一种基于荧光的简易报告基因检测法，用于鉴定酵母中蓖麻毒素A链（RTA）转运所需的细胞组分

本简单基于荧光的报告基因检测方法的总体目标是筛选酵母模式生物中参与蓖麻毒素A链（ricin toxin A或RTA链）正常转运过程所需的细胞组分。该方法有助于解答有关核糖体失活B毒素在细胞内转运过程中的关键问题。在本例中，即植物毒素蓖麻毒素的细胞毒性亚基从质膜进入细胞质的过程。

该实验的主要优势在于能够快速且经济地分析单个酵母基因对RTA转运的影响。按照文字版实验方案中的详细说明，首先进行细胞转化。用含有RTA表达质粒或空载体的细胞接种5毫升LB卡那霉素培养基。

将细胞在37摄氏度、220转/分钟条件下培养24小时。在1升LB卡那霉素培养基中加入5毫升预培养物，然后将细胞在37摄氏度、220转/分钟条件下继续培养，直至细胞在600纳米处的光密度达到0.8至1.0。

随后，将培养温度降至28摄氏度。通过加入IPTG至终浓度为1毫摩尔，诱导大肠杆菌中RTA的表达。在28摄氏度、220转/分钟条件下培养3.5小时后，于10,000 ×g、4摄氏度离心10分钟收集细胞。

然后用 5 mL 结合缓冲液洗涤沉淀，在 10,000 g、4 °C 条件下离心 10 分钟以收集沉淀。重复洗涤一次后，将沉淀重悬于 5 mL 结合缓冲液中。在冰上进行超声处理，采用 5 个循环，每个循环包括 15 秒脉冲和 30 秒暂停。

将细胞裂解物在 4 摄氏度、21,000 g 条件下离心 15 分钟后，使用无菌注射器滤器系统过滤上清液。采用配备 5 毫升镍基亲和层析柱的自动化纯化系统，从经无菌过滤的大肠杆菌上清液中纯化 HIS 标签的 RTA 组分。通常情况下，使用 1 毫升/分钟的洗脱流速，并对整个纯化系统进行冷却，以防止毒素结合效率降低及毒素活性丧失。

用20毫升结合缓冲液短暂平衡亲和柱，以去除保存缓冲液。然后使用注射器将无菌过滤后的上清液加载到亲和柱上。用25至35毫升结合缓冲液洗涤柱子，以去除未结合的蛋白质。

重复洗涤步骤，直至280纳米处的紫外吸收值接近初始紫外值。随后用20至35毫升洗脱缓冲液洗脱结合的RTA组分，并将样品置于冰上保存。在280纳米紫外吸收值开始上升后应尽快开始收集RTA组分，当吸收值再次回到原始基线水平时，应立即停止收集。

为了对洗脱的RTA组分进行脱盐，将纯化系统的亲和柱更换为脱盐柱，并用20毫升0.8摩尔的山梨醇平衡柱子。通过注射器将洗脱的RTA组分上样至柱中。用100毫升0.8摩尔的山梨醇洗涤柱子，并在紫外吸收开始上升时，立即在15毫升离心管中稀释脱盐后的RTA组分。

为避免盐污染，当电导率升高时，立即停止组分收集。将洗脱的 RTA 组分在 4°C 下保存。按照文本方案中所述转化酵母后，从每块平板上挑取三个不同的酵母克隆。

将克隆接种于100毫升亮氨酸缺陷型棉子糖培养基中，在220转/分钟、30摄氏度条件下培养，使600纳米处的光密度达到1.0至2.0。在25摄氏度下以10,000 ×g离心5分钟收集细胞。用5毫升无菌水洗涤细胞两次后，将细胞重悬于50毫升原生质球缓冲液中。

将50毫升培养物在100 rpm、30°C条件下孵育90分钟。随后在400 ×g、4°C条件下离心10分钟，用5毫升稳定型亮氨酸缺陷型棉子糖培养基洗涤细胞两次。然后将细胞重悬于5毫升相同培养基中，直接用于GFP报告基因检测分析。

将酵母细胞原生质体接种到96孔板中。向每孔加入70微升稳定化的亮氨酸缺陷型棉子糖培养基，其中含有阴性对照，即表达空载体或纯化的RTA，最终RTA浓度为5微摩尔。向其余各孔中每孔加入70微升稳定化的亮氨酸缺陷型培养基，使每孔总体积达到270微升。

作为蛋白质抑制的阳性对照，加入70微升0.8摩尔的山梨醇稳定G418溶液，因为G418可抑制酵母中GFP的表达。随后立即加入30微升稳定的半乳糖溶液以诱导GFP表达。另设一个阴性对照，加入30微升稳定的亮氨酸缺失棉子糖培养基，代替30%半乳糖溶液。

完成样品制备后，将96孔板放入荧光读板仪中，并使用GFP荧光检测所需的475、509纳米滤光片组进行测量准备。在30摄氏度、120 RPM转速和1毫米振荡直径的条件下，于20小时内以每10分钟一次的间隔进行检测。此处展示的是RTA亲和层析及空载体对照的代表性纯化图谱。

黑框中的蓝色峰代表结合的RTA组分。如黑框所示，在阴性对照中没有蛋白质从柱子中洗脱出来。此处显示的是亲和纯化的RTA组分的脱盐图谱。

图示显示了RTA蛋白组分与盐组分的分离。成功纯化和脱盐后的考马斯亮蓝染色结果展示了不同RTA变体的细胞裂解液或纯化样品。本研究中使用了未修饰的RTA。

为了验证荧光间隔报告基因检测法，在GFP诱导20小时后，测定了野生型酵母原生质体在诱导和非诱导条件下的相对GFP荧光强度。同时分析了在存在RTA、G418或阴性对照条件下的相对GFP荧光强度。此外，还测定了部分突变株的相对GFP荧光强度，这些突变株对应的蛋白质已知参与或不参与酵母中RTA的转运过程。

虚线表示显著性阈值。一旦掌握RTA的表达与纯化，荧光报告检测的结果可在一天内获得。此外，该方法为核糖体失活B毒素领域的研究人员提供了途径，使其能够在真核模式生物酵母中研究这些毒素的中毒机制。