Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

该方法的总体目标是研究丘脑皮质投影中轴突分支和突触形成的动态形态变化。这种方法可以帮助回答神经生物学领域的关键问题，例如新的神经回路形成。该技术的主要优点是同时观察单个活细胞中的轴突生长和突触形成。

这种方法可以深入了解丘脑皮质投射中轴突分支和突触形成之间的关系。它也可以应用于其他神经回路，例如大脑皮层的内在连接。要开始此程序，请用 70% 乙醇对所有手术器械消毒 10 分钟或更长时间。

接下来，在冰冷麻醉下快速解剖出生后第二天大鼠的全脑。然后，将大脑放入装有 40 毫升冷汉克平衡盐溶液的 100 毫米培养皿中。在双目显微镜下，用细镊子小心地去除软脑膜物质，并使用显微外科剪刀将初级视觉和体感皮层切成 300 至 400 微米厚的切片。

之后，使用一次性塑料移液管将皮质切片转移到培养插件的膜过滤器上。用一次性塑料移液管调整靠近培养插件中心的切片位置，并从插件中去除多余的培养基。将切片保持在 37 摄氏度的含血清培养基中，并单独培养一天，然后将来自 E15 胚胎的丘脑块放在旁边。

调整略低于切片表面的介质液位，以便切片可以接收到足够的气体和介质供应。这对于切片的生存能力至关重要。在此步骤中，使用电极拉拔器制作玻璃毛细管。

然后打破玻璃毛细管的尖端以进行质粒注射。对于电极移液器，用砂纸研磨和抛光玻璃毛细管的尖端。然后对它们进行火抛光，以达到 50 至 200 微米的内径。

接下来，将电极移液器和弹出移液器连接到机械手上。将 5 μL 质粒溶液转移到培养皿中。然后用毛细管作用将溶液吸入电极移液器中。

将直径为 0.2 毫米的电极插入电极移液器。将弹出移液管连接到带有塑料管的 1 毫升注射器后，再次将 5 微升质粒溶液转移到培养皿中。然后使用注射器将溶液缓慢吸入弹出移液管中。

之后，在电穿孔台上转移共培养物，并将直径为 1 毫米的电极插入培养基中。随后，将弹出移液管放在培养的丘脑块上。尖端接触丘脑阻滞表面后，手动推动注射器。

弹出移液管缩回后立即将电极移液器放在丘脑块上。现在，传递电脉冲。在示波器上监测幅度和列车数量。

然后，缩回电极移液器并将培养皿放回培养箱中。为了观察样品，将培养皿放在配备有两组 EGFP 和 DsRed 滤光片的立式共聚焦显微镜的载物台上。然后使用 20 倍长工作距离物镜以 1 到 7 微米的步长尺寸拍摄 10 到 25 个光学切片的图像。

选择可单独区分的标记轴突，这些轴突同时表达 DsRed 和 Syp-EGFP。这里显示的是 12 DIV 后丘脑和皮质切片的器官型共培养。这是方框区域的放大图像。

这是一个 DsRed 标记的丘脑细胞，将轴突延伸到皮质切片中，并在上层形成分支。这些图像显示了 DsRed 标记的丘脑皮质轴突和 Syp-EGFP 点。观察到 Syp-EGFP 沿单个丘脑皮质轴突的离散积累。

使用电穿孔将 DsRed 加 Syp-EGFP 质粒以一个 DIV 引入培养的丘脑细胞中。该轴突在四天内每天成像。轴突分支和突触形成是动态的，有添加和消除。

按照这些程序，可以使用感兴趣的基因以及 Syp-EGFP 和 DsRed 进行电穿孔，以研究基因在轴突分支和突触形成中的作用。这项技术为神经生物学领域的研究人员探索神经回路动态变化的机制铺平了道路。