体外酶法检测药物陪护与庞贝氏症的反应

有一个要求, 使临床前测试的一个新的类 "孤儿" 药物称为药理伴侣可再生, 快速, 高效。我们开发了一个简单, 高度标准化, 多功能细胞文化检测, 以筛选合格的病人以及新的药理陪护药物。

这种修订后的细胞培养方案的总体目标是提供法布里病和庞贝病等位基因变异的快速表型评估。这种方法可以帮助回答溶酶体贮积病领域的关键问题，例如预后结果和治疗决策。该技术的主要优点是它具有高度可重复性，并且可以帮助开发新型药物，例如药物伴侣。

为了进行定点诱变，首先使用参考序列 NM 00169.2 和 NM 00152.4 分别作为 GLA 和 GAA 基因诱变的模板。使用免费的 Primer Design 工具支持引物设计。然后，由商业提供商合成一组高纯度、无盐引物，其中正义和反义引物携带各自的序列修饰之一，位于其长度的中心，以单独引入突变。

制备 50 μL 体积的反应混合物，并使用制造商提供的标准条件运行 PCR 程序，如文本方案所示。PCR 后，加入 1 μL Dpn1 限制性内切酶，并继续在 37 摄氏度下孵育反应瓶 1 小时。将血浆 DNA 转化为感受态大肠杆菌细胞并根据文本方案制备所需转化的质粒后，使用合适的分子生物学工具分析序列。

当检测到所需的突变并且与 α-半乳糖苷酶 A 的 NM 000169.2 或酸性 α-半乳糖苷酶的 NM 000152.4 相比没有进一步的序列异常时，选择克隆进行转染级质粒纯化。通过在分光光度计中测量吸光度来确定 DNA 的纯度。根据文本方案在 T75 培养瓶中培养 HEK293H 细胞后，在转染前 24 小时，使用不含钙或镁的 PBS 洗涤细胞一次。

用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 收获细胞，并在 24 孔培养板的空腔中使用 500 微升补充有 10%FBS 的 DMEM，以 1.5 倍 10 接种到五个细胞中。根据制造商的手册进行细胞转染。使用溶解在 100 μL 无血清 DMEM 和 2.5 μL 转染试剂中的 1 μg 质粒 DNA 的混合物。

在室温下孵育溶液 20 分钟，然后以逐滴方式将其添加到细胞中。在 37 摄氏度和 5% CO2 下放置 4 小时后，去除含有转染试剂的培养基，并加入 500 微升含 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的新鲜 DMEM。作为此步骤中的一个选项，在需要的地方将 DGJ 或 DNJ 添加到培养基中。

在收获当天，从培养箱中取出细胞。然后吸出培养基，并使用含钙和镁的 PBS 小心洗涤细胞两次。这一步很关键，因为 DGJ 和 DNJ 是两种酶的抑制剂，因此任何剩余的都会使测试无效。

洗涤后，直接在细胞顶部加入 200 微升去离子水。然后从板中冲洗细胞并将其转移到 1.5 mL 反应管中。将样品放在合适的泡沫架上，涡旋 5 秒钟，以提高裂解效率。

然后在液氮和室温水浴之间交替放置样品 10 秒，直到完全解冻。重复均质程序 5 次后，将样品以 10， 000 g 离心 5 分钟。然后将上清液转移到新的反应管中。

要进行 BCA 检测，请为每个样品准备一根新管，其中包含 40 微升去离子 H20，并添加 10 微升样品。通过短暂涡旋混合每种溶液，并将每个样品的 10 微升一式三份转移到 96 孔板的空腔中。要制备标准曲线，请根据文本方案稀释 2 毫克/毫升 BSA 储备溶液和去离子 H 2 O。

混合试剂 A 和试剂 B 后，加入 200 μL BCA 试剂溶液开始反应，并将样品在 37 摄氏度和 300 rpm 的避光下在轨道摇床上孵育 1 小时。然后在读板器中测量 560 纳米处的吸光度。样品通常每微升含有 1 至 1.5 微克蛋白质。

稀释每个样品的计算量，并将其移液到新鲜的 1.5 毫升反应管中，以获得每微升溶液 0.05 μg α-半乳糖苷酶 A 或 0.5 μg 酸性 α-葡萄糖苷酶。再次涡旋样品 5 秒钟，然后将 10 μL 稀释液一式两份移液到 96 孔板中。通过添加 20 μL 的相应底物溶液开始反应。

对于 α-半乳糖苷酶 A，在 0.06 摩尔磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液（pH 4.7）中加入两毫摩尔 4-甲基伞形基 α-D 吡喃半乳糖苷或 4-MU-gal。对于酸性 α-葡萄糖苷酶，在 0.025 摩尔乙酸钠 （pH 4.0） 中加入 2 毫摩尔 4-甲基伞形基 α-D 吡喃葡萄糖苷或 4-MU-glu。将酶反应物在 37 摄氏度和 300 rpm 的黑暗中在轨道振荡器上孵育 1 小时。

然后加入 200 μL 1.0 mol pH 10.5 调节甘氨酸氢氧化钠缓冲液终止反应。根据文本方案，从 0.01 毫克/毫升原液中制备 4-MU 的标准曲线，并将 10 微升溶液一式两份移液到 96 孔板中。向每个孔中加入 200 μL 1.0 摩尔甘氨酸氢氧化钠缓冲液，以调节体积和 pH 值。

最后，在配备适当滤光片组的荧光读数仪中测量酶活性。并使用适用于荧光阅读器设备的软件分析数据。为了评估 GLA 基因诱变的效率，将突变分为三类，并显示第一次尝试获得约 66.5%。

在略微修改的第二次 PCR 后可再获得 25%。在第 3 类中，必须进行更多的工作，例如重新设计引物，才能产生所需的克隆。下表引用了 3 种 α-半乳糖苷酶 A 和 3 种酸性 α-葡萄糖苷酶突变的酶活性测量结果，这些突变要么未处理，要么经过 DGJ 和 DNJ 处理。

数据显示为底物周转率的绝对值，并且具有归一化为野生型酶的相对值。使用转染空 pcDNA 3.1 载体的细胞，根据 HEK293H 细胞的内源性酶活性校正绝对酶活性数据。将酶活性值标准化为来自相应实验的野生型酶，这解释了不同突变体之间相对值的偏差。

一旦掌握，该实验的细胞培养后部分（占大部分手动作时间）可以在 4 小时内完成。开发后，这项技术为溶酶体贮积病领域的研究人员探索法布里病和庞贝病的基因型-表型相关性铺平了道路。该方案有助于溶酶体贮积病中新药的开发。