寻找靶向治疗获得性耐药的驱动通路：通过基因敲降产生耐药亚克隆并恢复药物敏感性

该临床前研究平台的总体目标是提供一种标准流程，用于鉴定和表征驱动靶向治疗获得性耐药的机制。该方法有助于推动基因组学在肿瘤学中的应用，特别是解决关于肿瘤异质性以及导致靶向治疗获得性耐药的多种机制的关键问题。该技术的主要优势在于其高效且经济的方法，能够实现在体外对靶向治疗耐药机制进行研究。

该技术在癌症治疗领域具有重要意义，因为肺部耐药性对于新兴的靶向治疗而言仍然是一个挑战。该方法不仅有助于揭示靶向治疗耐药过程中涉及的机制，还可用于研究传统化疗药物的疗效。通常情况下，使用该方法的操作人员在建立耐药亚克隆的过程中会遇到困难，这一步骤也是最难实现标准化的环节。

我们最初在表征HER2阳性胃癌细胞系对曲妥珠单抗获得性耐药机制时，提出了本方法的构想。该方法的可视化演示至关重要，因为体外药物耐药模型的建立与验证需要多种技术，包括通过基因敲低恢复药物敏感性。开始本实验时，将NCI N87细胞接种至25平方厘米的培养瓶中。

向每个培养瓶的培养基中加入每毫升10微克的曲妥珠单抗。用此起始剂量处理细胞，直至细胞恢复生长。约两周后当细胞生长恢复时，将曲妥珠单抗浓度提高至每毫升100微克继续处理细胞。

继续逐步增加曲妥珠单抗浓度，每次给药前需等待细胞恢复生长，直至浓度达到每毫升400微克。不同细胞系对不同药物的敏感性可能存在差异。解决该问题的一种方法是将细胞暴露于逐渐增加的药物剂量中，起始剂量约为血浆峰浓度的十倍，逐步增加至细胞仍能持续生长的水平。

接下来，将细胞接种至24孔培养板中。用浓度从100微克/毫升到400微克/毫升递增的靶向治疗抑制剂处理接种的细胞。在37摄氏度的CO2培养箱中孵育15天。

此后，移除培养基，并用 10 毫升 PBS-1X 洗涤细胞。移除 PBS-1X，每孔加入 2 至 3 毫升固定液。20 分钟后，移除固定液，每孔加入 2 毫升 0.5% 结晶紫溶液。

室温孵育两小时。然后，用移液器小心吸除结晶紫溶液。将培养板浸入自来水中，以冲洗掉任何残留物。

室温下风干至多两天。随后，使用倒置显微镜在4倍放大倍数下计数含有超过50个细胞的克隆。按照文本方案中所述计算相对抗性IC50比值。

首先，按照文本方案中所述，通过胰蛋白酶消化制备单细胞悬液。使用血细胞计数板和台盼蓝染色对细胞进行计数。然后，每种条件下向T-25培养瓶中接种2.5 × 10⁵个细胞。

接下来，将每种靶向基因的siRNA寡核苷酸或阴性对照siRNA寡核苷酸各12.5 µL用最低必需转染培养基稀释。按照与寡核苷酸1:1的比例加入阳离子脂质体转染试剂。室温孵育20分钟。

此后，向每个T-25培养瓶中加入700微升转染混合物。在37摄氏度下孵育一至三天。使用RT-PCR和Western Blot分析验证基因敲低效果。

接下来，将细胞接种至24孔培养板中。用浓度从100微克/毫升到400微克/毫升递增的靶向治疗抑制剂处理细胞。为确保基因敲低的有效性，siRNA寡核苷酸必须特异性地降低靶基因的表达。

设计的工具以及针对同一目的基因的siRNA检测对此具有帮助。在37摄氏度的CO2培养箱中孵育15天。移除培养基，并用10毫升PBS-1X冲洗细胞。

吸除 PBS 后，加入 2 至 3 毫升固定液。随后吸除固定液，加入 0.5% 结晶紫溶液，在室温下孵育 2 小时。

使用移液器小心吸除结晶紫溶液。接着将平板浸入自来水中。室温下晾干，最长不超过两天。

此后，使用倒置显微镜在 4 倍放大倍数下计数含有超过 50 个细胞的克隆。在本研究中，三种高表达 HER2 且对曲妥珠单抗敏感的胃癌细胞系被培养在含有靶向治疗药物的培养基中。由此获得了三个具有稳定耐药表型特征的亚克隆。

在所有亚克隆中，HR NCI N87 表现出最强的耐药性，其相对耐药 IC50 值达到 28.57。对蛋白和基因表达的分析支持了 IQGAP1 基因在 HR NCI N87 亚系耐药表型中起关键作用的假设。如图所示，耐药亚克隆中 IQGAP1 蛋白水平是亲本细胞的五倍。

HR NCI N87 亚系中 IQGAP1 基因的表达量是原始亚克隆的 2.5 倍。随后进行 IQGAP1 基因沉默实验，以评估其在曲妥珠单抗耐药表型形成中的作用。克隆形成实验进一步证实了 IQGAP1 重要性的假设。

如图所示，基因沉默恢复了细胞对曲妥珠单抗的敏感性，使IC50值降低至每毫升7微克。需要牢记的是，获得耐药性细胞亚克隆通常并不容易，且该方法存在潜在的失败风险。

通过该方法，可以获得多个具有不同耐药机制的克隆细胞系，这些机制介导了对靶向治疗的获得性耐药。建立体外模拟靶向治疗耐药性的标准操作流程，将有助于肿瘤学研究人员探索新的药物作用靶点，以克服药物耐药问题，而耐药性正是最新一代疗法面临的最大挑战。