开发一种电化学DNA生物传感器以检测食源性病原体

食源性病原体会导致全球范围内大量的公共卫生问题，显著影响人类的死亡率和发病率。传统的食源性病原体检测方法需要复杂的样品处理，且耗时较长。近年来，生物传感器已被证明是一种具有前景且全面的检测方法，具有检测速度快、实用性高等优点。

生物传感器的开发基于采用聚乳酸稳定的金纳米颗粒修饰的电极。通过修饰丝网印刷碳电极以增大工作电极的活性表面积。作为氧化还原复合物使用的亚甲蓝与固定化的探针DNA的单链DNA具有强结合力。

这种高亲和力关系表现为较高的峰值电流。单链DNA与其互补序列杂交后，会取代结合的亚甲蓝分子，从而降低差分脉冲伏安法的电流。这可能是由于互补双链DNA修饰电极表面聚集的亚甲蓝分子较少，导致鸟嘌呤碱基之间的相互作用无法发生所致。

所制备溶液的颜色变化始于黄色，随后变为黑褐色，最终变为深红宝石红色。这表明金盐已被柠檬酸根离子还原。将溶解的聚乳酸与先前制备的金纳米颗粒溶液混合，然后在室温下均匀搅拌，所得产物记为聚乳酸稳定的金纳米颗粒。

采用紫外-可见光谱、X射线衍射、透射电子显微镜以及配备能谱仪的能量色散X射线谱的场发射扫描电子显微镜对聚乳酸稳定的金纳米颗粒进行表征。取约25 µL聚乳酸稳定的金纳米颗粒均相溶液，迅速用移液器滴加到丝网印刷碳电极表面，室温下晾干24小时后备用。随后在铁氰化钾溶液中对修饰电极进行电化学表征，以测定其活性表面积、电化学阻抗谱、重复性、重现性和稳定性。

通过三个因素确定固定化条件的优化：单链DNA浓度范围为0.2至1.4微摩尔，时间范围为30至220分钟，温度范围为25至75摄氏度。另一方面，杂交条件的优化通过两个因素确定：时间范围为5至35分钟，温度范围为25至75摄氏度。经修饰处理的电极随后浸入20微摩尔的亚甲蓝溶液中30分钟。

用pH 4.5的醋酸盐缓冲液洗涤，去除非特异性吸附的DNA和过量的亚甲蓝，然后用去离子水冲洗。采用差分脉冲伏安法测定亚甲蓝还原的峰值电流。差分脉冲伏安法测量在pH 7.0的磷酸盐缓冲生理盐水中进行，该缓冲液中不含指示剂。

对所有相互作用均进行了类似的实验操作。本研究采用副溶血性弧菌作为参考菌株，并选取其他八种常见的食源性致病菌，即空肠弯曲菌、单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌 O157:H7、蜡样芽孢杆菌和溶藻弧菌，用于电化学DNA生物传感器的验证。为保持菌株活性，每两周在相应的琼脂培养基上进行一次常规传代培养。

采用涂布平板法测定副溶血性弧菌细胞的数量。取1毫米细菌培养液加入含3%氯化钠的9毫米胰蛋白胨大豆肉汤中，使稀释倍数达到10倍。随后，分别取0.1毫升从10倍稀释至10次方倍稀释的各稀释度样品，涂布于CHROMagar Vibrio平板上，用于菌落计数。

蛤蜊从湿货市场获取后，立即放入装有冰块的冷藏箱中，迅速运送到实验室进行分析。蛤蜊被分为两组，即处理组和未处理组，假设蛤蜊从捕捞开始至在市场冷藏储存前均保持一致的来源条件。处理组的蛤蜊先在零下20摄氏度条件下储存24小时，随后在20摄氏度下暴露于紫外光照射4小时，之后进行DNA提取。

对照组所采用的冷冻温度和紫外线照射预计会杀死或至少限制鸟蛤中自然积累的食源性病原体。未采用70摄氏度的更高巴氏杀菌条件，因为本研究中控制条件的目的是模拟新鲜鸟蛤的实际状况。同时，未经处理组的样品在到达实验室后立即进行分析，未经过任何预处理。

用蒸馏水清洗鸟蛤，并刷去污物，然后在层流柜中使用无菌镊子将组织从壳中取出。取约10克鸟蛤组织样本，加入含3%氯化钠的19毫升无菌胰蛋白胨大豆肉汤中，使用匀浆器匀浆60秒。对于加标样本，将已知量的食源性病原体加入9毫升匀浆后的样本肉汤中。

未加标的样品用作阴性对照。取约1毫升样品加入离心管中，用于DNA样本提取，该提取物将用于生物传感器和聚合酶链式反应检测。随后从加标和未加标的样品中提取食源性病原体的基因组DNA。

采用改良的煮沸裂解法提取基因组DNA。将基因组DNA在4摄氏度下以12,000转/分钟离心3分钟，获得澄清的悬浮液，并将上清液保存于-20摄氏度以备后续使用。使用生物分光光度计测定所提取基因组DNA的浓度和纯度。

随后使用标准生化检测方法确定所有菌株的身份，并通过16S rRNA基因测序进行验证。最后，在应用生物传感器之前，将基因组DNA在92摄氏度下变性两分钟，并迅速置于冰水中冷却。进一步通过针对相应基因的聚合酶链式反应对食源性病原体进行确认。

通过1.5%琼脂糖凝胶电泳确定扩增产物及其大小。使用凝胶成像系统采集凝胶图像。聚乳酸稳定的金纳米颗粒的生成通过紫外-可见光谱确认，其表面等离子体共振峰在约540纳米处出现。

聚乳酸稳定的金纳米颗粒的形成与存在通过500至600纳米波长范围内的吸收峰得以证实，具体波长取决于颗粒尺寸。在31.7、38.2、44.4、64.7和77.7度处观察到所有聚乳酸稳定金纳米颗粒的晶粒衍射峰。此外，在31.7度处出现更宽的衍射峰，且晶粒峰强度随之增加，表明金纳米颗粒嵌入在聚乳酸基质中，提示形成了多相金纳米结构。

从聚乳酸稳定的金纳米颗粒的透射电子显微镜粒径分布曲线和图像可以看出，金纳米颗粒几乎呈球形。纳米颗粒的尺寸范围约为37纳米，略大于通过谢乐公式（Scherrer's formula）计算得到的结果，表明所合成的纳米颗粒具有多晶性质。聚乳酸稳定的金纳米颗粒的主要尺寸是通过测定100晶面布拉格衍射峰的宽度，并利用谢乐公式计算得出的。

根据表格数据，聚乳酸稳定的金纳米颗粒的晶粒尺寸计算为27纳米。通过场发射扫描电子显微镜图像及能量色散X射线光谱分析，经修饰的丝网印刷碳电极具有最高的金元素质量百分比、最大的密度以及最密集的纳米颗粒覆盖结构。能量色散X射线光谱证实，所制备的聚乳酸稳定的金纳米颗粒仅由金元素组成，除对应于碳和氧的峰外，未显示其他元素。

在不同扫描速率下，阳极和阴极峰电位保持一致，表明根据峰分离判断，该电化学反应是可逆的。裸电极和修饰电极的活性表面积分别计算为0.26厘米²和0.41厘米²。该结果证实，与裸电极相比，聚乳酸稳定的金纳米颗粒对活性表面积的提升效果相对更高。

裸电极的电荷转移电阻值为1,932 ohm，而修饰电极的电阻值降低至1,444 ohm。修饰电极中电荷转移电阻值的降低可能是由于局部介电常数减小和/或电双层厚度增加所致，表明亚铁氰化钾在金属或溶液界面通过吸附发挥作用。随着聚乳酸稳定的金纳米颗粒对裸电极的逐步修饰，峰电流逐渐增加，表明灵敏度更高，这与较低的电荷转移电阻呈反比关系。

修饰电极的相对标准偏差为4.26%。经聚乳酸稳定的金纳米颗粒修饰后的电极在多次测量后表现出更优的相对标准偏差，其值为4.05%，表明该修饰电极在制备聚乳酸稳定金纳米颗粒时具有更好的重现性。优化后的DNA浓度为1.2 µmol/L的单链DNA。

单链DNA的最佳固定时间为180分钟。单链DNA的最佳固定温度为55摄氏度。双链DNA的最佳杂交时间为10分钟。

双链DNA的最适杂交温度选定为35摄氏度。在所检测的DNA中，互补DNA表现出最低的峰值电流，为0.73微安，低于非互补DNA、三个碱基错配DNA和一个碱基错配DNA。显然，靶向DNA产生的电流明显小于其他寡核苷酸序列的电流。

该结果表明，该生物传感器具有高灵敏度和高特异性，可用于鉴别检测。所构建的DNA生物传感器通过将探针DNA固定在修饰电极表面，实现了对杂交反应的特异性检测。随着互补DNA浓度的增加，修饰电极上亚甲基蓝的差分脉冲伏安峰电流持续降低，从而触发检测信号的变化。

在0.2 皮摩尔至0.02 毫摩尔的不同目标DNA浓度的对数与亚甲基蓝还原峰电流的对数之间呈现出线性相关性，线性回归系数为0.96。所制备的DNA生物传感器在储存六个月后，其信号回收率缓慢下降，但不低于初始信号的80%，表明修饰电极表面的单链DNA探针具有高度稳定性。在低于45摄氏度的温度下具有良好的长期稳定性，这可能是聚乳酸稳定的金纳米颗粒与单链DNA之间发生强相互作用的原因。

对九种不同细菌的聚合酶链式反应扩增产物进行了检测，这些细菌分别为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）、大肠杆菌（Escherichia coli）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritis）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）。交叉反应性评估后获得的差分脉冲伏安法峰值电流显示，与其他细菌相比，副溶血性弧菌的检测信号非常清晰。可见随着碱基对数量的减少，观测到的差分脉冲伏安法信号增强。

这与更多的亚甲蓝分子进入探针有关。根据聚合酶链式反应分析结果，在加标处理和未处理的样品中均检测到副溶血性弧菌，如第7、8、9、10、11和12泳道所示；而第1、2、3、4、5和6泳道的未加标处理和未处理样品中均未检出副溶血性弧菌。

利用所开发的DNA生物传感器对加标和未加标样本组成的处理组进行检测，成功确定了副溶血性弧菌的存在。这些结果与先前讨论的聚合酶链式反应结果呈正相关。聚乳酸稳定的金纳米颗粒在作为修饰材料用于进一步传感元件构建方面具有广阔的应用前景。

当氧化还原复合物与未杂交的生物识别分子结合更强时，可实现高选择性，这一创新值得进一步关注。