电化学 DNA 生物传感器检测食源性致病菌的研究进展

食源性病原体导致全球公共卫生问题的很大一部分，这显着影响人类死亡率和发病率。检测食源性病原体的传统方法需要复杂的样品处理且耗时。近年来，生物传感器已被证明是一种很有前途的综合检测方法，具有检测速度快、实用性强等优点。

生物传感器的开发基于具有聚乳酸稳定金纳米颗粒的改性电极。对丝网印刷碳电极进行改性以增加工作电极的活性表面积。用作氧化还原复合物的亚甲蓝与固定探针 DNA 的单链 DNA 具有很强的键合。

这种高 afinity 关系由高峰值电流表示。单链 DNA 与其互补序列的杂交取代了键合的亚甲基蓝分子，这减少了差分脉冲伏安法的电流。这可能是由于修饰电极表面聚集的亚甲蓝量较少，带有互补双链 DNA，这是由鸟嘌呤碱基之间无法到达的相互作用引起的。

制备溶液的颜色从黄色变为黑色，最后变为深宝石红色。这表明金盐已被柠檬酸盐离子还原。将溶解的聚乳酸与先前制备的金纳米颗粒溶液混合，然后在室温下均匀搅拌，然后表示为聚乳酸稳定的金纳米颗粒。

采用紫外可见光谱、X 射线衍射、透射电子显微镜和场发射扫描电子显微镜与能量色散 X 射线光谱法对聚乳酸稳定的金纳米颗粒进行表征。将约 25 微升聚乳酸稳定的金纳米颗粒均相溶液快速移液到丝网印刷的碳电极上，并在使用前 24 小时风干。然后在亚铁氰化钾中对改性电极进行电化学表征，以测量活性表面积、电化学阻抗谱、可重复性、重现性和稳定性。

使用三个因素确定固定条件的优化，单链 DNA 的浓度范围为 0.2 至 1.4 微摩尔，时间范围为 30 至 220 分钟，温度范围为 25 至 75 摄氏度。另一方面，杂交条件的优化是通过两个因素确定的，即 5 到 35 分钟的时间范围和 25 到 75 摄氏度的温度。随后将处理过的改性电极浸入 20 微摩尔亚甲蓝中 30 分钟。

用 pH 4.5 的乙酸盐水缓冲液洗涤去除非特异性吸收的 DNA 和过量的亚甲基蓝，然后用去离子水冲洗。使用差分脉冲伏安法技术测量亚甲基蓝还原的峰值电流。差分脉冲伏安法测量使用不含指示剂的磷酸盐缓冲盐水 pH 7.0 进行。

对所有交互进行了类似的程序。本研究采用副溶血性弧菌作为参考菌株，其他 8 种细菌菌株，即空肠弯曲杆菌、单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒杆菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌 O157：H7、蜡样芽孢杆菌和溶藻弧菌用于电化学 DNA 生物传感器验证本研究。每两周在各自的琼脂上进行一次细菌菌株的常规传代培养，以保持其活力。

使用展板技术测定副溶血性弧菌细胞的数量。将 1 毫米的细菌细胞培养物转移到含有 3% 氯化钠的 9 毫米胰蛋白酶大豆肉汤中，以获得 10 的稀释因子。接下来，将 0.1 毫升从开始的每种稀释因子开始，到 10 倍稀释因子 10 倍的一次稀释因子分别铺在 CHROMagar 弧菌板上进行菌落计数。

鸟蛤是从湿货市场获得的，然后迅速装在冰柜中带到实验室进行分析。鸟蛤分为两组，即处理组和未处理组，假设鸟蛤从收获开始到将它们放入市场的冷藏库都是均匀收获的。处理组的鸟蛤在零下 20 摄氏度下储存 24 小时，然后在 DNA 提取前在 20 摄氏度的紫外线下暴露 4 小时进行预处理。

对照组使用的冷冻温度和紫外线照射预计会杀死它或至少限制鸟蛤中自然积累的食源性病原体。没有应用 70 摄氏度的更高巴氏杀菌制度，因为本研究中受控条件的目的是模拟新鲜鸟蛤的实际情况。同时，未处理组的样本一到达实验室就直接进行了分析，无需任何预处理。

用蒸馏水清洗鸟蛤并擦洗去污垢，然后使用无菌镊子和层流柜从壳中取出组织。用均质器将约 10 克鸟蛤组织样品在 19 毫升含 3% 氯化钠的无菌胰蛋白酶大豆肉汤中匀浆 60 秒。然后将已知量的食源性病原体添加到 9 mm 的均质样品汤中，用于加标样品。

未加标的样品用作阴性对照。将大约 1 mL 样品移液到 Eppendorf 管中用于 DNA 样品提取，该样品将用于生物传感器和聚合酶链反应测定。然后从加标和未加标样品中提取食源性病原体的基因组 DNA。

在改良的煮沸裂解程序后提取基因组 DNA。将基因组 DNA 在 4 摄氏度下以每分钟 12， 000 转的速度离心 3 分钟，以获得透明的悬浮液，上清液保持在零下 20 摄氏度以备进一步使用。使用生物光度计测定提取的基因组 DNA 的浓度和纯度。

然后使用标准生化测定法确定所有菌株的身份，并通过 16 个 SR RNA 基因测序进行验证。最后，基因组 DNA 在 92 摄氏度下变性 2 分钟，并在应用生物传感器之前在冰水中快速冷却。使用靶向相应基因的聚合酶链反应进一步确认食源性病原体。

通过在 1.5% 琼脂糖凝胶上电泳确定扩增产物及其大小。使用凝胶成像系统捕获凝胶图像。从紫外可见光谱证实了聚乳酸稳定金纳米颗粒的生成，其表面等离子体和共振峰的生长建立在 540 纳米附近。

聚乳酸稳定的金纳米颗粒的形成和存在在 500 至 600 纳米波长范围内表示，具体取决于颗粒大小。在 31.7 度、 38.2 度、 44.4 度、 64.7 度和 77.7 度的两个剧院观察到聚乳酸稳定金纳米颗粒的所有微晶峰。随着 31.7 度处进入更宽的衍射峰，微晶峰强度也增加，这意味着冷纳米颗粒嵌入聚乳酸中，并表明多相金纳米结构的形成。

从透射电子显微镜颗粒分布曲线和聚乳酸稳定金纳米颗粒的图像可以看出，金纳米颗粒的形状几乎是球形的。纳米颗粒的尺寸约为 37 纳米，略大于从 Scherrer 公式获得的尺寸，表明合成的纳米颗粒具有多晶性质。聚乳酸稳定的金纳米颗粒的主要尺寸是通过确定 100 布拉格反射的宽度，使用 Sherrer 方程计算的

从表中计算出聚乳酸稳定金纳米颗粒的微晶尺寸为 27 纳米。从场发射扫描电子显微镜图像和能量色散 X 射线光谱来看，改性丝网印刷碳电极具有最高的金质量百分比、最大的密度和最大的纳米颗粒覆盖结构。能量色散 X 射线光谱证实，产生的聚乳酸稳定金纳米颗粒仅由金组成，除了对应于碳和氧的峰外，没有显示其他元素。

阳极和阴极峰电位在不同扫描速率下是一致的，这表明电化学反应是基于峰分离是可逆的。计算出裸电极和改性电极的修饰电极的活性表面积分别为 0.26 平方厘米和 0.41 平方厘米。这一结果证实，与裸电极相比，聚乳酸稳定的金纳米颗粒在活性表面积上提供的改善相对较高。

裸电极的电荷转移电阻值为 1， 932 欧姆，而改性电极降至 1， 444 欧姆。改性电极中电荷转移电阻值的降低可能是由于局部介电常数的降低和/或双电层厚度的增加，这表明亚铁氰化钾通过金属或溶液界面的吸收发挥作用。随着使用聚乳酸稳定的金纳米颗粒对裸电极的修饰，峰值电流逐渐增加，这表明较高的灵敏度与较低的电荷转移电阻相反。

经多次测量后，改性电极的相对标准差为 4.26%聚乳酸稳定金纳米颗粒改性电极的相对标准差较好。改性电极的相对标准偏差值为 4.05%，表明聚乳酸稳定金纳米颗粒的电极制备具有更好的重现性。DNA 的最佳浓度为 1.2 μmol 单链 DNA。

单链 DNA 的最佳固定时间为 180 分钟。单链 DNA 的最佳固定温度为 55 摄氏度。双链 DNA 的最佳杂交时间为 10 分钟。

双链 DNA 的最佳杂交温度为 35 摄氏度。互补 DNA 在探测的 DNA、非互补 DNA、三个碱基错配的 DNA 和一个碱基错配的 DNA 中表现出最低的峰电流，为 0.73 微安。很明显，来自靶向 DNA 的高电流小于其他寡核苷酸序列的电流。

这一结果表明，生物传感器可用于区分，具有很高的灵敏度和特异性。构建的 DNA 生物传感器具有通过修饰电极表面固定探针 DNA 进行杂交检测的选择性。由于互补 DNA 浓度的增加，修饰电极上亚甲蓝的差分脉冲伏安法峰值电流持续降低。

0.96 的线性回归系数描述了 0.2 皮摩尔至 0.02 毫摩尔的各种靶 DNA 浓度的对数与亚甲基蓝还原峰电流的对数之间的线性相关性。制备的 DNA 生物传感器在储存 6 个月后，回收率缓慢下降至不低于其初始信号的 80%，表明修饰电极表面的单链 DNA 探针高度稳定。在低于 45 摄氏度的温度下良好的长期稳定性可能是聚乳酸稳定的金纳米颗粒与单链 DNA 之间发生强烈反应的原因。

筛选出蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特菌、空肠弯曲杆菌、大肠埃希菌、溶藻弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门菌、肺炎克雷伯菌和副溶血性弧菌 9 种不同细菌的聚合酶链反应扩增产物。交叉反应性评估后获得的差分脉冲伏安法峰值电流显示，与其他细菌种类相比，对副溶血性弧菌的检出非常清晰。通过减少碱基对的数量可以看出，观察到的差分脉冲伏安法信号增加。

这与探针下至亚甲蓝分子的数量较多有关。从聚合酶链反应分析中，在处理和未处理的加标样品中均发现副溶血性弧菌，如泳道 7、8、9、10、11 和 12 所示。而泳道 1、2、3、4、5 和 6 的处理和未处理的未加标样品不含副溶血性弧菌。

使用开发的 DNA 生物传感器的检测结果成功确定了由加标和未加标样品组成的处理组中是否存在副溶血性弧菌。这些结果与前面讨论的聚合酶链反应结果呈正相关。聚乳酸稳定的金纳米颗粒的应用具有巨大的应用潜力，可以作为进一步制造感的改性。

当氧化还原复合物与未杂交的生物识别分子结合更强时，可以实现高选择性，这可能是一项值得跟进的创新。