坐骨神经和背根神经节的解剖
注意：坐骨神经解剖时，需去除臀大肌上方的皮肤，并将小鼠腹侧朝下放置，同时伸展其下肢。
<ol>
	<li>通过分离上背部大腿的肌肉组织，双侧解剖坐骨神经全长，并沿脊柱方向追踪神经。在神经从脊柱发出处以及另一端膝关节上方立即切断神经。 
	注意：避免过度操作神经，例如用镊子挤压或牵拉。</li>
	<li>使用镊子将切除的神经（每根约 2 cm）转移至含有 1 mL 冰冷 PBS 的 1.5 mL 离心管中，并置于冰上保存。 
	注意：神经可在冰上保存过夜。 
	注意：对于背根神经节（DRG）的解剖，使用镊子和手术刀，轻轻剥离残留的背部皮肤，使皮下软组织分离，暴露颈椎、胸椎和腰椎脊柱区域。用钝头剪刀在颅底处剪断，移除头部。</li>
	<li>在脊柱两侧平行且紧邻脊柱处剪断肋骨，然后去除与脊柱前侧相连的内脏组织。剪断股骨，并在股骨水平处横向切断，移除整个脊柱。使用虹膜剪清除脊柱上的肌肉、脂肪及其他软组织。</li>
	<li>将脊柱背侧朝上放置，从尾端开始打开脊柱：将剪刀的一侧尖端插入椎管三点钟位置并剪除骨质；在九点钟位置重复该操作。 
	注意：必须精确沿中线切割，以避免损伤背根神经节（DRG）。</li>
	<li>重复侧向剪切，直至到达头端，完全暴露脊髓。在解剖显微镜下移除脊髓，以暴露脊神经，从而帮助定位脊柱内的背根神经节（DRG）。</li>
	<li>通过轻拉背根，将腰段 DRG 缓慢拉入椎管内，然后用虹膜剪剪断神经及结缔组织，以分离 DRG。 
	注意：可选择性收集 L4–L6 节段的 DRG，这些节段参与构成坐骨神经。</li>
	<li>使用镊子将 DRG 转移至含有约 1 mL 冰冷 PBS 的 1.5 mL 离心管中，并置于冰上保存。 
	注意：神经可在冰上保存过夜。</li>
</ol>
3. 坐骨神经和背根神经节的消化
<ol>
	<li>配制消化液（DMEM、10 mM HEPES、5 mg/mL BSA、1.6 mg/mL IV型胶原酶），并加入100 µg/mL脱氧核糖核酸酶，置于冰上保存。 
	注意：每只小鼠（坐骨神经 + 背根神经节）所需消化液的体积为1 mL。配制完成后，可将消化液分装后于-20 °C保存。</li>
	<li>将一只小鼠的坐骨神经和背根神经节分别转移至含有500 µL消化液的1.5 mL离心管中。对于坐骨神经，使用弹簧剪将其剪成15–20小段，然后将组织悬液在37 °C摇床中孵育20分钟，轻柔振荡（≤ 450 rpm）。</li>
	<li>使用1,000 µL移液枪头反复吹打细胞悬液，以机械方式解离未完全消化的组织。 
	注意：若悬液难以吹打，可用剪刀剪去枪头尖端以形成钝口。将组织悬液在37 °C孵育20分钟，轻柔振荡（≤ 450 rpm）。</li>
	<li>再次使用1,000 µL移液枪头进行吹打，并在37 °C继续孵育10分钟，轻柔振荡（≤ 450 rpm）。</li>
	<li>配制FACS缓冲液（含10% FCS和1 mM EDTA的PBS），置于冰上。将孔径为140 µm的不锈钢筛网在冰上的60 × 15 mm培养皿中用FACS缓冲液冲洗并浸泡。 
	注意：应避免使用尼龙筛网过滤器，因其会导致有核细胞得率显著降低。</li>
	<li>将组织悬液置于冰上，用钝头镊子夹持140 µm筛网过滤器覆盖于培养皿上方，反复使悬液通过筛网。从培养皿中收集细胞悬液，并转移至另一个置于冰上的新1.5 mL离心管中。</li>
	<li>使用1,000 µL移液枪头反复吹打，将残留在滤网上的未完全消化的组织推过筛网。用500 µL FACS缓冲液冲洗筛网两次，并将所得细胞悬液收集至培养皿中，与步骤3.6的细胞悬液合并。 
	注意：若所用流式细胞仪对碎片敏感，可将步骤3.7的细胞悬液再通过70 µm筛网过滤；但此操作可能导致有核细胞得率下降。</li>
	<li>将细胞悬液在4 °C下以300 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL FACS缓冲液中。重复洗涤一次。</li>
	<li>根据所需染色组合的数量，将细胞沉淀重悬于150–350 µL FACS缓冲液中（每种染色组合需150 µL FACS缓冲液）。</li>
</ol>
4. 使用荧光标记抗体对坐骨神经和背根神经节进行染色以用于流式细胞术
<ol>
	<li>将100 µL坐骨神经或背根神经节细胞悬液转移至预置于冰上的96孔板的V型孔中。 
	注意：使用的所有抗体均需设置单染细胞，因其可为流式细胞术的光电倍增管（PMT）电压增益和补偿设置提供必要的对照，并有助于区分特异性与非特异性结合。由于坐骨神经和背根神经节（DRGs）可获取的材料有限，可采用坐骨神经结扎（PCL）模型中的血液白细胞和巨噬细胞（步骤1.1–1.2）作为单染对照，其染色应与坐骨神经和DRGs的染色平行进行。</li>
	<li>将来自坐骨神经或DRG样本的剩余细胞悬液（每份样本约50 µL）合并，作为未染色对照。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟。将板倒置于废液容器上方，通过快速甩动手腕弃去上清液，然后在纸巾上轻轻拍干。</li>
	<li>对于表面染色，将每个细胞沉淀重悬于20 µL含有目标抗体（CD45-A647、CD11b-PerCP/Cy5.5和MHC II类分子-Biotin）的FACS缓冲液中，避光冰上孵育30分钟。 
	注意：（1）最佳抗体稀释度应在使用前通过根据生产商产品信息进行系列稀释实验确定；（2）在此步骤中，可根据生产商说明书通过加入Fc阻断剂孵育以减少非特异性染色；（3）当使用直接偶联荧光染料的初级抗体和/或目标抗原可产生明显分群时，通常无需进行同型对照染色。</li>
	<li>向每孔中加入130 µL FACS缓冲液，在4 °C下以400 × g离心5分钟。弃去上清液（同前，步骤4.3），用150 µL FACS缓冲液将细胞沉淀洗涤两次。 
	注意：如果使用未标记的一抗或生物素标记的一抗，则可在此时加入相应的荧光标记二抗，并重复步骤4.4–4.5。在本实验方案中，分别使用链霉亲和素-PE/Cy7或链霉亲和素-PerCP检测MHC II类分子，与CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5组合，或与CD68-APC和F4/80-PE/Cy7组合。</li>
	<li>固定时，在最后一次洗涤步骤后，将细胞沉淀重悬于 100 µL 含 4% 多聚甲醛的 PBS（pH 7.4）中。将培养板置于冰上孵育 10 分钟，然后在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟。弃去上清液（操作同前，步骤 4.3），再用 150 µL FACS 缓冲液洗涤细胞沉淀一次。 
	注意：多聚甲醛有毒性，需佩戴适当的防护装备，如手套和护目镜。 等等. 
	注意：将细胞沉淀重悬于150 µL FACS缓冲液中，避光保存于4°C，可存放最多两天。若无需进行细胞内染色，则在4°C下以400 × g离心5分钟后，继续进行步骤4.11。</li>
	<li>对于细胞内染色，将细胞沉淀重悬于150 µL含0.5%去污剂的FACS缓冲液中，室温避光孵育15分钟。在4 °C下以400 × g离心5分钟。弃去上清液（操作同前，步骤4.3），用150 µL含0.5%去污剂的FACS缓冲液洗涤细胞沉淀一次。将细胞沉淀重悬于20 µL含目的抗体（CD68-APC，CD206-PE）及0.5%去污剂的FACS缓冲液中，室温避光孵育30分钟。</li>
	<li>加入130 µL含0.5%去垢剂的FACS缓冲液至各孔中，于4 °C下以400 × g离心5分钟。弃去上清液（操作同前，步骤4.3），用150 µL含0.5%去垢剂的FACS缓冲液将细胞沉淀洗涤两次。 
	注意：如果使用未标记的一抗或生物素标记的一抗，此时可加入相应的荧光染料标记的二抗，并重复步骤4.9–4.10。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于150 µL含0.5%去污剂的FACS缓冲液中，避光保存于4 °C，可存放至多两天。</li>
	<li>用150 µL含0.5%去垢剂并补充5 µg/mL DAPI的FACS缓冲液重悬细胞沉淀，在室温避光孵育5分钟。在4 °C下以400 × g离心5分钟。弃去上清液，操作同前（步骤4.3）。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于150 µL PBS中，转移至相应标记的FACs管中。避光、室温保存，待分析时使用。 
	注意：细胞在 PBS 中重悬后应在数小时内进行分析，因为 DAPI 会缓慢从 DNA 上解离，导致信号减弱。</li>
</ol>
5. 流式细胞术的设置与样本检测
<ol>
	<li>确保流式细胞仪配备了适当的激光器和/或滤光片组，以检测用于染色细胞的荧光染料。这可在系统的默认细胞仪配置下确定。在本方案中，使用配备三种激光器（405 nm、488 nm 和 633 nm）的流式细胞仪分析细胞，可检测 ≤ 5 种荧光染料。</li>
	<li>选择用于检测目标荧光染料的合适通道。所有荧光信号均建议采用对数放大方式进行检测。</li>
	<li>为样本选择合适的流速。该参数可能因所用系统而异，需通过实验经验确定。在本方案中，采用中至高流速（MED-to-HI，35–60 µL/min），以防止进样针堵塞。</li>
	<li>设定每个样本需采集的总事件数/细胞数。最低事件数应为 1,000,000。</li>
	<li>在全局工作表中创建散点图，包括SSC-A 与 FSC-A 的关系图，以及每种目标荧光染料与 FSC-A 的关系图。创建一个统计视图，以显示所选荧光染料的事件数量和平均荧光强度（MFI）。</li>
	<li>设置 FSC-A 和 SSC-A 通道的电压，使最小的细胞位于散点图左下角的 10% 区域内。通过坐骨神经或背根神经节（DRG）的未染色对照样本确定背景荧光和最低样本荧光。根据仅使用 DAPI 染色的对照样本的散点图确定父代（P1）门控。 
	注意：由于外周神经系统（PNS）中 DAPI+ 群体具有异质性，此门控不用于分选。</li>
	<li>利用每种目标荧光染料的 FSC 散点图，调整电压，使未染色对照样本的细胞位于各自散点图的下四分之一区域内。然后在该区域上方建立门控，以定义各相应标记物/荧光染料阳性的细胞。通过运行单染对照样本（步骤 4.1）确认门控位置。 
	注意：可在当前步骤进行补偿以校正发射光谱重叠，也可在后续使用适当的分析软件进行回溯性补偿。</li>
	<li>按照上述设置完成流式细胞仪配置后，即可开始运行样本。</li>
	<li>运行结束后，剩余样本材料可予以丢弃，并导出 FCS 文件以供进一步分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明本研究无利益冲突。

坐骨神经含有大量脂质（如胆固醇），这是由于轴突周围存在髓鞘。由于脂质的性质会随温度变化，在不同温度下操作可能导致不同的结果。为了确保细胞的完整性，本实验方案中自消化步骤之后的所有操作均在冰上进行。尽管为了结果的可重复性建议保持操作条件的一致性，但将步骤 3.6 和 3.7 在室温下进行可能有助于提高细胞得率。在步骤 3.8 中，如果神经组织未充分消化，则在滤网上可见细小的神经组织碎片。若消化不充分，可将滤网上残留的组织转移至新的 1.5 mL 离心管中，加入 250 µL 消化液，重复步骤 3.2–3.6 进行再次消化。如果细胞得率较低，应在滤网过滤后（步骤 3.6）取细胞悬液样本，加入台盼蓝染液，于光学显微镜下观察。应可见未被染色的活细胞以及杆状结构（即轴突碎片）。若未见活细胞，说明消化条件不当或样品处理过程中操作失误导致了细胞坏死。若仅观察到大量细胞团块，则建议通过离心收集样品，并重复消化步骤（步骤 3.2–3.6）。
小鼠坐骨神经和背根神经节（DRG）的流式细胞仪分析方法适用于涉及整段神经及多个DRG的研究问题。近年来，利用流式细胞术分析周围神经系统（PNS）的兴趣日益增加<...

通过表达 CD45 和 CD11b 鉴定的、从循环系统进入周围神经系统（PNS）的免疫细胞，有助于维持神经的完整性，并在神经再生与变性过程中发挥重要作用1。巨噬细胞（在小鼠中通过表达 CD68 鉴定）可极化为促炎表型，其表面表达较高水平的主要组织相容性复合体 II 类分子（MHC class II）和 CD86（M1），或极化为抗炎表型，表达较高水平的细胞内 CD206（M2）2。巨噬细胞表型的极化是一个由 Akt 信号通路调控的动态过程3，反映了巨噬细胞在抵御病原体（M1）和组织再生（M2）中承担的不同功能。受损神经的再生首先需要巨噬细胞在神经内吞噬髓鞘碎片4,5，而抗炎型（CD68+CD206+）M2 巨噬细胞已被证明可促进周围神经系统中的轴突生长6。巨噬细胞向 PNS 的募集减少，或其吞噬能力受损，可能导致神经再生受阻及神经完整性维持障碍。表达 MHC class II 的促炎型 M1 巨噬细胞的吞噬能力弱于 M2 巨噬细胞，且神经炎症已被认为参与多种神经退行性疾病的发病机制7。
损伤后，神经驻留免疫系统可能发生定量或定性的变化。定量变化表现为CD45+白细胞的减少（或在发生炎症时表现为CD45+白细胞浸润增加），而定性变化则如巨噬细胞表型由M2向M1表型转变。传统上，周围神经系统（PNS）的免疫细胞通过免疫荧光（IF）技术，利用冰冻切片或石蜡包埋组织进行分析8。免疫荧光技术对于确定目标细胞的定位是必需的。然而，基于免疫荧光的定量分析通常依赖于在组织的狭小切片区域内计数相对较少的细胞，导致定量结果不可靠且易受选择偏倚影响。为了鉴定特定免疫细胞亚群，需要同时检测细胞外和/或细胞内标志物；而确定巨噬细胞表型则至少需要两个标志物，即CD206和MHC II类分子。由于大多数常用的显微镜最多仅具备两个荧光通道（如异硫氰酸荧光素（FITC）和藻红蛋白（PE）），因此通过免疫荧光对免疫细胞亚群进行表征可能受到限制且不完整，往往需要制备来自同一感兴趣区域的多个切片，并行染色和分析。这一耗时的过程因而并不适用于大规模样本集的分析。此外，由于大多数目标标志物位于细胞表面，当组织经过石蜡包埋或冷冻保存处理后，细胞膜完整性可能遭到破坏，表位可能被遮蔽，同时在使用丙酮、甲醇等溶剂的过程中可能导致目标抗原丢失，从而给检测带来困难9。
相比之下，流式细胞术通过测量悬浮单个细胞在通过光束时的光学和荧光特性，为细胞群体的分析提供了更为实用且全面的方法。流式细胞术并不生成组织的数字图像，而是对一组参数进行自动化定量分析，这些参数包括细胞的相对大小和折射率（称为前向散射，FSC）、颗粒度/内部复杂性（即侧向散射，SSC），以及相对荧光强度（前提是细胞已用适当的荧光染料标记，例如偶联抗体）。典型的流式细胞仪包含两束空气冷却激光：氩离子激光器发射波长为488 nm的蓝光，氦氖激光器发射波长为633 nm的光。这种组合可同时检测和测量至少五个位于细胞表面或细胞内区室的靶标。更先进的流式细胞仪可配备多束激光，能够在所选荧光染料的发射峰波长无明显重叠的前提下，同时检测多达八种不同的荧光染料。
为了进行流式细胞术分析，首先必须通过酶消化（通常使用胶原酶）将目标组织处理成单细胞悬液。由于从小鼠获取的坐骨神经组织量较少，此前对小鼠坐骨神经的分析一直较为困难。此外，轴突周围髓鞘的高脂肪含量会阻碍细胞回收，并产生大量碎片。本文所述的坐骨神经制备与消化方法改编自 Barrette et al.7 的施万细胞分离方案，旨在从单只小鼠的神经中分离出足够数量的细胞用于流式细胞术分析，从而减少个体小鼠之间的差异。在原始组织消化物中使用 DAPI 鉴定单细胞，可避免去除轴突碎片的步骤——该步骤通常会导致细胞丢失。使用富含去污剂的缓冲液多次洗涤，有助于释放被困在脂肪碎片中的细胞，从而提高得率。按照本方案消化单只小鼠的两条完整坐骨神经，可获得 ≥30,000 个单核事件，而从背根神经节（DRG）中回收的细胞数量至少为此数量的 3 倍。坐骨神经消化物中 CD45+ 白细胞约占总细胞含量的 5%，在 DRG 消化物中则约为 5–10%。坐骨神经中大多数 CD45+ 细胞表达巨噬细胞标志物 CD68 和 CD206。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>查尔斯河</td><td>C57BL/6NCrl</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（含1g/L葡萄糖、谷氨酰胺、丙酮酸）</td><td>赛默飞</td><td>31885023</td><td>该材料的来源不重要</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原酶</td><td>沃辛顿生化公司，美国</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶（DNase）I，来源于牛胰腺 I</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>DN25-1g</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS），热灭活</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>抗CD11b-PerCP/Cy5.5抗体</td><td>生物传奇</td><td>101228</td><td>克隆号 M1/70</td></tr><tr><td>抗MHC II类分子生物素标记抗体</td><td>生物传奇</td><td>107603</td><td>克隆号 M5/114.15.2</td></tr><tr><td>抗CD45-A647抗体</td><td>生物传奇</td><td>107603</td><td>克隆号 30-F11</td></tr><tr><td>抗CD68-APC抗体</td><td>生物传奇</td><td>137007</td><td>克隆号 FA/11</td></tr><tr><td>抗CD206-PE抗体</td><td>生物传奇</td><td>141706</td><td>克隆号 C068C2</td></tr><tr><td>抗F4/80-PE/Cy7抗体</td><td>生物传奇</td><td>123113</td><td>克隆号 BM8</td></tr><tr><td>链霉亲和素-PE/Cy7</td><td>生物传奇</td><td>405206</td><td>用于与CD45-A647和CD11b-PerCP/Cy5.5联合检测MHCII-生物素</td></tr><tr><td>链霉亲和素-PerCP</td><td>生物传奇</td><td>405213</td><td>用于与CD68-APC和F4/80-PE/Cy7联合检测MHCII-生物素</td></tr><tr><td>吐温-100</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>D9542-1MG</td><td>用PBS稀释至50倍，避光保存于4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>细胞分离筛—组织研磨试剂盒</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>CD1</td><td></td></tr><tr><td>V型96孔板</td><td>格瑞纳/西格玛</td><td>M8185</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 聚苯乙烯圆底管，12×75 mm</td><td>BD 生物科学</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>60×15 mm 培养皿</td><td>格瑞纳/西格玛</td><td>Z643084</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II 流式细胞仪</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用流式细胞术分析单只小鼠单侧坐骨神经和背根神经节中的免疫细胞

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

周围神经系统（PNS）中定居的免疫细胞对于维持健康神经内的神经元完整性至关重要。PNS的免疫细胞会受到损伤和疾病的影响，从而影响神经功能及再生能力。神经元相关的免疫细胞通常通过免疫荧光（IF）进行分析。尽管IF在确定免疫细胞在神经中的定位方面至关重要，但该方法仅为半定量，且受限于可同时分析的标记物数量以及表面表达水平。本研究采用流式细胞术对单只小鼠坐骨神经或背根神经节（DRG）中的白细胞浸润进行定量分析。通过DAPI进行单细胞分析，并同时检测多种蛋白的表面或胞内表达。按照本方案处理同一只小鼠的双侧坐骨神经，均可获得≥30,000个单核细胞事件。通过CD45表达确定的坐骨神经中白细胞比例约占坐骨神经总细胞含量的5%，在DRG中约为5–10%。尽管本方案主要聚焦于PNS内的免疫细胞群体，但由于流式细胞术具备可同时检测多种标记物的灵活性，因此也可用于分析神经中其他细胞群体，如施万细胞、周细胞、成纤维细胞和内皮细胞。因此，该方法为研究全身性因素对PNS的影响提供了新途径，例如神经毒理学、神经病变的遗传模型或糖尿病等慢性疾病中的相关研究。

根据实验方案，从六只健康的 C57BL/6 小鼠的完整坐骨神经和所有主要背根神经节（DRG）制备细胞悬液，并将每份样品均分为三等份用于染色。使用可染色 DNA 的 DAPI 进行复染，可识别出单细胞群体（图 1A-B，上图）。在进行流式细胞术分析前洗去 DAPI，可在一定程度上降低无核碎片的荧光强度，从而有助于在单核事件或单细胞（singlets）的 FSC 轴上选择出明确的细胞群。由于周围神经系统（PNS）来源的单细胞在 FSC 和 SSC 轴上分布范围较广，因此不设置收集门控（图 1C）。在 FSC 轴高端的物质包含未完全消化的组织，在选择单细胞群体时必须将其排除（图 1A-B）。使用密度图（下图）展示结果有助于排除大块碎片（下图）。通常可从两条完整的坐骨神...

由于小鼠坐骨神经组织稀少，对其进行细胞成分的定量分析较为困难。本方案描述了一种组织消化与制备方法，可获得足够数量的细胞，用于对单只小鼠神经中的免疫细胞群体进行流式细胞术分析。

周围神经系统（PNS）中定居于神经的免疫细胞对于维持健康神经中神经元的完整性至关重要。这些免疫细胞……

本实验的总体目标是从单只小鼠的背根神经节和坐骨神经中获取足够数量的细胞，以便能够进行细胞流式分析。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为外周神经组织在消化过程中会产生大量碎片。该方法的主要优势在于可同时使用多种标记物来鉴定多种细胞类型。该技术的应用前景涉及神经病变过程中炎症与免疫病理的诊断。尽管该方法可为小鼠模型提供研究依据，但经过微小修改后，也可应用于其他生物体，如人和猪的神经组织。通常，初次接触该方法的研究人员会因消化过程中产生的大量碎片而遇到困难。该方法的可视化演示至关重要，因为每只小鼠提供的神经组织量有限，使得解剖和细胞分离步骤难以操作。我们最初产生该方法的想法，是源于看到了Steve Lacroix实验室发表的一项从坐骨神经中分离雪旺细胞的实验方案。首先，按照配套文字版实验方案所述准备小鼠，并将其腹侧朝下放置，同时伸展其下肢。接下来，使用镊子双侧分离完整的坐骨神经。首先从大腿背侧上方分离肌肉组织，并沿脊柱方向追踪神经走向。在神经从脊柱发出的位置以及另一端膝关节上方的位置立即切断神经。然后将切除的神经转移至含有1毫升冰上预冷的PBS的1.5毫升离心管中，将神经置于冰上保存。接下来，分离背根神经节。首先沿脊柱两侧平行且紧邻脊柱的方向切开肋骨。然后，在后侧于股骨水平位置横向切断脊柱，在前侧靠近颅骨处横向切断脊柱。移除脊柱，并使用虹膜剪从脊柱上剪除所有肌肉、脂肪及其他软组织。接下来，将脊柱腹侧朝上放置，从尾端开始剪开。将剪刀的一侧刀尖从12点钟位置插入椎管，剪断骨骼。沿脊柱继续操作，直至完全切开；随后在6点钟位置重复此步骤，将脊柱完全分为两半。分离脊柱的两半后，将样本置于解剖显微镜下。取出脊髓以暴露脊神经，然后通过轻拉背根将其拉入椎管，找到并摘除腰段背根神经节。接着，使用虹膜剪剪断背根神经节周围的神经和结缔组织。用镊子将背根神经节转移至一个1.5毫升离心管中，并置于冰上保存。定位背根神经节，将其完整无损地分离并去除脊神经，需要练习和技巧。准备消化液，加入终浓度为每毫升100微克的脱氧核糖核酸酶，并置于冰上保存。然后，向每支含有坐骨神经和背根神经节的试管中加入500微升消化液。对于坐骨神经，使用弹簧剪将组织剪切15至20次，然后将组织悬液置于37摄氏度的摇床培养箱中，轻柔振荡孵育20分钟。孵育结束后，用1,000微升移液枪头反复吹打细胞悬液，以机械方式解离任何未完全消化的组织。重复使用1,000微升移液枪头进行吹打操作。然后在37摄氏度下轻轻振荡，将样品额外孵育10分钟。配制冰冻的FACS缓冲液，并用其冲洗并浸泡置于冰上60毫米培养皿中、孔径为140微米的不锈钢滤网。接着，用钝头镊子夹住140微米的筛网滤器，使其覆盖在培养皿上方，反复将组织悬液通过滤器过滤。从培养皿中收集细胞悬液，并转移至同一置于冰上的1.5毫升离心管中。使用1,000微升移液器枪头反复吹打，将滤膜上残留的未完全消化的组织推过滤膜。随后，用500微升FACS缓冲液冲洗滤膜两次，并将冲洗液合并至1.5毫升离心管中的细胞悬液中。如果样本消化不充分的部分过多并穿过滤网，可能导致细胞丢失，从而无法进行流式细胞术分析。将细胞悬液离心并弃去上清液，然后用一毫升 FACS 缓冲液重悬细胞沉淀。重复此洗涤步骤一次，将最终的细胞沉淀重悬于 150 至 350 微升的 FACS 缓冲液中。细胞现在已准备好进行染色。在计算机上，选择用于检测目标荧光染料的适当通道、样品的合适流速，以及每份样品需采集的总事件数。最低事件数应为一百万。接下来，在全局工作表中创建侧向散射A对前向散射A的散点图，以及每种目标荧光染料对前向散射A的散点图。同时创建一个统计视图，以显示所选荧光染料的事件数量和平均荧光强度。根据仅用DAPI染色的对照样本的散点图确定父门P1。将样本连接至流式细胞仪并点击采集。观察DAPI与FSC的散点图，逐步降低DNA Pacific Blue通道的电压，直至DAPI+细胞群可见。使用矩形圈门工具，在DAPI+细胞群周围绘制一个矩形门。这代表 P1 门。选择每种荧光染料的散点图，并仅显示 DAPI+ 事件。这代表每种荧光染料的背景荧光。使用矩形门控工具，在每种荧光染料的散点图中绘制一个方框，从 y 轴的 103 处开始。该门控区域表示所述各标记物阳性事件应出现的范围。利用仅用 DAPI 染色的对照样本，调整每种荧光染料的电压。将样本连接至流式细胞仪并点击采集。观察每种荧光染料对应的 DAPI+ 群体的位置，并调整相应的电压，使这些群体位于矩形门控区域之外。流式细胞仪设置完成后，运行样本并导出前向散射文件以供进一步分析。在流式细胞术分析前洗去DAPI染色剂可降低无核碎片的荧光强度。这使得位于前向散射轴高端、含有未完全消化组织的物质能够在单细胞群体的选中过程中被排除。总体而言，两条完整的坐骨神经通常可获得超过30,000个单细胞，而背根神经节可获得超过200,000个单细胞。从坐骨神经中，约有5%的单细胞在其表面表达CD45，而在背根神经节中，约有5%至10%的细胞表达CD45，据此可将这些细胞定义为起源于造血系统的白细胞。大部分CD45阳性的单细胞也以渐进的方式表达MHC II类分子。在背根神经节中，CD11b可用于检测类似小胶质细胞的细胞，然而这类小胶质细胞群体在坐骨神经中并不存在。在坐骨神经和背根神经节中，2%至5%的单个细胞表达CD68。在坐骨神经中，大约60%至80%的CD68阳性巨噬细胞表达CD206，而在背根神经节中，CD68阳性细胞共表达CD206的比例较小。在执行该操作过程中，保持恒定的温度至关重要，以确保结果的一致性。该技术建立后，使得糖尿病领域的研究人员能够探索用于诱导小鼠糖尿病的链脲佐菌素的毒性作用。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对外周神经组织进行流式细胞术分析。请勿忘记，使用多聚甲醛可能存在危险，因此应始终采取预防措施，例如佩戴手套和安全护目镜。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

应用流式细胞仪分析单侧坐骨神经和背根神经节的免疫细胞

本文介绍了一种快速分离脑和脊髓组织中单个核细胞的高效方案，所获细胞可有效用于流式细胞术分析。...

使用Percoll梯度分离脑和脊髓单个核细胞

该视频展示了从小鼠脑组织制备免疫细胞单细胞悬液的过程。首先通过酶消化法将细胞从脑组织中释放出来，随后利用密度梯度离心法根据细胞密度分离免疫细胞，从而获得单细胞悬液。...

制备小鼠脑组织中免疫细胞的单细胞悬液

来源： Hidmark, A. S., 等. 利用流式细胞术分析单只小鼠单侧坐骨神经和背根神经节中的免疫细胞. J. Vis. Exp. (2017).

利用流式细胞术分析小鼠神经系统组织中的免疫细胞

炎症在缺血性脑卒中的发病机制中起着核心作用。越来越多的证据表明，炎症具有双重作用：一方面会加剧早期脑损伤，另一方面也参与后期的修复过程。本方案描述了从缺血脑组织中分离免疫细胞，并对其进行后续流式细胞术表型分析的方法。...

从小鼠缺血脑组织中分离免疫细胞及其流式细胞术分析

本方案通过流式细胞术分析成年小鼠中枢神经系统中的巨噬细胞亚群，有助于研究这些细胞表达的多种标志物。...

通过流式细胞术分析中枢神经系统中的小胶质细胞和单核细胞来源的巨噬细胞

本文介绍了一种从小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏制备单细胞悬液的实验方案，以便进一步通过流式细胞术对这些细胞进行研究。此外，该方案还可用于通过流式细胞术鉴定调节性T细胞的不同亚群。...

利用流式细胞术检测小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏中调节性T细胞亚群

本文介绍了一种详细且可重复的流式细胞术方案，利用已建立的小鼠骨关节炎手术模型，通过胞外和胞内染色实验，鉴定小鼠脾脏、骨髓、淋巴结及滑膜组织中的单核细胞/巨噬细胞和T细胞亚群。...

骨关节炎模型中经由流式细胞术分析小鼠脾脏、骨髓、淋巴结及滑膜组织内的免疫细胞亚群

本文提供了一种在小鼠中诱导主动实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验方案。同时介绍了一种分离和表征中枢神经系统（CNS）中浸润性淋巴细胞的方法，以展示淋巴细胞在CNS自身免疫性疾病发生过程中的作用。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎期间中枢神经系统淋巴细胞浸润的流式细胞术分析

为了研究脑部疾病中的免疫反应，一种常用的方法是分析免疫细胞的变化。本文提供了两种简单且有效的方案，用于从小鼠脑组织和颅骨骨髓中分离免疫细胞。...

从小鼠脑和颅骨中分离免疫细胞

在受损脊髓中区分小胶质细胞（MG）和外周浸润的巨噬细胞（Mø）具有挑战性。本方案中，采用流式细胞术（FCM）分别鉴定M1样MG、M2样MG、M1样Mø和M2样Mø。该技术也可应用于其他中枢神经系统疾病，以阐明MG和Mø的作用。...

利用流式细胞术鉴定损伤脊髓中的小胶质细胞和外周浸润巨噬细胞

本方案结合流式细胞术和单细胞RNA测序技术，用于分离和表征出生后早期小鼠脑小脑中的小胶质细胞状态。该方法通过酶解消化、Percoll离心及免疫染色，揭示小胶质细胞的异质性，从而加深对其在小脑发育与疾病中作用的理解。...

流式细胞术与单细胞分析用于表征小鼠出生后早期脑发育过程中小胶质细胞的活化

了解如何使用流式细胞仪分析小鼠坐骨神经和背根神经节中的免疫细胞。该方法可同时检测多种标志物以识别不同细胞类型，有助于研究神经炎症和免疫病理学。

利用流式细胞术分析单只小鼠单侧坐骨神经和背根神经节中的免疫细胞

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