Name: 一个简单的荧光记者的检测方法, 用于识别蓖麻毒素所需的细胞成分 a 链 (贸易协定) 贩运酵母 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 了解基于酵母荧光报告基因检测蓖麻毒素A链（RTA）细胞内转运所需细胞成分的方法。该技术可快速、经济地分析单个酵母基因对RTA运输的影响，为研究核糖体失活毒素的胞内转运机制提供重要工具。

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本研究的部分工作得到了德国研究基金会（SFB 1027，项目A6）资助，特此致谢。

注意：一般实验流程的概览如图所示 图1.
警告：RTA 对人类具有高毒性。需要获得生物安全二级（biosafety level 2 等效）实验室许可。整个实验过程中请佩戴手套。
1. 带有His标签的RTA在异源系统中的表达 大肠杆菌
<ol>
	<li>使用标准电穿孔方法将表达质粒 pET24-RTA(His)6 或空载体 pET24a(+) 转化至 E. coli 细胞中9,10。含空质粒的细胞作为阴性对照。</li>
	<li>在含卡那霉素（100 µg/mL）的 LB 平板上筛选阳性克隆后，将含 RTA 表达质粒或空载体的菌落接种于 5 mL LBkan 培养基（含 100 µg/mL 卡那霉素的 LB 培养基）中，于 37 °C、220 rpm 条件下培养 24 小时。</li>
	<li>向 1 L LBkan 培养基中加入 5 mL 预培养菌液，于 37 °C、220 rpm 条件下培养至菌液 OD600 达到 0.8–1.0（约需 3–4 小时）。随后将培养温度降至 28 °C，并用 H2O 配制 1 M 异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）储备液。</li>
	<li>通过加入 IPTG 至终浓度为 1 mM，诱导 E. coli 中 RTA 的表达。</li>
	<li>在 28 °C、220 rpm 条件下继续培养 3.5 小时后，于 10,000 × g、4 °C 离心 10 分钟收集菌体，用 5 mL 结合缓冲液（500 mM NaCl、10 mM 咪唑、20 mM KH2PO4，pH = 7.4）在 10,000 × g、4 °C 条件下洗涤菌体沉淀两次，每次 10 分钟，最后将菌体沉淀重悬于 5 mL 结合缓冲液中。 
	注意：本步骤可暂停，菌体可在 -80 °C 保存数天。</li>
</ol>
2. 通过亲和层析纯化带组氨酸标签的RTA
<ol>
	<li>按照以下程序在冰上进行细胞超声处理：脉冲15秒（20微米），暂停30秒。重复此步骤五次。</li>
	<li>将细胞裂解液在21,000 × g、4 °C条件下离心15分钟，并使用无菌注射器滤器系统（0.2 µm孔径）过滤上清液。 
	注意：成功超声处理的样品其细胞沉淀边缘呈透明状。</li>
	<li>使用配备5 mL基于Ni2+的亲和层析柱的自动纯化系统，从经无菌过滤的E. coli上清液中纯化His标签RTA组分。通常采用1 mL/min的洗脱速度，并对整个纯化系统进行冷却，以防止毒素结合效率降低及活性丧失。 
	注意：高效RTA纯化的参数列于表1中。更多详细信息请参见Becker et al.9。
	<ol>
		<li>首先用20 mL结合缓冲液平衡亲和层析柱，以去除保存液。使用注射器将经无菌过滤的上清液上样至亲和层析柱。</li>
		<li>用25–35 mL结合缓冲液洗涤层析柱，以去除未结合的蛋白质。持续洗涤直至280 nm处的紫外吸光度接近初始值。</li>
		<li>用20–35 mL洗脱缓冲液（500 mM咪唑，500 mM NaCl，20 mM KH2PO4，pH = 7.2）洗脱结合的RTA组分，并将样品置于冰上保存（图2A和图2B）。 
		注意：RTA组分的洗脱表现为紫外吸收增加。请注意仅收集该洗脱峰部分，以避免非特异性结合蛋白的污染。</li>
		<li>取20 µL洗脱样品进行考马斯亮蓝染色11或Western印迹分析12,13（可选）。使用一抗抗His抗体（1:1,000）和二抗抗小鼠IgG-HRP（1:10,000）检测RTA并验证样品纯度（图3）。</li>
		<li>将洗脱的RTA组分通过5 mL脱盐柱进行脱盐，并将样品平衡于0.8 M山梨醇溶液中。
		<ol>
			<li>将纯化系统中的亲和柱更换为脱盐柱，首先用20 mL 0.8 M山梨醇溶液平衡层析柱。</li>
			<li>通过注射器将洗脱的RTA组分上样至脱盐柱。用100 mL 0.8 M山梨醇溶液洗涤层析柱，并在紫外吸收开始上升时立即开始收集脱盐后的RTA组分至15 mL离心管中（图2C）。</li>
			<li>将洗脱的RTA组分在4 °C保存。 
			注意：当电导率上升时应立即停止收集RTA组分，以避免盐分污染。脱盐步骤的参数详见表1。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用截留分子量为10 kDa的离心浓缩柱，在10,000 × g、4 °C条件下浓缩洗脱的RTA组分30–180分钟，最终体积为1–2 mL，并将样品在4 °C保存3–4周。 
	警告：切勿冷冻样品，因冷冻会导致RTA活性完全丧失。</li>
	<li>使用常规蛋白质定量试剂盒测定蛋白浓度。蛋白浓度应在1–1.5 mg/mL范围内。 
	注意：若蛋白浓度过高（>5 mg/mL），RTA易发生沉淀。</li>
</ol>
3. 酵母转化与细胞壁去除
<ol>
	<li>将野生型或选定的酵母基因敲除突变株转化含有GFP报告基因的质粒pRS315-K28SP-GFP6 使用标准的醋酸锂转化方法14在缺乏亮氨酸的葡萄糖培养基平板（含2%葡萄糖、1.5%琼脂、0.5%硫酸铵、0.17%酵母氮源基础（YNB）及0.087%不含亮氨酸的缺失混合物）中培养细胞，于 30 °C 用于阳性克隆筛选2-3天。</li>
	<li>从每块平板上挑选3个不同的酵母克隆，接种于100 mL亮氨酸缺陷的棉子糖培养基（2% 棉子糖、0.5% 硫酸铵、0.17% YNB、0.087% 无亮氨酸的d/o混合物）中，在220 rpm条件下培养 30 °C 至 OD600 = 1.0-2.0（2-4 × 107 cells/mL 
	注意：不同酵母缺失菌株的细胞生长情况存在差异。监测OD600 通过分光光度计。</li>
	<li>计算 OD600 值，将样品稀释至OD600 = 0.1–0.3（1:5 至 1:10 稀释），测定 OD600 在分光光度计中。以 H 作为对照2O，补充相应量的亮氨酸，用不含棉子糖的培养基重悬 OD600 = 125 溶于 5 mL 无菌水（5 x 108 cells/mL</li>
	<li>离心细胞于 25 °C 在10,000 × g条件下离心5分钟，用5 mL无菌水洗涤细胞两次，然后将细胞重悬于50 mL原生质球缓冲液（0.8 M山梨醇，10 mM Tris-HCl（pH 7.5），10 mM CaCl₂）中2，2 mM 二硫苏糖醇（DTT），以及 200 µg/mL 裂解酶</li>
	<li>在 100 rpm 条件下孵育 50 mL 培养物 30 °C 孵育90分钟。可选：每隔15分钟通过相差显微镜监测原生质球形成情况。在显微镜下，细胞应呈深半透明灰色。明亮（折光性强）的细胞表示消化不足，而细胞影（颜色浅灰、内部结构极少或无）则表示消化过度。</li>
	<li>检测各样本的球状体制备效果。
	<ol>
		<li>完成步骤3.5后，混合 4 µL 50 mL 球状体培养物的 496 µL 球状体缓冲液（约 2 × 106 原生质球）在400 × g下离心10分钟。</li>
		<li>将沉淀重悬于10 mL H2O 蒸馏水，涡旋震荡样本 30 秒，然后涂布平板 10 µL 在亮氨酸缺失/葡萄糖培养基平板（2% 葡萄糖、1.5% 琼脂、0.5% 硫酸铵、0.17% YNB 和 0.087% 亮氨酸缺失的 d/o 混合物）上接种样品。</li>
		<li>在37°C、5% CO₂培养箱中孵育细胞3天 30 °C统计平板上生长的细胞克隆总数。进行数据分析时，仅使用效率高于98%的样本（细胞克隆总数） &lt;每皿40个菌落。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将步骤 3.5 中的细胞在 400 x g 条件下离心 4 °C 孵育10分钟，用5 mL稳定亮氨酸缺陷型棉子糖培养基（0.8 M山梨醇，2%棉子糖，0.5%硫酸铵，0.17% YNB，以及不含亮氨酸的0.087% dropout混合物）洗涤细胞两次。将细胞重悬于5 mL稳定亮氨酸缺陷型棉子糖培养基中（1 × 10⁸ cells/mL）8 细胞/mL），并直接用于GFP报告基因检测的测量（第4节）。</li>
</ol>
4. 96孔板中GFP报告基因检测测量
<ol>
	<li>将步骤3.7中获得的酵母细胞原生质体接种到96孔板中（200 µL/well).</li>
	<li>添加 70 µL 含阴性对照（Ni洗脱液）的稳定化亮氨酸-棉子糖培养基2+-经IPTG诱导的亲和纯化细胞裂解液 E. coli 空载体的细胞）或纯化的 RTA，终浓度为 RTA 的浓度 5 µM （相当于每孔160 g/L RTA）。</li>
	<li>立即加入 30 µL 稳定化的半乳糖溶液（30% 半乳糖，0.8 M 山梨醇）以诱导 GFP 表达，并随后开始测量。 
	注意：每次实验至少进行3次技术重复，每种酵母菌株至少进行3次生物学重复。</li>
	<li>完成样品制备（步骤 4.1–4.3）后，将 96 孔板放入荧光读板仪中并开始检测。使用 GFP 荧光检测所需的 475/509 nm 滤光片组。在以下条件下进行检测： 30 °C，120 rpm，振荡直径1 mm，持续20小时（每10分钟测量一次）。 
	注意：GFP滤光片组通常在所有读板系统中均可使用。温度、时间窗口、检测间隔和RTA浓度可根据自身需求进行调整。代表性结果如下所示 图4.</li>
	<li>可选：在检测中使用额外的内部对照以进行质量控制。通过添加阴性对照来制备 30 µL 使用稳定化的亮氨酸-棉子糖培养基替代30%半乳糖（不诱导GFP表达）。此外，添加 70 µL 0.8 M 山梨醇稳定的 G418 溶液（300 µg/mL）。蛋白质翻译抑制剂G418作为蛋白质抑制的阳性对照，因为它可阻止酵母中GFP的表达。</li>
	<li>根据以下公式计算20小时时间点的相对GFP荧光百分比（参见 图4A):  <img alt="荧光光谱法中样品分析的相对荧光强度计算公式。" src="/files/ftp_upload/56588/56588eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程">   其中NC为阴性对照
	<ol>
		<li>或者，使用上述公式计算每个测量时间点（本例中为10分钟，另见步骤4.4）的相对GFP荧光强度。如图所示 图4B，通过将GFP荧光强度（y轴）随时间（x轴）作图来创建图表。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding-competent+and+folding-defective+forms+of+ricin+A+chain+have+different+fates+after+retrotranslocation+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum.</a> Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).</li>
<li>Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+entry+of+Shiga-like+toxin+a+chain+from+the+yeast+endoplasmic+reticulum+requires+catalytically+active+Hrd1p%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p.</a> PLoS One. 7 (7), e41119(2012).</li>
<li>Moreau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screens+identify+genes+required+for+Ricin+and+PE+intoxications%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications.</a> Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).</li>
<li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li>
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<li>Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+depurination+is+not+sufficient+for+ricin-mediated+cell+death+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae.</a> Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).</li>
<li>Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ricin%3A+structure%2C+mode+of+action%2C+and+some+current+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Ricin: structure, mode of action, and some current applications.</a> Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).</li>
<li>Becker, B., Schmitt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+yeast+as+model+to+study+ricin+toxin+a+uptake+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking.</a> Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).</li>
<li>Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+plasmid+DNA+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Introduction of plasmid DNA into cells.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2001).</li>
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<li>Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).</li>
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<li>Vitetta, E. S., Yen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+functional+properties+of+genetically+engineered+ricin+B+chain+lacking+galactose-binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity.</a> Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).</li>
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<li>Jablonowski, D., Schaffrath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+RNA+polymerase+II+is+affected+by+Kluyveromyces+lactis+zymocin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin.</a> J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).</li>
<li>Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kluyveromyces+lactis+zymocin+mode+of+action+is+linked+to+RNA+polymerase+II+function+via+Elongator%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator.</a> Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在执行上述方案时，我们建议遵循以下建议，以确保实验取得成功。
在异源蛋白表达过程中，IPTG 浓度不应超过 1 mM。IPTG 浓度 &#62;1 mM 会抑制启动子诱导的 RTA 表达，导致毒素产量降低。此外，为防止包涵体形成、折叠效率低下以及毒素失活，细胞培养温度不应高于 28 °C。在较低温度（例如，20–28 °C）下表达 RTA 是可行的，也能产生具有生物活性的毒素。然而，进一步降低温度对 RTA 活性或折叠的改善并不显著，且与 28 °C 相比，总毒素产量反而更低（数据未显示）。
亲和层析的纯化参数（表1）是针对配备5 mL Ni2+ 亲和柱的自动化纯化系统进行优化的，若RTA纯度或得率不理想，应根据所使用的其他自制或商用柱系统进行相应调整。若RTA纯度不理想（表现为考马斯亮蓝染色的SDS凝胶中出现额外蛋白条带），通常可通过提高结合缓冲液中的咪唑浓度，以减少带正电荷蛋白与柱料的非特异性结合，从而提高RTA的整体纯度。若RTA得率不理想，可尝试...

由产毒细菌感染所致的患者对每个社会医疗体系均构成严重的医疗和经济负担，尤其是目前仍普遍缺乏有效的治疗手段。为了开发新的治疗策略，有必要在分子水平上全面理解具有医学重要性的A/B型毒素（如霍乱毒素、志贺毒素或蓖麻毒素）的复杂中毒机制，而这需要建立并实施新型高效的检测方法。
近年来，多项研究试图通过使用耗时且成本高昂的方法（如放射性毒素标记）来分析酵母和哺乳动物细胞中的A/B毒素转运1,2 以及基于siRNA的筛选方法3在某些情况下，已对毒素的转运过程进行了可视化观察 体内 通过化学和/或遗传方法将单个毒素亚基与荧光染料、量子点或荧光蛋白偶联后，利用荧光显微镜进行观察4,5不幸的是，这类修饰通常会导致毒素失去活性和/或改变其天然特性。另一种巧妙的间接方法是利用基于酶的报告系统来回答多种科学问题，例如 lacZ 荧光素酶，或荧光蛋白（例如 GFP 或 Discosoma sp红色荧光蛋白（dsRed）
在本文中，描述了一种简单的方法，用于鉴定细胞内转运外源性施加的RTA所需的细胞组分 S. cerevisiae因此，含有N端ER导入信号并后接GFP的荧光报告质粒可作为蛋白质生物合成传感器，通过GFP荧光发射间接测量RTA介导的蛋白质翻译抑制 体内 翻译6如果与野生型相比，特定酵母基因敲除突变体中的RTA内吞作用和/或细胞内运输受到负向（或正向）影响，则可通过GFP荧光发射的增强（或减弱）来检测6.
迄今为止，所有分析酵母细胞中RTA转运的方法均局限于RTA从内质网到细胞质的逆向转位过程。在这种人工系统中，含有内质网导入信号的RTA由一个可诱导启动子表达，导致细胞出现自杀表型1,7。尽管本文所描述的实验体系同样缺少蓖麻毒素的细胞结合B亚基，因此不能完全代表天然蓖麻毒素全毒素中毒的情况8，但该新检测方法能够高度模拟毒素从质膜经高尔基体转运至内质网的过程。有趣的是，初步研究获得的结果表明，RTA所利用的运输途径与蓖麻毒素全毒素的中毒路径具有显著的相似性。
综上所述，该方法可用于确定特定细胞蛋白在酵母中RTA内吞及转运过程中的具体作用。此外，该实验体系还可轻松适用于其他由不同酵母或细菌物种产生并分泌的核糖体失活毒素，例如zymocin或志贺毒素。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细菌和酵母菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21 DE3(Gold)</td><td>Aligent Technologies</td><td>230130</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S. cerevisiae&lt;/em&gt; BY4742</td><td>Euroscarf</td><td>Y10000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S. cerevisiae&lt;/em&gt; BY4742 缺失突变体</td><td>Dharmacon</td><td>YSC1054</td><td>完整文库</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;本实验方案中使用的质粒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET24a&lt;sup&gt;(+) &lt;/sup&gt;(Novagen)</td><td>Millipore</td><td>69772-3</td><td></td></tr><tr><td>pET-RTA&lt;sub&gt;(His6)&lt;/sub&gt;</td><td>Becker &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; (2016)&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 20T</td><td>USBio</td><td>Z1000.250</td><td>用于去除细胞壁的裂解酶</td></tr><tr><td>LB 肉汤培养基</td><td>Thermo Scientific</td><td>10855021</td><td>制备平板时添加 15 g 琼脂</td></tr><tr><td>YNB</td><td>Thermo Scientific</td><td>DF0335-15-9</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>不含亮氨酸的酵母缺陷型混合补充剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1376-20G</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05040-100G</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>D-棉子糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400-25G</td><td></td></tr><tr><td>D-山梨醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-半乳糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750-10MG</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Thermo Scientific</td><td>11811031</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Roth</td><td>3899.1</td><td></td></tr><tr><td>PAGE Ruler 预染蛋白 Marker</td><td>Fermentas</td><td>26616</td><td>用于 Western 印迹分析的蛋白分子量标准</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RTA 纯化、脱盐及读数测量所用材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro</td><td>Amersham</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soniprep 150</td><td>MSE</td><td></td><td>旧型号，其他型号可用</td></tr><tr><td>Fluoroskan Ascent</td><td>Thermo Scientific</td><td>5210470</td><td>旧型号，已不再供应</td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTAPurifier</td><td>Thermo Scientific</td><td>28406266</td><td>产品已停产并被替代</td></tr><tr><td>HisTRAP HP 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5248-02</td><td></td></tr><tr><td>HiTRAP 脱盐柱</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0003-29</td><td></td></tr><tr><td>Midisart 无菌滤器</td><td>Sartorius</td><td>16534K</td><td>0.2 &amp;micro;m 孔径</td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>660 nm 检测试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>260860</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体（可选）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tetra-His</td><td>Qiagen</td><td>34670</td><td>一抗；1:1,000 稀释</td></tr><tr><td>Anti-mouse-HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9044-2ML</td><td>二抗，1:10,000 稀释</td></tr></tbody></table>

一种基于荧光的简易报告基因检测法，用于鉴定酵母中蓖麻毒素a链（rta）转运所需的细胞组分

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

细菌和植物来源的A/B型毒素利用真核细胞内的天然转运途径，到达细胞质中的胞内靶点，最终导致细胞死亡。这类A/B型毒素通常由一个具有酶活性的A亚基（例如，蓖麻毒素A链，RTA）和一个或多个负责与细胞结合的B亚基组成，后者介导毒素与特定细胞表面受体的结合。目前对A/B型毒素如何高效进入细胞并造成中毒作用的研究，帮助科学家深入理解了真核细胞中的基本细胞机制，例如内吞作用以及高等真核细胞内的蛋白质胞内分选过程。从医学角度来看，明确A/B型毒素的主要转运途径，对于为患者寻找有效的治疗方案，或开发基于毒素的癌症治疗策略同样具有重要意义。
由于在哺乳动物细胞中进行A/B毒素运输的全基因组分析较为复杂、耗时且昂贵，因此多项关于A/B毒素转运的研究已在酵母模式生物Saccharomyces cerevisiae中开展。尽管酵母细胞结构较为简单，但其基本的细胞过程与高等真核细胞相似，且在酵母中获得的研究结果通常可外推至哺乳动物体系。
在此，我们描述了一种快速且易于使用的报告基因检测方法，用于分析RTA在酵母中的细胞内转运过程。该新检测方法的一个重要优势在于，不仅可研究RTA从内质网（ER）向细胞质的逆向转位，还可研究毒素从质膜经内吞作用及逆向运输至内质网的全过程。该检测利用一种报告质粒，通过绿色荧光蛋白（GFP）的荧光发射间接测量RTA的毒性 体内 由于RTA可通过28S rRNA去嘌呤作用高效抑制蛋白质生物合成的起始，本实验通过检测荧光发射的变化，可鉴定参与细胞内RTA转运的宿主细胞蛋白。

本论文所述方案的总体工作流程如图1所示，大致概括了成功纯化RTA以及后续GFP报告基因实验的各个步骤。每个步骤的详细说明可在方案部分找到。图2展示了通过亲和层析成功纯化RTA（图2A）以及空载体对照（图2B）的预期结果。图2C显示了脱盐实验的代表性结果，图中清晰地分离出蛋白峰（蓝色）和盐洗脱峰（棕色）。图3以考马斯亮蓝染色的SDS凝胶形式展示了有效的RTA纯化结果。最后，图4总结了通过这种简单且稳健的基于GFP的报告基因检测方法获得的一些原始实验结果6。图4A</stro...

在本文中，我们描述了一种基于酵母的荧光报告基因检测方法，用于鉴定参与植物毒素蓖麻毒素A亚基（RTA）转运和杀伤过程的细胞组分。

一种基于荧光的简易报告基因检测法，用于鉴定酵母中蓖麻毒素A链（RTA）转运所需的细胞组分

细菌和植物A/B毒素利用真核细胞内的天然运输途径，到达细胞质中的胞内靶标，并……

本简单基于荧光的报告基因检测方法的总体目标是筛选酵母模式生物中参与蓖麻毒素A链（ricin toxin A或RTA链）正常转运过程所需的细胞组分。该方法有助于解答有关核糖体失活B毒素在细胞内转运过程中的关键问题。在本例中，即植物毒素蓖麻毒素的细胞毒性亚基从质膜进入细胞质的过程。该实验的主要优势在于能够快速且经济地分析单个酵母基因对RTA转运的影响。按照文字版实验方案中的详细说明，首先进行细胞转化。用含有RTA表达质粒或空载体的细胞接种5毫升LB卡那霉素培养基。将细胞在37摄氏度、220转/分钟条件下培养24小时。在1升LB卡那霉素培养基中加入5毫升预培养物，然后将细胞在37摄氏度、220转/分钟条件下继续培养，直至细胞在600纳米处的光密度达到0.8至1.0。随后，将培养温度降至28摄氏度。通过加入IPTG至终浓度为1毫摩尔，诱导大肠杆菌中RTA的表达。在28摄氏度、220转/分钟条件下培养3.5小时后，于10,000 ×g、4摄氏度离心10分钟收集细胞。然后用 5 mL 结合缓冲液洗涤沉淀，在 10,000 g、4 °C 条件下离心 10 分钟以收集沉淀。重复洗涤一次后，将沉淀重悬于 5 mL 结合缓冲液中。在冰上进行超声处理，采用 5 个循环，每个循环包括 15 秒脉冲和 30 秒暂停。将细胞裂解物在 4 摄氏度、21,000 g 条件下离心 15 分钟后，使用无菌注射器滤器系统过滤上清液。采用配备 5 毫升镍基亲和层析柱的自动化纯化系统，从经无菌过滤的大肠杆菌上清液中纯化 HIS 标签的 RTA 组分。通常情况下，使用 1 毫升/分钟的洗脱流速，并对整个纯化系统进行冷却，以防止毒素结合效率降低及毒素活性丧失。用20毫升结合缓冲液短暂平衡亲和柱，以去除保存缓冲液。然后使用注射器将无菌过滤后的上清液加载到亲和柱上。用25至35毫升结合缓冲液洗涤柱子，以去除未结合的蛋白质。重复洗涤步骤，直至280纳米处的紫外吸收值接近初始紫外值。随后用20至35毫升洗脱缓冲液洗脱结合的RTA组分，并将样品置于冰上保存。在280纳米紫外吸收值开始上升后应尽快开始收集RTA组分，当吸收值再次回到原始基线水平时，应立即停止收集。为了对洗脱的RTA组分进行脱盐，将纯化系统的亲和柱更换为脱盐柱，并用20毫升0.8摩尔的山梨醇平衡柱子。通过注射器将洗脱的RTA组分上样至柱中。用100毫升0.8摩尔的山梨醇洗涤柱子，并在紫外吸收开始上升时，立即在15毫升离心管中稀释脱盐后的RTA组分。为避免盐污染，当电导率升高时，立即停止组分收集。将洗脱的 RTA 组分在 4°C 下保存。按照文本方案中所述转化酵母后，从每块平板上挑取三个不同的酵母克隆。将克隆接种于100毫升亮氨酸缺陷型棉子糖培养基中，在220转/分钟、30摄氏度条件下培养，使600纳米处的光密度达到1.0至2.0。在25摄氏度下以10,000 ×g离心5分钟收集细胞。用5毫升无菌水洗涤细胞两次后，将细胞重悬于50毫升原生质球缓冲液中。将50毫升培养物在100 rpm、30°C条件下孵育90分钟。随后在400 ×g、4°C条件下离心10分钟，用5毫升稳定型亮氨酸缺陷型棉子糖培养基洗涤细胞两次。然后将细胞重悬于5毫升相同培养基中，直接用于GFP报告基因检测分析。将酵母细胞原生质体接种到96孔板中。向每孔加入70微升稳定化的亮氨酸缺陷型棉子糖培养基，其中含有阴性对照，即表达空载体或纯化的RTA，最终RTA浓度为5微摩尔。向其余各孔中每孔加入70微升稳定化的亮氨酸缺陷型培养基，使每孔总体积达到270微升。作为蛋白质抑制的阳性对照，加入70微升0.8摩尔的山梨醇稳定G418溶液，因为G418可抑制酵母中GFP的表达。随后立即加入30微升稳定的半乳糖溶液以诱导GFP表达。另设一个阴性对照，加入30微升稳定的亮氨酸缺失棉子糖培养基，代替30%半乳糖溶液。完成样品制备后，将96孔板放入荧光读板仪中，并使用GFP荧光检测所需的475、509纳米滤光片组进行测量准备。在30摄氏度、120 RPM转速和1毫米振荡直径的条件下，于20小时内以每10分钟一次的间隔进行检测。此处展示的是RTA亲和层析及空载体对照的代表性纯化图谱。黑框中的蓝色峰代表结合的RTA组分。如黑框所示，在阴性对照中没有蛋白质从柱子中洗脱出来。此处显示的是亲和纯化的RTA组分的脱盐图谱。图示显示了RTA蛋白组分与盐组分的分离。成功纯化和脱盐后的考马斯亮蓝染色结果展示了不同RTA变体的细胞裂解液或纯化样品。本研究中使用了未修饰的RTA。为了验证荧光间隔报告基因检测法，在GFP诱导20小时后，测定了野生型酵母原生质体在诱导和非诱导条件下的相对GFP荧光强度。同时分析了在存在RTA、G418或阴性对照条件下的相对GFP荧光强度。此外，还测定了部分突变株的相对GFP荧光强度，这些突变株对应的蛋白质已知参与或不参与酵母中RTA的转运过程。虚线表示显著性阈值。一旦掌握RTA的表达与纯化，荧光报告检测的结果可在一天内获得。此外，该方法为核糖体失活B毒素领域的研究人员提供了途径，使其能够在真核模式生物酵母中研究这些毒素的中毒机制。

a-simple-fluorescence-based-reporter-assay-to-identify-cellular

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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