Name: 脊髓 Cocultures 丘脑-皮质轴突分支和突触形成的可视化研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: 学习利用器官型共培养技术同时观察丘脑-皮质轴突分支与突触形成的动态形态变化。该方法采用大鼠脑切片与电穿孔标记，为神经回路发育研究提供活体成像手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本研究由文部科学省创新领域基金（Mesoscopic Neurocircuitry 23115102）和“清除与构建系统对脑功能的动态调控”基金（16H06460）资助，项目负责人为N.Y.&#160;我们还感谢Gabriel Hand对本文的审阅。

所有实验均按照大阪大学动物福利委员会和日本神经科学学会制定的指南进行。
1. 丘脑与大脑皮层的器官型共培养
注意：详细步骤请参考原始文献7,8,13。所有操作均应在无菌条件下进行。神经元培养使用Sprague-Dawley（SD）大鼠。
<ol>
	<li>试剂的配制 
	注意：以下试剂的体积适用于一只大鼠脑组织。
	<ol>
		<li>配制10倍改良N2添加剂13：胰岛素（50 μg/mL）、孕酮（200 nM）、氢化可的松（200 nM）、亚硒酸钠（300 nM）、转铁蛋白（1 mg/mL）、腐胺（1 mM）、葡萄糖（60 mg/mL）</li>
		<li>配制含血清培养基（10 mL）：85% DMEM/F12，10% 10倍改良N2添加剂，5% 胎牛血清（FBS）</li>
		<li>配制无血清培养基（20 mL）：90% DMEM/F12，10% 10倍改良N2添加剂</li>
		<li>配制大鼠尾胶原溶液（0.5 mL）。简而言之，在无菌条件下取大鼠尾部柔软纤维，于乙酸溶液中过夜孵育。离心后收集上清液（浓度为几mg/mL），并置于冰箱中保存13。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养皿的准备
	<ol>
		<li>将膜插件放入一个35 mm的培养皿中。</li>
		<li>向膜上加入40–50 μL大鼠尾胶原溶液，并将溶液均匀涂抹至膜中心区域。</li>
		<li>在洁净台中将膜彻底风干。</li>
		<li>向培养皿中加入1.5–2 mL含血清培养基，使膜完全浸没于培养基中。</li>
		<li>在接种前，将培养皿置于培养箱中（37 °C，95% 湿润空气，5% CO2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>皮层切片的制备
	<ol>
		<li>使用70%乙醇对所有手术器械灭菌10分钟或更长时间。</li>
		<li>对出生后第2天（P2）的大鼠实施冰浴麻醉（将其浸入冰屑中数分钟），迅速取出全脑。</li>
		<li>将脑组织放入盛有100 mL冷Hanks平衡盐溶液的100 mm培养皿中。</li>
		<li>用精细镊子去除脑表面的软脑膜，并使用显微手术剪从视觉皮层和体感皮层切取厚度为300–400 μm的皮层切片（详细操作见图1）。 
		注意：皮层切片的厚度可通过双目显微镜下网格刻度进行粗略估计。 
		注意：也可在无菌条件下使用振动切片机（vibratome）制备皮层切片。</li>
		<li>使用一次性塑料移液管将数个皮层切片转移至膜插件上。</li>
		<li>用火焰抛光的巴斯德移液管调整切片位置，使其靠近培养插件中心（详细操作见8,13），并去除插件中多余的培养基。 
		注意：应将培养基液面调节至略低于切片表面，以确保切片同时获得充足的气体和营养供应。这对细胞存活至关重要。</li>
		<li>将切片置于含血清培养基中，在37 °C、95% 湿润空气和5% CO2的环境中培养一天，随后取丘脑组织块并放置于其旁侧进行共培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>丘脑组织块的制备
	<ol>
		<li>使用70%乙醇对所有手术器械灭菌10分钟或更长时间。</li>
		<li>对一只妊娠15天的大鼠通过腹腔注射戊巴比妥麻醉剂（50 mg/kg）进行麻醉。</li>
		<li>从子宫角中分离出每个胚胎，并将其放入盛有100 mL冷Hanks平衡盐溶液的100 mm培养皿中。</li>
		<li>在双目显微镜下取出每个胚胎的脑组织，并使用显微手术剪切取主要包含腹后复合体和外侧膝状体核的丘脑组织块（约0.5 mm × 3）7（见图1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>器官型共培养体系的培养与维持
	<ol>
		<li>使用巴斯德移液管将丘脑组织块放置于已置于膜过滤插件上的皮层切片的室管膜表面旁侧。</li>
		<li>将共培养体系置于含血清培养基中，在37 °C、95% 湿润空气和5% CO2的环境中维持培养。</li>
		<li>培养两天后，更换一半培养基为无血清培养基。此后每2–3天更换一次培养基。 
		注意：换液后应检查培养基液面高度，因其对细胞存活至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 电穿孔
所有操作均应在无菌条件下进行。
注意：在制备丘脑组织块后一天进行电穿孔，以防止组织块脱落。
<ol>
	<li>质粒
	<ol>
		<li>按如下方法配制质粒混合液：pCAGGS-DsRed 2 μg/μL；pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL。 
		注意：使用无内毒素大提试剂盒纯化上述两种质粒，并溶于Hanks平衡盐溶液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电穿孔设备设置 
	刺激器和隔离器等电学仪器的连接方式如图2所示。
	<ol>
		<li>将刺激器连接至双相隔离器。</li>
		<li>将电极（直径0.2 mm的银丝）连接至隔离器的负极端。</li>
		<li>将另一电极（直径1 mm的银丝）与一个100 Ω电阻串联后，连接至隔离器的正极端。</li>
		<li>将放大器连接至示波器，通过放大器测量电阻两端电压，以监测是否有电流通过电阻。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>玻璃移液管的制备 
	注意：使用两种类型的玻璃移液管，分别用于注射质粒溶液和施加电脉冲。
	<ol>
		<li>使用电极拉制仪从玻璃毛细管拉制移液管。</li>
		<li>折断注射用移液管的尖端（尖端直径应为20 - 50 μm）。</li>
		<li>先用砂纸研磨并抛光电极移液管的尖端，再进行火焰抛光（内径应为50 - 200 μm）。 
		注意：电极尖端应平整光滑，因其将直接接触组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电穿孔操作步骤
	<ol>
		<li>将注射移液管和电极移液管连接至显微操作器。</li>
		<li>将一根直径0.2 mm的银丝插入电极移液管中。</li>
		<li>用塑料管将注射移液管连接至1 mL注射器。</li>
		<li>通过注射器抽吸，将&#62;5 μL质粒溶液吸入注射移液管中。</li>
		<li>将共培养样品置于电穿孔台上，并将直径1 mm的电极插入培养液中。</li>
		<li>将注射移液管置于丘脑外植体上方。</li>
		<li>当移液管尖端接触丘脑组织表面后，手动推动注射器。 
		注意：通常每个丘脑组织块使用约0.5 μL质粒溶液。</li>
		<li>在撤出注射移液管后，立即放置电极移液管于丘脑组织块上。</li>
		<li>施加电脉冲（50 - 400 μA，3至5组，每组200个持续时间为1 ms的方波脉冲，频率200 Hz）。在示波器上监测电流幅值和脉冲组数。 
		注意：电流幅值取决于电极移液管的内径13。</li>
		<li>撤出电极移液管，并将培养皿放回培养箱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显微观察
	<ol>
		<li>将培养皿置于配备两种滤光片组的直立共聚焦显微镜载物台上，分别用于EGFP（激发波长488 nm，发射波长515 nm）和DsRed（激发波长514 nm，发射波长565 nm）的成像。</li>
		<li>使用20X&#160;长工作距离物镜，以1 - 7 µm的步长采集10 - 25个光学切片图像。选择可单独分辨的、同时表达DsRed和SYP-EGFP的标记轴突。 
		注意：观察区域约为0.7 x 0.7 mm（对应1024 x 1024像素，即0.68 μm/像素）。</li>
		<li>每日成像时每隔24小时采集一次图像，整个过程在室温下10分钟内完成，随后将培养物放回培养箱。对于短时间间隔的时间序列成像，需将培养物置于培养室中，维持37 °C、95%空气和5% CO2的湿润环境。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kageyama, G. H., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+geniculocortical+projections+to+visual+cortex+in+rat%3A+evidence+early+ingrowth+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis.</a> J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).</li>
<li>Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamocortical+development%3A+how+are+we+going+to+get+there%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Thalamocortical development: how are we going to get there.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).</li>
<li>Espinosa, J. S., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of the primary visual cortex.</a> Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS Biol. 3 (8), 272(2005).</li>
<li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).</li>
<li>Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine dynamics.</a> Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).</li>
<li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li>
<li>Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+specificity+of+extrinsic+cortical+connections+studied+in+coculture+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations.</a> Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).</li>
<li>Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+dependence+of+cortical+axon+branch+formation%3A+a+morphological+and+electrophysiological+study+using+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures.</a> J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).</li>
<li>Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+laminar+specificity+and+activity-dependent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching.</a> J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).</li>
<li>Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+method+for+axon+tracing+in+cultured+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices.</a> Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).</li>
<li>Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-dependent+and+independent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching+are+regulated+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity.</a> Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).</li>
<li>Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/282233732_Electroporation_Method_for_Mammalian_CNS_Neurons_in_Organotypic_Slice_Cultures">Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures.</a> Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).</li>
<li>Molnar, Z., Blakemore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+regional+specificity+for+connections+formed+between+thalamus+and+cortex+in+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture.</a> Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+afferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus.</a> J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+mechanism+by+polysialic+acid+for+lamina-specific+branch+formation+of+thalamocortical+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons.</a> J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+factors+regulating+lamina-specific+growth+of+thalamocortical+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons.</a> J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).</li>
<li>Ohnami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+RhoA+in+activity-dependent+cortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching.</a> J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).</li>
<li>Yamada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pre-+and+postsynaptic+activity+in+thalamocortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

目前的方案也是研究除丘脑皮层投射以外的生长轴突发育特征的有力工具11。例如，皮层脑片培养与电穿孔技术相结合，可实现对皮层神经元单个轴突形态的可视化以及长期观察9,18。
通过使用本实验方案，还可通过共表达荧光蛋白和目的基因，分析特定基因在轴突分支和突触形成中的作用。通常情况下，当质粒溶液的摩尔比调整为1:2时，超过90%表达荧光蛋白的细胞会同时转染第二个质粒18,19。然而，由于不同载体之间的共转染效率和表达水平存在差异，最佳摩尔比可能有所不同。
尽管当前方案对延时实验较为高效，但仍存在一些技术问题。在每日成像过程中，共培养样品需每天放置于显微镜载物台上。尽管每日成像似乎未对轴突发育造成明显影响10，...

哺乳动物大脑中的丘脑皮层（TC）投射是研究轴突导向和靶向机制的合适系统。在发育过程中，感觉性TC轴突在皮层板内生长，并优先在大脑皮层主要感觉区域的第四层形成分支和突触1,2。即使在基本连接建立之后，轴突树突和突触终末仍会根据环境变化发生重塑3,4。然而，TC轴突形态如何动态改变仍不清楚。其中一个主要原因是缺乏能够在单细胞水平上观察结构变化的适当技术。尽管显微镜技术的最新进展（如双光子显微镜）已实现对活体皮层神经元的直接观察in vivo，但在捕捉完整TC轴突走行路径方面仍存在技术局限性5,6。因此，用于TC轴突活体成像的in vitro方法将为轴突分支和突触形成的结构分析提供有力工具。
我们课题组首次建立了一种基于多孔膜的静态脑片培养方法7。利用该方法，将大鼠皮层脑片与感觉丘脑组织块进行共培养，成功在器官型共培养体系中重现了层特异性的丘脑皮层（TC）连接7,8。通过荧光蛋白进行稀疏标记，可进一步观察丘脑皮层轴突的生长及分支形成过程9,10,11。近期，我们开发出一种新方法，可在器官型共培养体系中对单个丘脑皮层轴突的分支与突触形成进行同步成像12。为了同时可视化丘脑皮层轴突和突触前结构，通过电穿孔法将DsRed与EGFP标记的突触素（SYP-EGFP）共转染至少量丘脑神经元中。该方法有助于对丘脑皮层轴突进行形态学分析，并支持长期观察，可用于揭示轴突分支与突触形成之间的因果关系。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Nissui</td><td>5905</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396-03</td><td>Hyclone</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>孕酮</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>亚硒酸钠</td><td>Wako Pure&lt;br/&gt; Chemical Industries</td><td>192-10843</td><td></td></tr><tr><td>转铁蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>腐胺&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Wako&lt;br/&gt; Pure Chemical Industries</td><td>16806-25</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Millicell-CM 插件</td><td>Millipore</td><td>PICMORG50</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>BIO-BIK</td><td>I-90-20</td><td>无菌培养皿</td></tr><tr><td>HiPure 质粒大提试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K210006</td><td></td></tr><tr><td>一次性无菌塑料移液管</td><td></td><td>202-IS</td><td>无菌转移移液管</td></tr><tr><td>玻璃毛细管：外径 1.2 mm</td><td>Narishige</td><td>&amp;nbsp;G-1.2</td><td>内径 1.2 mm</td></tr><tr><td>银丝：0.2 mm 和 1 mm&amp;nbsp;</td><td>Nilaco</td><td>AG-401265（直径 0.2 mm），AG-401485（直径 1.0 mm）</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>刺激器&amp;nbsp;</td><td>A.M.P.I</td><td>Master 8</td><td></td></tr><tr><td>双相隔离器&amp;nbsp;</td><td>BAK ELECTRONICS</td><td>BSI-2</td><td></td></tr><tr><td>放大器&amp;nbsp;</td><td>A-M Systems</td><td>Model 1800</td><td></td></tr><tr><td>示波器</td><td>Hitachi</td><td>VC-6723</td><td></td></tr><tr><td>操纵器</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Narishige</td><td>MO-10</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>SZ40</td><td></td></tr><tr><td>通用支架&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>SZ-STU2</td><td></td></tr><tr><td>照明系统&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>LG-PS2, LG-DI, HLL301</td><td></td></tr><tr><td>电极拉制仪&amp;nbsp;</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td>Digital eclipse C1 激光</td><td></td></tr><tr><td>20倍物镜</td><td>Nikon</td><td>ELWD 20x/0.45</td><td></td></tr><tr><td>培养腔室</td><td>Tokai Hit</td><td>UK A16-U</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley（SD）大鼠</td><td>Japan SLC 和 Nihon-Dobutsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微手术剪</td><td>Natsume&amp;nbsp;</td><td>MB-54-1</td><td></td></tr></tbody></table>

在器官型共培养物中观察丘脑皮层轴突分支与突触形成

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

轴突分支和突触形成对于建立精确的神经元环路至关重要。在发育过程中，感觉丘脑皮层（TC）轴突在大脑皮层的特定层内形成分支并建立突触。尽管轴突分支与突触形成之间存在明显的空间相关性，但二者之间的因果关系尚不明确。为了解决这一问题，我们近期开发了一种方法，可在组织器官共培养体系中对单个TC轴突的分支和突触形成过程进行同步成像。
本方案描述了一种结合了器官型共培养与电穿孔技术的方法。丘脑与大脑皮层的器官型共培养有助于基因操作及轴突过程的观察，同时保留了诸如层状结构等特征性组织架构。通过电穿孔技术，将两种分别编码DsRed和EGFP标记的突触素（SYP-EGFP）的独立质粒共转染至少量丘脑神经元中。该方法使我们能够同时可视化丘脑-皮层（TC）神经元的单个轴突形态及其突触前结构。此外，该方法支持长期观察，揭示了轴突分支与突触形成之间的因果关系。

本实验旨在揭示丘脑皮层（TC）轴突分支与突触形成之间的关系。为了同时观察轴突的走行轨迹和突触前部位的位置，在器官型共培养体系中，通过电穿孔技术将编码SYP-EGFP和DsRed的两种质粒转染至单个或少数几个丘脑细胞。在培养的第二周，可清晰地标记出彼此可区分的单条TC轴突，DsRed标记信号明确显示轴突形态（图3）。仅选择表现出 DsRed 和 SYP-EGFP 的轴突进行观察。标记的丘脑皮层（TC）轴突侵入皮层切片，并主要在上层形成分支，表明在器官型共培养中，丘脑轴突形成的分支具有类似于体内所见的层状特异性 体内7,8,10,14,15,<sup cl...

本方案描述了一种在丘脑与大脑皮层的器官型共培养物中，同时成像丘脑-皮层轴突分支及突触形成的实验方法。通过使用DsRed和GFP标记的突触素进行单细胞电穿孔技术，可对单个丘脑-皮层轴突及其突触前终末进行可视化观察。

轴突分支和突触形成是建立精确神经环路的关键过程。在发育过程中，感觉丘脑皮层（TC）...

该方法的总体目标是研究丘脑皮层投射中轴突分支和突触形成的动态形态变化。该方法有助于回答神经生物学领域的一些关键问题，例如新的神经回路形成。该技术的主要优势在于能够对单个活细胞中的轴突生长和突触形成进行同步观察。该方法可揭示丘脑皮层投射中轴突分支与突触形成之间的关系，也可应用于其他神经环路研究，例如大脑皮层内的固有连接。开始此操作前，需使用70%乙醇对所有手术器械灭菌10分钟或更长时间。接下来，在冰上低温麻醉条件下，迅速解剖出生后第2天的大鼠全脑。然后将脑组织放入含有40毫升冷的Hank's平衡盐溶液的100毫米培养皿中。在双目显微镜下，用精细镊子小心去除软脑膜，并使用显微外科剪将初级视觉皮层和体感皮层切成300至400微米厚的切片。随后，使用一次性塑料移液管将皮层切片转移至培养插入物的膜过滤器上。用一次性塑料移液管调整切片位置，使其靠近培养插入物的中央，并去除插入物中多余的培养基。将切片置于含血清的培养基中，在37摄氏度条件下培养，单独培养一天后，再将来自E15胚胎的丘脑组织块放置在其旁边。调节培养基液面至略低于脑片表面，以确保脑片能够充分获得气体和培养基的供应。这对于维持脑片的存活至关重要。在此步骤中，使用电极拉制仪制备玻璃毛细管。然后折断用于质粒注射的玻璃毛细管尖端。对于电极移液管，使用砂纸研磨并抛光玻璃毛细管的尖端，随后进行火焰抛光，使其内径达到50至200微米。接下来，将电极移液管和喷射移液管连接到操纵器上。将五微升质粒溶液转移至培养皿中，然后利用毛细作用将溶液吸入电极移液管内。将直径为0.2毫米的电极插入电极毛细管中。将喷射毛细管通过塑料管连接到一个1毫升的注射器上后，再次将5微升质粒溶液转移至培养皿中。然后使用注射器缓慢将溶液吸入喷射毛细管内。随后，将共培养物转移至电穿孔台上，并将直径为一毫米的电极插入培养基中。接着，将喷射移液管放置在培养的丘脑块上。当移液管尖端接触丘脑块表面后，手动推动注射器。在推出移液管后，立即将电极移液管放置在丘脑组织块上。现在施加电脉冲，并在示波器上监测脉冲幅度和脉冲串数量。随后，收回电极移液管，并将培养皿放回培养箱。为观察样本，将培养皿置于配备有 EGFP 和 DsRed 两组滤光片的直立共聚焦显微镜载物台上。然后使用 20 倍长工作距离物镜，以 1 至 7 微米的步进间距，采集 10 到 25 个光学切片的图像。选择可单独区分的标记轴突，这些轴突同时表达 DsRed 和 Syp-EGFP。图中显示的是丘脑和皮质切片在共培养 12 天后的器官型共培养物。此处为方框区域的放大图像。此处显示的是一个DsRed标记的丘脑细胞，其轴突延伸至皮层切片，并在浅层形成分支。这些图像展示了DsRed标记的丘脑-皮层轴突以及Syp-EGFP的荧光点状结构。在单个丘脑-皮层轴突上观察到Syp-EGFP呈离散性聚集分布。在培养的丘脑细胞接种

visualization-thalamocortical-axon-branching-synapse-formation

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

脊髓 Cocultures 丘脑-皮质轴突分支和突触形成的可视化研究

介绍了一种从E12.5小鼠胚胎中脑制备器官型脑片的方法。这些器官型脑片培养物可用于观察多巴胺能神经元或其他腹侧中脑神经元的行为。...

胚胎腹侧中脑组织切片培养：一种体外研究多巴胺能神经元发育的体系 in vitro

来源：Winkle, C. C., et al. 利用联合方法定义质膜递送在轴突分支与神经元形态发生中的作用。J. Vis. Exp.

小鼠皮层神经元轴突分支的实时体外成像

通过将脑组织切片与癌细胞进行器官型共培养，可以在癌细胞侵袭脑组织的过程中，利用荧光显微镜以及明场（视频）显微镜观察其形态学变化。该模型系统还支持细胞交换与补充操作，并可进行多种实验干预和分析。...

具有类器官脑切片与癌细胞三维球体的共培养系统

关键词：共培养系统，类器官脑切片，癌细胞，三维球体，肿瘤微环境，脑转移，体外模型

通过采用多个角度切割小鼠仔鼠脑组织，我们改进了先前描述的一种急性脑切片方法，该方法能够捕获大多数主要听觉中脑与前脑结构之间的连接。...

小鼠上丘-丘脑-皮层脑片的改良制备，结合 chamber 部件的 3D 打印与多尺度光学成像

本文介绍了一种基于脊髓切片在多电极阵列上培养的方案，用于研究脊髓固有连接的功能性再生 体外.

在多电极阵列上培养的脊髓组织共培养物中研究功能再生

结合生化检测的光学显微技术揭示了SNARE介导的胞吐作用在netrin依赖性轴突分支中的参与。该技术组合可用于鉴定调控轴突分支和细胞形态变化的分子机制。...

利用联合方法学定义质膜运输在轴突分支和神经元形态发生中的作用

本文介绍了一种从哺乳动物大脑皮层获取展平的切向切片，并利用组织化学和免疫组织化学方法可视化皮层功能模块的详细技术方案。...

展平哺乳动物皮层中的皮层模块可视化

在本实验方案中，我们旨在描述一种可重复的方法，用于将解离的人多能干细胞来源的神经元与星形胶质细胞共同组合形成三维球状共培养体系，在悬浮条件下维持这些细胞球的生长，并随后通过免疫分析和多电极阵列记录来检测细胞球中突触环路的活性。...

利用人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元三维共培养构建突触微环路模型

我们提供了生成和表征基于人诱导性多能干细胞（hIPSC）的2D和3D新皮质发育模型的详细方案，以及用于定性和定量分析初级纤毛（PC）发生与功能的互补方法。...

基于人诱导性多能干细胞的二维和三维模型解析初级纤毛在新皮质发育中的作用

本方案展示了一种简单且可靠的用于研究的方法 原位 轴突生长与生长锥动态。该方法描述了如何制备 离体...

在体 可视化急性离体胚胎脑切片培养中轴突生长与生长锥动态

发育过程中，新皮层的初级感觉区表现出独特的自发性活动。本文介绍了如何在新生小鼠中可视化单个神经元活动及初级感觉区，以分析特定脑区的同步活动 体内.

活体单神经元分辨率下新生小鼠感觉皮层自发活动的可视化

学习利用器官型共培养技术同时观察丘脑-皮质轴突分支与突触形成的动态形态变化。该方法采用大鼠脑切片与电穿孔标记，为神经回路发育研究提供活体成像手段。

在器官型共培养物中观察丘脑皮层轴突分支与突触形成

探索更多视频