扫描电子显微镜（SEM）

扫描电子显微镜（SEM）是一种在化学和材料分析中广泛应用的强大技术，它利用扫描的电子束来分析样品的表面结构和化学成分。

现代光学显微镜受限于可见光波与物体之间的相互作用，即衍射现象。两个物体之间可分辨的最小距离，或称横向分辨率，取决于衍射图样的大小相对于物体尺寸的变化。因此，在理想情况下，光学显微镜的最大放大倍数可达1,000倍，横向分辨率最高可达200 nm。

扫描电子显微镜（SEM）不受衍射效应的限制，因为它使用的是电子束而非光线。因此，SEM 可实现高达一百万倍的放大倍数，并具有亚纳米级的横向分辨率。此外，与光学显微镜仅能对焦平面内的结构成像不同，SEM 不受此限制。因此，在焦平面外的物体也能被清晰分辨，而在光学显微镜下这些物体会呈现模糊状态。这使得 SEM 的景深最多可提高至原来的 300 倍。

化学家广泛使用扫描电子显微镜（SEM）来分析纳米级实体（如催化剂颗粒）的表面成分、结构和形貌。

本视频将概述扫描电子显微镜（SEM）仪器的基本原理，并演示实验室中SEM样品制备与操作的基础步骤。

在扫描电子显微镜（SEM）中，样品必须具有导电性才能进行常规成像。对于非导电性样品，需在其表面镀上一层薄金属（如金）。然后通过将一束聚焦的高能电子束扫描样品表面来生成图像。

扫描电子显微镜（SEM）中使用的电子束由配备钨丝阴极的电子枪产生。在电场作用下，电子被加速并朝向阳极方向，即样品方向运动。

随后，电子束通过聚光镜聚焦，并进入物镜。用户必须对物镜进行校准，以将电子束聚焦在样品上的固定位置。聚焦后的电子束随后在样品表面进行光栅扫描。

当一次电子与样品相互作用时，会根据电子束能量的不同穿透至一定深度。这种与表面的相互作用导致二次电子和背散射电子的发射，随后由相应的探测器对其进行检测。

发射的二次电子信号强度随样品角度的不同而变化。与电子束垂直的表面释放的二次电子较少，因此显得较暗。在表面边缘处，会释放出更多的电子，该区域看起来更亮。这一现象使得图像呈现出清晰的三维外观，正如本张石棉的扫描电镜（SEM）图像所示。

相比之下，背散射电子会沿入射电子束的相反方向反射。其检测强度随样品原子序数的增加而增强，从而能够获取表面的成分信息，正如这张玻璃中包裹体的背散射图像所示。

在介绍完扫描电子显微镜（SEM）仪器的基本原理后，将在实验室中演示 SEM 的基本操作。

首先，将样品放置在样品台座上进行溅射镀膜。确保样品完全干燥并已脱气。如有需要，可使用双面导电碳胶带将样品固定在台座上。将样品放入溅射系统中，溅射几纳米厚的金层。金层的厚度应根据是否会影响样品表面形貌而进行调整。

将样品从溅射系统中取出。确保样品表面与金属 stub 之间存在导电通路。

样品镀膜完成后，即可进行成像。首先对扫描电镜样品室进行放气，使样品室恢复至常压。

打开扫描电镜样品室，取出样品台。将样品台上的样品座放置到位，并拧紧固定。

如果无法通过软件控制镜头与样品之间的距离（称为工作距离），请确保载物台和样品台具有适当的高度以获得图像。

将样品台放入样品室，并关闭仓室。

打开真空泵，使系统开始抽真空。

开始成像时，打开扫描电镜（SEM）软件。选择所需的运行电压，范围为1–30 kV。对于高密度材料，应使用较高的加速电压；而对于低密度材料，则应选择较低的加速电压。

大多数扫描电镜软件都包含自动聚焦功能。该功能将获取样品的焦点，作为起始点使用。

将放大倍数设置为最低的50倍放大级别。

扫描电子显微镜具有不同的扫描模式，例如快速扫描和慢速扫描。快速扫描模式可提供更快的屏幕刷新率，但图像质量较低。为便于找到样品并开始粗调焦，应选择快速扫描模式。

调节粗调焦旋钮，直至图像变得清晰。然后调节载物台位置，使感兴趣区域出现在显示屏上。

首先，在最低放大倍数下使用粗调焦旋钮进行对焦。然后，逐步增加放大倍数，直至观察到目标结构。在此放大倍数下，调节粗调焦旋钮，使图像大致聚焦。如有必要，在放大倍数提高后再次调节粗调焦旋钮。

然后，调节细准焦螺旋以进一步优化图像。每次增加放大倍数时，均需重复上述聚焦步骤。

不对称的电子束畸变可能导致图像模糊，这种现象称为像散，即使样品已准确聚焦时也是如此。为减小这种效应，应将放大倍数调至最高，使用微调焦旋钮对图像进行聚焦。然后在 x 和 y 两个方向上调节消像散器，以重塑电子束的形状。

继续调整焦距和散光校正设置，直至在更高放大倍数下图像达到尽可能清晰的状态。

然后返回至所需的放大倍数。

扫描电镜图像可以在“慢速拍照”或“快速拍照”模式下获取。“快速拍照”模式生成质量较低的图像，但采集速度更快。“慢速拍照”模式生成质量更高的图像，但可能会使样品表面产生电子饱和。

要测量所捕获图像中的特征，请使用软件的测量工具。

大多数仪器都包含测量选项，例如长度、面积和角度。

为确定长度，选择扫描电镜图像上需要测量的距离。在图像上单击以创建参考点，软件将分析这些参考点。

完成后，根据制造商的指南关闭扫描电镜（SEM）。

扫描电子显微镜用于成像多种多样的样本。

扫描电子显微镜可用于成像复杂且高度结构化的材料，例如碳纤维膜。

样品表现出高度的孔隙率和三维结构；这一特性在催化等应用中非常理想。

扫描电子显微镜也可用于观察生物样本，例如细菌。在此示例中，利用扫描电子显微镜对肠道细菌的毛发状附属结构（即菌毛）进行了成像。

幽门螺杆菌在血琼脂平板上培养，并将细菌接种至玻璃盖玻片上。

将完全干燥的样品进行固定，并镀上5 nm的钯金以使样品具有导电性。

最后，使用扫描电镜对样品进行成像。幽门螺杆菌清晰可见，并可观察到可测量的纳米级菌毛。

本示例描述了如何将脑组织包埋于稳定的树脂中，然后使用聚焦离子束和扫描电镜进行三维成像。

首先，将脑组织固定并包埋在树脂中。然后确定目标区域，并使用切片机进行切片。

随后将样品插入聚焦离子束扫描电子显微镜中进行三维成像。利用聚焦离子束依次去除样品的薄层。每次去除前，均使用背散射扫描电子显微镜对每一层进行成像。

您刚刚观看了 JoVE 关于扫描电子显微镜的简介。现在您应该理解扫描电子显微镜的基本工作原理，以及如何制备和分析 SEM 样品。

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