Name: 主动脉-性腺-肾外植体培养体系在发育性造血中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学习主动脉-性腺-肾外植体培养技术，用于研究哺乳动物造血干细胞发育的关键调控因子。该方法通过DNA表达分析和集落形成能力验证，为再生医学提供重要研究平台。

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感谢高素伟在图示制备中的帮助。本工作得到中国国家自然科学基金（81530004，31425016）和中国科学技术部（2016YFA0100500）项目的资助。J.L. 进行了实验并起草了稿件；F.L. 对稿件进行了修改。两位作者均阅读并批准了最终稿件。

所有涉及动物受试者的操作程序均已获得中国北京中国科学院动物研究所伦理审查委员会的批准。
1. 材料准备
<ol>
	<li>在超净工作台内，使用紫外灯产生的紫外线对0.65 µm滤膜进行4小时灭菌处理，并在2小时后翻转滤膜。 
	注意：使用紫外光时，请穿戴适当的防护装备。</li>
	<li>将不锈钢网置于高压蒸汽灭菌器中，在121 °C下灭菌30分钟。 
	注意：需要一定高度的不锈钢网以在气液界面支撑滤膜，可通过钢网上的金属丝实现（图1A）。</li>
	<li>将氟西汀稀释至M5300长期培养基中的终浓度为10 µM，并混匀。 
	注意：对于六孔板，每孔加入2 mL M5300长期培养基较为合适。可选择性地将氢化可的松稀释至培养基中，终浓度为10-6 M。</li>
	<li>将含10 µM氟西汀的培养基加入六孔板或培养皿中，并将已灭菌的不锈钢网放入培养基内。</li>
	<li>在玻璃细胞培养皿中，用沸水清洗0.65 µm滤膜两次，每次3分钟，以实现灭菌。每次清洗后，将滤膜置于磷酸盐缓冲液（PBS）中2分钟，然后将湿润的滤膜放置于竖立在气液界面的不锈钢网上，如图1A所示（中间为示意图）。 
	注意：可通过高压蒸汽灭菌器产生沸水以实现无菌操作，且应及时取出设备，避免温度下降。</li>
</ol>
2. AGM 外植体培养
<ol>
	<li>在 E10.5 或 E11 时期，使用镊子小心地将胚胎的 AGM 区域分离出来。
	<ol>
		<li>用解剖剪从怀孕小鼠体内剥离子宫，并将胚胎从子宫中分离。</li>
		<li>擦去卵黄囊、脐带以及胚胎体上的内脏组织。</li>
		<li>小心去除背部神经组织及周围肌肉组织。</li>
		<li>用镊子在前肢和后肢位置剪除组织，将 AGM 区域从胚胎体上分离。图 1B-C 展示了分离后 AGM 的示意图及其形态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将分离的 AGM 分别接种于滤膜上，在气液界面进行外植培养（图 1A），在 37 °C、5% CO2 条件下培养 2–3 天。 
	注意：不要将分离的 AGM 放置在金属网的金属丝上，确保培养过程中滤膜始终处于气液界面。除 AGM 外，卵黄囊和胎肝也可利用该系统进行培养7。</li>
</ol>
3. 表达分析
<ol>
	<li>mRNA 水平
	<ol>
		<li>将培养的 AGM 收集到 1 mL PBS 中，在 4 °C、310 × g 条件下离心 6 分钟。</li>
		<li>去除上清液后，根据制造商说明书，使用酚单相溶液从收集的 AGM 中提取总 RNA。</li>
		<li>取 2 µg 总 RNA，使用 M-MLV 逆转录酶进行逆转录，获得 cDNA 作为模板。采用 SYBR Green 进行定量实时 PCR 检测，以 Gapdh 作为内参对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白水平
	<ol>
		<li>按照上述步骤 3.1.1 所述方法收集培养的 AGM。</li>
		<li>使用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl、10 mM NaCl 和 0.5% NP-40）从培养的 AGM 中提取蛋白，并用于 Western 印迹检测蛋白水平，方法如前所述13。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 培养物中的菌落形成单位（CFU-C）检测
<ol>
	<li>培养 2 - 3 天后，将 AGM 区收集至 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，在 4 °C、310 × g 条件下离心 6 分钟，并在 37 °C 下用 200 µL 胶原酶（0.1% 溶于 PBS）进行解离。 
	注意：胶原酶消化生成单细胞悬液所需时间约为 20 分钟。每隔 5 分钟轻轻振荡含有 AGM 的离心管可加速消化过程。每个 AGM 使用 200 µL 0.1% 胶原酶，反应终止时加入 200 µL 10% 血清。</li>
	<li>将单细胞悬液接种于 M3434 培养基中，置于超低吸附 24 孔板中进行培养。 
	注意：为避免污染，可选择性地在培养基中添加青霉素-链霉素溶液。由于 M3434 培养基具有较高黏度，应使用无针头的 1.0 cc 注射器混匀细胞与培养基。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 条件下培养 7 - 10 天后，根据集落形态，利用倒置显微镜区分并计数各类集落，包括红系爆式集落形成单位（BFU-E）、粒单系集落形成单位（CFU-GM）以及粒细胞、红细胞、巨噬细胞、巨核细胞集落形成单位（CFU-GEMM）（图 2C）。</li>
</ol>
5. 体内 移植实验
<ol>
	<li>脾集落形成单位（CFU-S）实验
	<ol>
		<li>在胚体外植培养 2 - 3 天后，收集 AGM 组织，并通过加入 200 µL 胶原酶（0.1% PBS 溶液）孵育 20 分钟，制备单细胞悬液。</li>
		<li>在细胞注射前 4 - 5 小时，对 8 至 10 周龄的雄性 C57BL/6 小鼠进行致死剂量照射（9 Gy X 射线）。</li>
		<li>将照射后的小鼠放入固定器中以限制其活动。</li>
		<li>用浸有 75% 酒精的棉签擦拭小鼠尾部，以促进静脉血管扩张。</li>
		<li>使用 1.0 cc 注射器，将 0.5 胚胎当量（ee）或 1 ee 的 AGM 单细胞悬液经尾静脉静脉注射至受体小鼠体内。 
		注：细胞用 PBS 悬浮，每只受体小鼠注射 0.5 mL PBS 为适宜体积。使用 25 或 26 号针头配合 1.0 cc 注射器进行注射。注射器中不得引入空气。注射后用消毒棉签按压注射部位以止血。</li>
		<li>移植后第 11 天，取出受体小鼠的脾脏，用 Bouin 氏液（15 mL 1.22% 饱和苦味酸水溶液、2 mL 40% 甲醇和 1 mL 冰醋酸）固定 1 - 2 天，再用 80% 酒精洗涤 1 - 2 天。肉眼计数脾脏中可见的集落，并计算每胚胎当量（ee）的集落数量。 
		&#8203;注：使用 Bouin 固定液时需佩戴适当的防护装备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>长期移植实验
	<ol>
		<li>在胚体外植培养 2 - 3&#160;天后，收集 AGM 组织，并通过加入 200 µL 胶原酶（0.1% PBS 溶液）孵育 20 分钟，制备单细胞悬液。</li>
		<li>在细胞注射前 4 - 5 小时，对 8 至 10 周龄的雄性 C57BL/6 小鼠进行致死剂量照射（9 Gy X 射线）。</li>
		<li>将照射后的小鼠放入固定器中以限制其活动。</li>
		<li>用浸有 75% 酒精的棉签擦拭小鼠尾部，以促进静脉血管扩张。</li>
		<li>使用 1.0 cc 注射器，将 0.5 胚胎当量（ee）或 1 ee 的 AGM 单细胞悬液经尾静脉静脉注射至受体小鼠体内。AGM 以每只受体 1 ee 的剂量注射，同时联合注射 2×105 个骨髓细胞（CD45.1 背景）。 
		注：注射器中不得引入空气。注射后用消毒棉签按压注射部位以止血。</li>
		<li>移植后 4 个月，收集受体小鼠的骨髓样本，并通过流式细胞术（FACS）进行重建能力检测。仅将供体来源嵌合率 ≥10% 的受体视为成功重建。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464, 108-111 (2010).</li>
<li>Boisset, J. C., Robin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+founder+of+adult+hematopoiesis+in+the+mouse+embryo+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta.</a> Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).</li>
<li>Kissa, K., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+stem+cells+emerge+from+aortic+endothelium+by+a+novel+type+of+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition.</a> Nature. 464, 112-115 (2010).</li>
<li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).</li>
<li>Kumaravelu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+developmental+anatomy+of+definitive+haematopoietic+stem+cells+long-term+repopulating+units+%28HSC%2FRUs%29%3A+role+of+the+aorta-gonad-mesonephros+%28AGM%29+region+and+the+yolk+sac+in+colonisation+of+the+mouse+embryonic+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver.</a> Development. 129, 4891-4899 (2002).</li>
<li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%3A+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132, 631-644 (2008).</li>
<li>Medvinsky, A., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+is+autonomously+initiated+by+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region.</a> Cell. 86, 897-906 (1996).</li>
<li>Peeters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventral+embryonic+tissues+and+Hedgehog+proteins+induce+early+AGM+hematopoietic+stem+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development.</a> Development. 136, 2613-2621 (2009).</li>
<li>Taoudi, S., Medvinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+in+the+ventral+domain+of+the+embryonic+dorsal+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta.</a> PNAS. 104, 9399-9403 (2007).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+and+Hedgehog+Regulate+Distinct+AGM+Hematopoietic+Stem+Cells+Ex+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo.</a> Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).</li>
<li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stromal+clones+reveal+developmental+regulators+of+definitive+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells.</a> PNAS. 104, 20838-20843 (2007).</li>
<li>Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mpl+receptor+defect+leads+to+earlier+appearance+of+hematopoietic+cells%2Fhematopoietic+stem+cells+in+the+Aorta-Gonad-Mesonephros+region%2C+with+increased+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis.</a> Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).</li>
<li>Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hydroxytryptamine+synthesized+in+the+aorta-gonad-mesonephros+regulates+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival.</a> J Exp Med. 214, 529-545 (2017).</li>
<li>Souilhol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inductive+interactions+mediated+by+interplay+of+asymmetric+signalling+underlie+development+of+adult+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells.</a> Nature communications. 7, 10784(2016).</li>
<li>Fitch, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+the+sympathetic+nervous+system+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).</li>
<li>Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+swimming+test+and+fluoxetine+treatment%3A+in+vivo+evidence+that+peripheral+5-HT+in+rat+platelet-rich+plasma+mirrors+cerebral+extracellular+5-HT+levels%2C+whilst+5-HT+in+isolated+platelets+mirrors+neuronal+5-HT+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes.</a> Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).</li>
<li>Ortiz, J., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+monoamine+uptake+inhibitors+on+extracellular+and+platelet+5-hydroxytryptamine+in+rat+blood%3A+different+effects+of+clomipramine+and+fluoxetine%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine.</a> Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).</li>
<li>Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+inhibitor+of+serotonin+uptake%3A+Lilly+110140%2C+3-%28p-trifluoromethylphenoxy%29-N-methyl-3-phenylpropylamine%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine.</a> Life sciences. 15, 471-479 (1974).</li>
<li>Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx1+is+required+for+the+endothelial+to+haematopoietic+cell+transition+but+not+thereafter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter.</a> Nature. 457, 887-891 (2009).</li>
<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+and+early+hematopoietic+specification+of+the+developing+HSC+lineage+in+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region.</a> J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).</li>
<li>Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+together+the+organoid+field%3A+from+early+beginnings+to+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead.</a> Development. 144, 963-967 (2017).</li>
</ol>

作者无利益冲突的财务关系。

众所周知，骨髓中的成熟造血干细胞（HSC）能够重建经辐照受体的血液系统。与这些具有功能的HSC不同，小鼠胚胎AGM区域中出现的HSC尚处于未成熟状态。直接移植实验结果表明，I型（VE-cad+CD45-CD41+）和II型（VE-cad+CD45+）前体HSC均不具备重建能力20。利用AGM组织块培养系统，AGM区域新生的HSC可在移植实验中重建受体的造血系统4,20。此外，由于小鼠胚胎在子宫内发育，针对基因敲除（KO）小鼠体内造血功能缺陷进行挽救的in vivo实验操作不便。AGM组织块培养系统则是一种理想的替代方法，只需将化学物质（生长因子和细胞因子）加入培养基中，即可方便地开展挽救实验13,15。除AGM外，卵黄囊和胎肝也可采...

造血干细胞（HSCs）是一类具有多向分化潜能的组织特异性成体干细胞，可分化为红系、髓系和淋巴系细胞，并具备自我更新能力。近期研究表明，最早的造血干细胞起源于一种特殊的内皮细胞群体，称为生血性内皮（HE），通过背主动脉腹壁的内皮-造血转化（EHT）过程产生1,2,3,4。在小鼠胚胎发育的E10.5至E12.5期间，HSCs在主动脉-性腺-中肾（AGM）区域形成后，会迁移至胎肝进行扩增，最终定植于骨髓，以维持个体整个&#160;生命周期中的成体造血功能5,6。尽管该领域已研究多年，但HSCs的发生与发育机制仍未完全阐明。
与……不同 体外 受精和斑马鱼胚胎发育相比，小鼠胚胎的宫内发育使得在胚胎发生过程中对定型造血进行研究变得极为不便。尽管基因敲除（KO）小鼠常被用于遗传学实验，但某些基因敲除小鼠的缺乏也限制了其在造血研究领域的应用。此外 体内 在基因敲除小鼠中，挽救实验较难进行。自1996年以来，该领域的先驱者已开发出AGM组织块培养技术用于造血研究。7借助该培养系统，已发现AGM区域的腹侧组织可促进造血干细胞活性，而背侧组织则发挥相反作用8,9AGM 外植体培养系统还被用于确定血清素、Mpl、SCF、BMP 和 Hedgehog 信号通路在造血干细胞发育中的作用10,11,12,13,14重要的是，该方法也常用于挽救突变胚胎中的造血缺陷。13,15.

<table><tbody><tr><td>durapore 0.65 &amp;micro;m 滤膜</td><td>Millipore</td><td>R5BA63787</td><td>AGM 外植体培养</td></tr><tr><td>M5300 长期培养基</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5300</td><td>AGM 外植体培养</td></tr><tr><td>Trizol&amp;nbsp;</td><td>Tiangen</td><td>5829</td><td>RNA 提取</td></tr><tr><td>M-MLV 逆转录酶</td><td>Promega</td><td>90694</td><td>逆转录</td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Qiagen</td><td>A6002</td><td>定量实时 PCR</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>Roche</td><td>55622</td><td>蛋白质提取</td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>AGM 组织消化</td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434 培养基</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>3434</td><td>CFU-C 检测</td></tr><tr><td>超低吸附 24 孔板</td><td>Costar</td><td>3473</td><td>CFU-C 检测</td></tr><tr><td>C57BL/6 CD45.2 小鼠</td><td>北京华阜康生物科技股份有限公司</td><td></td><td>CFU-S 检测</td></tr><tr><td>C57BL/6 CD45.1 小鼠</td><td>北京华阜康生物科技股份有限公司</td><td></td><td>长期移植实验</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Life Technologines</td><td>8115284</td><td>AGM 组织采集</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>AGM 外植体培养</td></tr><tr><td>抗 CD45.2-PE-CY7 抗体</td><td>eBioscience</td><td>25-0454-80</td><td>长期移植实验</td></tr><tr><td>抗 CD45-FITC 抗体</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>长期移植实验</td></tr><tr><td>紫外灯</td><td>北京江morning yuan生物科技有限公司</td><td>039-14402</td><td>功率：30W</td></tr><tr><td>不锈钢筛网</td><td>AS ONE 上海有限公司</td><td>2-9817-10&amp;nbsp;</td><td>孔径直径：2.5 mm</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td>选择性稀释至 M5300 培养基中</td></tr></tbody></table>

主动脉-性腺-中肾区外植体培养系统在发育性造血中的应用

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

使用小鼠胚胎进行造血研究的局限性在于操作上的额外不便，这主要是由于胚胎在子宫内发育所致。尽管来自基因敲除（KO）小鼠的遗传数据具有说服力，但为所有需要的基因都构建基因敲除小鼠并不现实。此外，为了验证基因敲除小鼠所获得的数据而开展的体内挽救实验也存在操作不便的问题。为了克服这些局限性，研究人员开发了主动脉-性腺-中肾（AGM）组织块培养系统，作为研究造血干细胞（HSC）发育的合适模型。特别是对于挽救实验，该系统可用于恢复基因敲除小鼠中受损的造血功能。通过向培养基中添加适当的化学物质，可以重新激活受损的信号通路，或抑制异常上调的通路。利用该方法，可开展多种实验以鉴定HSC发育的关键调控因子，包括HSC相关基因在mRNA和蛋白质水平的表达、集落形成能力以及重建能力。这一系列实验将有助于阐明哺乳动物HSC发育所必需的潜在机制。

最近一项研究报道，血管内皮细胞来源的5-羟色胺通过抑制AGM中促凋亡通路促进造血干细胞的存活13为验证血清素对造血干细胞发育的促进作用，实验中加入了氟西汀。作为一种选择性血清素再摄取抑制剂（SSRI），氟西汀已被证实可抑制外周组织中血清素的再吸收16,17,18采用AGM组织块培养系统，按照上述流程检测了氟西汀对造血干细胞（HSC）发育的影响。表达分析结果显示，Runx1的表达水平升高，该基因被定义为HSC发育的关键基因。19，分别在氟西汀处理的AGMs中mRNA和蛋白质水平上（图2A 和 2B）。氟西汀还可显著增强AGM中造血干细胞的集落形成能力，包括BFU-E、C...

本方案描述了利用培养的主动脉-性腺-中肾组织进行表达分析、检测培养物和脾脏中的集落形成单位，以及长期重建造血，以确定调控因子和信号通路对造血干细胞发育的影响。该系统已被证明是研究造血干细胞生物学特性与功能的有效体系。

使用小鼠胚胎进行造血研究的局限性在于操作上的额外不便，这主要是由于胚胎位于子宫内……

本实验的总体目标是利用主动脉-性腺-中肾区外植体培养体系，研究造血干细胞发育的关键调控因子。该方法有助于解答造血干细胞生物学与功能领域中的关键问题，即如何鉴定参与哺乳动物造血干细胞发育调控的因子。该技术的主要优势在于，可通过DNA表达分析以及造血干细胞的集落形成能力和重建能力来验证这些调控因子。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为精确分离躯干区域的AGM及其周围组织需要经过练习才能掌握。在开始实验前，将不锈钢网放入六孔板的各个孔中，每孔加入两毫升新鲜配制的含氟西汀培养基。将每个实验孔所需的经紫外线灭菌的0.65微升滤膜放入玻璃细胞培养皿中，用新鲜煮沸的水浸泡洗涤两次，每次三分钟；每次洗涤后，将滤膜置于室温PBS溶液中浸泡两分钟。然后将一个滤膜放置在每个孔中钢丝网的气液界面处。接着使用解剖剪从妊娠11天的小鼠体内剥离子宫，并从子宫中取出胚胎。使用解剖剪去除胚胎体上的卵黄囊、脐带和内脏。小心去除背侧神经组织及周围肌肉组织。用镊子去除前肢和后肢的组织，并将AGM区与胚胎体分离。然后将每个AGM置于每孔气-液界面的单个滤膜上，将培养物放入37°C、5% CO2的培养箱中。2至3天后，将AGM样品转移至含有200微升胶原酶的单独1.5毫升微量离心管中，在37°C下振荡消化约20分钟，每5分钟摇动一次。消化结束后，每块组织加入200微升血清以终止反应。将每根试管中的全部内容物转移至含有500至600微升M3434培养基的24孔超低吸附培养板的各个孔中。使用1毫升无针头注射器轻轻混匀每个孔中的细胞。将培养板放入细胞培养箱中。培养7到10天后，可对每个孔中的菌落形成单位数量进行计数。对于体内AGM外植体移植，在按照上述方法进行2至3天AGM培养后，使用9戈瑞辐射剂量对8至10周龄雄性C57 Black Six小鼠进行致死性辐照处理。数小时后（4至5小时），按所示方法用每样本200微升胶原酶消化所收获的组织块。将所得单细胞悬液中相当于0.5至1个胚胎的量，加载至每只受体动物对应的一毫升注射器中。将第一只经辐照的小鼠放入固定器中，并用浸有75%乙醇的棉签擦拭其尾部，以促进尾静脉血管扩张。将一支注射器中的全部内容物经尾静脉缓慢注入体内。拔出针头后，使用消毒棉签按压止血。随后将动物放回笼中，并对下一只动物进行注射。在过继转移后的第11天，可将脾脏固定于Bouin溶液中，以进行肉眼可见的脾集落计数。添加氟西汀的AGM培养物显示出Runx1表达增加，该基因在HSC发育过程中至关重要，其mRNA和蛋白质表达水平均升高。氟西汀还可显著增强AGM中HSC的集落形成能力，包括红系爆式集落形成单位、粒单核细胞集落形成单位以及粒细胞、红细胞、巨噬细胞和巨核细胞集落形成单位。进一步将从AGM外植体中分离并经氟西汀处理的造血干细胞移植到经辐照的成年受体动物体内，会导致受体动物脾脏中菌落数量增

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

主动脉-性腺-肾外植体培养体系在发育性造血中的应用

改良的 ES/OP9 共培养方案可更有效地表征造血后代

本文描述了一种利用人脐带血和白血病骨髓细胞进行造血的三维培养系统。该方法基于使用涂覆有细胞外基质蛋白的多孔合成聚氨酯支架。该支架可适应多种细胞的培养。...

ex vivo 模拟正常与异常的人类造血过程

本方案描述了小鼠胚胎甲状腺原基的解剖，以及在半透滤膜或显微镜用塑料载片上对外植体进行培养的方法。该体系非常适合研究野生型或基因敲除胚胎甲状腺发育过程中发生的形态发生或分化事件，也可用于基因功能获得性和缺失性实验。...

一个 离体 用于研究甲状腺发育的培养系统

的 离体 直立液滴培养是现有方法的一种替代方案 体外 和 体内 实验技术。该方案易于操作，所需试剂用量较少，同时能够操控并研究胎儿的血管形成、形态发生和器官发生。...

使用 离体 直立式液滴培养法培养小鼠胎儿完整器官以研究器官发生过程中的发育机制

本方案描述了一种从小鼠胚胎中分离并培养后肾原基的方法。...

小鼠胚胎肾脏的分离与培养

利用小鼠胚胎期及围产期主动脉进行研究的实验方案 体内...

使用 在体 内 研究胚胎期和围产期主动脉形态发生与发病机制的组织与细胞外植体方法

本文介绍了在小鼠胚胎发育过程中对造血干细胞前体进行克隆分析的方法。我们将来自胚胎主动脉-性腺-中肾区域的单个细胞进行索引分选，结合内皮细胞共培养和移植实验，以表征单个造血前体细胞的表型特征及其植入潜能。...

利用单细胞索引分选联合内皮细胞微环境共培养技术对胚胎造血干细胞前体进行克隆分析

本文结合新型技术，对经典的鹌鹑-鸡嵌合体系统进行了更新，以研究器官形成。 体外 和 在卵内 实验步骤...

探索鸟类模型中器官形成的早期和晚期阶段的两步法：胸腺与甲状旁腺器官发生范式

本研究描述了两种用于研究器官发育的方法：一种是改进的禽类胚胎绒毛尿囊膜（CAM）异种移植体系，可实现培养的胚胎器官和类器官的血管化；另一种是新型的固定z轴方向器官培养方法，通过优化实验条件，可实现高分辨率的共聚焦显微镜延时成像。...

肾类器官和类器官型培养的优化：促进血管化、延长发育及改善显微成像

本文描述了四种利用新生小鼠睾丸原代细胞生成睾丸类器官的方法，即细胞外基质（ECM）依赖性和非依赖性的二维（2D）及三维（3D）培养环境。这些技术具有多种研究应用价值，尤其适用于体外研究睾丸的发育过程和生理功能。...

基于细胞外基质与无细胞外基质的小鼠睾丸类器官生成方法

体内骨类器官法用于获取治疗性造血干细胞/祖细胞

学习主动脉-性腺-肾外植体培养技术，用于研究哺乳动物造血干细胞发育的关键调控因子。该方法通过DNA表达分析和集落形成能力验证，为再生医学提供重要研究平台。

主动脉-性腺-中肾区外植体培养系统在发育性造血中的应用

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