丘脑皮层轴突分支与突触形成的器官型共培养可视化

本方法的总体目标是研究丘脑皮层投射中轴突分支和突触形成的动态形态学变化。该方法有助于回答神经生物学领域中的一些关键问题，例如新的神经环路形成。该技术的主要优势在于能够对单个活细胞中的轴突生长和突触形成进行同步观察。

该方法可揭示丘脑皮层投射中轴突分支与突触形成之间的关系，也可应用于其他神经环路研究，例如大脑皮层内的固有连接。开始此操作前，需使用70%乙醇对所有手术器械灭菌10分钟或更长时间。

接下来，在冰上低温麻醉条件下，迅速解剖出生后第2天的大鼠全脑。然后将脑组织放入含有40毫升冷的Hank's平衡盐溶液的100毫米培养皿中。在双目显微镜下，用精细镊子小心去除软脑膜，并使用显微外科剪将初级视觉皮层和体感皮层切成300至400微米厚的脑片。

随后，使用一次性塑料移液管将皮层切片转移至培养插件的膜过滤器上。用一次性塑料移液管调整切片位置，使其靠近培养插件的中央，并去除插件中多余的培养基。将切片置于含血清的培养基中，在37°C条件下培养，单独培养一天后，再将来自E15胚胎的丘脑组织块放置在其旁边。

调节培养基液面至略低于脑片表面，以确保脑片能够充分获得气体和培养基的供应。这对于维持脑片的存活至关重要。在此步骤中，使用电极拉制仪制备玻璃毛细管。

然后折断用于质粒注射的玻璃毛细管尖端。对于电极移液管，先用砂纸研磨并抛光玻璃毛细管的尖端，再进行火焰抛光，使其内径达到50至200微米。

接下来，将电极移液管和喷射移液管连接到操纵器上。将五微升质粒溶液转移至培养皿中，然后利用毛细作用将溶液吸入电极移液管内。

将直径为0.2毫米的电极插入电极毛细管中。将注射毛细管通过塑料管连接到一个1毫升的注射器上后，再次将5微升质粒溶液转移至培养皿中。然后使用注射器缓慢将溶液吸入注射毛细管内。

随后，将共培养物转移至电穿孔台上，并将直径为一毫米的电极插入培养基中。接着，将喷射移液管放置在培养的丘脑块上。当移液管尖端接触丘脑块表面后，手动推动注射器。

在推出移液管后，立即将电极移液管放置在丘脑组织块上。现在施加电脉冲，并在示波器上监测脉冲幅度和脉冲串数量。

随后，撤回电极移液管，并将培养皿放回培养箱。为观察样本，将培养皿置于配备有 EGFP 和 DsRed 两组滤光片的直立共聚焦显微镜载物台上。然后使用 20 倍长工作距离物镜，以 1 至 7 微米的步进间距，采集 10 到 25 个光学切片的图像。

选择可单独区分的标记轴突，这些轴突同时表达 DsRed 和 Syp-EGFP。图中显示的是丘脑和皮质切片在共培养 12 天后的器官型共培养结果。此处为方框区域的放大图像。

此处是一个DsRed标记的丘脑细胞，其轴突延伸至皮层切片，并在浅层形成分支。这些图像显示了DsRed标记的丘脑皮层轴突以及Syp-EGFP puncta。沿单根丘脑皮层轴突观察到Syp-EGFP的离散性聚集。

在培养的丘脑细胞接种后第一天（DIV），通过电穿孔法将 DsRed 与 Syp-EGFP 质粒导入细胞。该轴突连续四天每日成像。轴突分支与突触形成过程具有动态性，表现为不断新增与消除。

通过上述步骤，可将目的基因与 Syp-EGFP 和 DsRed 一同进行电穿孔，以研究该基因在轴突分支和突触形成中的作用。该技术为神经生物学领域的研究人员探索神经回路动态变化的机制提供了途径。