拟南芥种子高通量灭菌的标准化方法

该程序的总体目标是为大量拟南芥基因型的成功种子灭菌提供标准化条件，同时防止微生物生长。这种方法允许您一次对数百个种子样品进行灭菌，从而简化了基因组学、蛋白质组学、代谢组学和其他高通量研究领域的关键植物材料制备步骤。该技术的主要优点是，它为大量种子样品提供了高效灭菌和高发芽率相结合的条件。

首先，用蒸馏水制备 50% 漂白剂溶液。向每 200 毫升漂白剂溶液中加入 50 微升吐温 20 洗涤剂。漂白剂溶液可以储存长达一个月，只要它只在无菌条件下打开。

接下来，将 100 颗种子分装到 1.5 毫升微量离心管中。这可以手动完成，也可以使用定制的种子机器人完成。现在，在层流罩中，向种子中加入 500 微升 50% 漂白剂溶液。

然后，将试管转移到旋转器上，将种子在漂白剂中轻轻搅拌孵育 10 分钟。10 分钟后，从试管中吸出漂白剂溶液，尽可能多地去除。然后，加入 500 微升无菌蒸馏水，倒置试管混合。

让种子沉淀，然后吸出水并用另一份等分试样代替它以再次清洗种子。用无菌蒸馏水总共进行六次这样的洗涤。种子用水彻底清洗后，在装板前将它们悬浮在一毫升水中。

在开始灭菌过程之前，计算产生氯气所需的漂白剂和盐酸的体积。使用提供的方程式获得推荐的 6% 氯气。确保精确计算确保成功灭菌和防止飞溅所需的 HCl 体积。

在此方案期间，请务必戴上手套和实验服，并在手套被酸或漂白剂弄湿时更换手套。在通风橱下，将种子瓶转移到盖子打开的架子上。然后，将架子放入可以进行消毒的塑料容器中，并准备石蜡薄膜条以将盖子密封到容器上。

现在，在烧杯中加入 100 毫升漂白剂，然后将一个 250 毫升的烧杯放入其中。使用过量的漂白剂是一项安全功能，烧杯应至少是其所含溶液总体积的两倍。此外，请务必将漂白剂和酸分开处理。

接下来，在烧杯中加入 3 毫升盐酸，然后立即关闭容器并用封口膜密封。监测容器一小时，以确保气体在灭菌过程中积聚。氯气在容器内应显示为微弱的黄色雾霾，或者可以检查溶液是否变黄。

定期检查容器上的密封。如果盖子脱落或石蜡密封开始松动，请用额外的石蜡膜重新密封盖子。消毒 1 小时后，打开容器的一角，在 3 小时内将气体排出。

通风 3 小时后，盖上所有试管，并将灭菌的种子储存在干燥的条件下，直到它们被铺板。现在，通过缓慢加入 1.5 克碳酸氢钠粉末来中和反应，同时用玻璃棒搅拌以溶解固体。继续添加碳酸氢钠，直到二氧化碳气泡停止形成。

然后，测量溶液的 pH 值，如果需要，添加额外的碳酸氢钠，直到 pH 值为中性。只要溶液没有臭味，就可以丢弃。否则，请等待所有气味消散。

向每管气体灭菌的种子中加入 500 微升无菌蒸馏水。然后，将种子倒在 MS 板上，并使用无菌一次性接种环或无菌移液器吸头均匀分布。在 4 摄氏度下分层种子三天后，将板转移到 23 摄氏度，每天光照 16 小时。

将盖子放在上面，以便根部长入培养基中。生长八天后，对发芽的种子分数进行评分。当根式突出到种皮外时，就会计算发芽率，并且可以看到两个子叶。

此外，计算受霉菌影响的种子数量以确定灭菌条件的有效性。在 Columbia 野生型种子上测试了 5 个不同暴露时间的 4 种不同浓度的漂白剂。高漂白剂浓度对发芽产生不利影响，暴露过多。

然而，在所有暴露时间使用 40% 和 50% 漂白剂观察到高发芽率。用高浓度漂白剂消毒的种子死亡率高，经常出现生长缺陷，但通常完全没有霉菌。使用 50% 漂白剂灭菌 10 分钟，以确定具有霉菌抑制和健康发芽的最佳平衡。

为了优化氯气灭菌条件，使用三种不同浓度的氯气在两种不同的时间长度内对 Columbia 野生型种子进行灭菌。时间和气体浓度之间存在显着的交互作用。1 小时时，对发芽没有影响，而最高气体浓度在 3 小时时是有害的。

因此，选择了一小时的绝育期。霉菌生长通过暴露 3 小时的气体或使用 6% 或 17% 的气体暴露 1 小时得到有效抑制。因此，确定 6% 的气体浓度持续 1 小时是发芽和霉菌抑制的最佳状态。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术每天可以成功地对数百根种子线进行消毒。气体灭菌的种子也可以在干燥条件下长时间储存。在尝试此过程时，请务必记住使用提供的方程式来计算所需的 HCl 和漂白剂体积。

按照此程序，可以执行其他方法，如全基因组关联研究，以将各种不同的基因型和感兴趣的表型联系起来。祝你的实验好运。