基于细胞外基质提取物 (ECME) 的三维系统中单核细胞与原代乳癌细胞的通讯分析

该方案的总体目标是研究三维共培养系统中原代乳腺癌细胞和单核细胞之间的直接和间接通讯。该方法可以帮助回答乳腺癌领域炎症微环境中的关键问题，例如免疫细胞如何分级和激活，这些细胞如何帮助维持肿瘤炎症微环境以及这些微环境如何促进肿瘤细胞侵袭。该技术的主要优点是它为研究肿瘤内通讯提供了一种经济实惠的替代方案，并说明了体外 3-D 细胞系统在研究肿瘤生物学特定特征方面的潜力。

特别是那些与肿瘤侵袭相关的。首先，在 10 毫升 RPMI1640 培养基中培养 10 倍至第六个 U937 和 THP1 单核细胞，补充有 10% FBS 和 1% 抗生素抗真菌剂。还可以在补充的 DMEMF12 培养基中培养新鲜的 PM。

将细胞在 37 摄氏度下在 5% 的加湿二氧化碳环境中孵育。将 10 至 5 个单核细胞接种 4 次，每孔 1 毫升的相应培养基。在每个孔中放置一个插入物，并将 900 微升的 4 乘以 10 添加到相应培养基中的第五个 BrC 细胞悬液中。

将培养物在 37 摄氏度下在 5% 的加湿二氧化碳环境中孵育 5 天，然后回收上清液。如果进行后续分析，则通过胰蛋白酶消化检索细胞。在相应的培养基中包括单个细胞培养物的对照。

为了在细胞培养前用市售的嘻和罗丹明标记 BrC 细胞和单核细胞，请为第六个感兴趣的 BrC 细胞准备两倍 10 的单层，并用充分的、预热的荧光染料工作溶液替换标准培养基。将细胞在 37 摄氏度的加湿 5% 二氧化碳环境中孵育 30 分钟。然后吸出染料溶液并使用足够的 XPBS 轻轻冲洗细胞。

吸出 PBS 并加入标准培养基。要用胰蛋白酶消化细胞，向培养瓶中加入 2 毫升 05% 胰蛋白酶和 0.48 毫摩尔 EDTA，并在 37 摄氏度下孵育细胞 5 至 10 分钟。添加 200 μL FBS 以停止胰蛋白酶消化，并加入 7 mL无补充剂的相应培养基。

通过移液重新悬浮细胞，然后将 10 微升细胞转移到 Nuebauer 室中并计数。接下来，在 430 x g 和室温下沉淀细胞 5 分钟，然后弃去上清液，并使用 3 毫升预热的荧光染料工作溶液重新悬浮细胞。将细胞悬液在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳加湿环境中孵育 30 分钟。

再次沉淀细胞后，丢弃染料工作溶液，并使用 5 至 7 毫升 1 XPBS 轻轻重悬细胞。然后，在再次沉淀细胞并丢弃 PBS 后，将细胞重悬于 5 至 7 mL 标准培养基中。计数 10 微升细胞悬液。

通过在孔底部铺布足够的 ECME 来建立共培养物，以便在四孔室载玻片系统的每个孔中形成均匀的层。每孔接种 20 微升含有 5 次 10 至 5 个标记 BrC 细胞的单细胞悬液。在 37 摄氏度下放置 15 至 20 分钟后，在 80 微升补充有 60% ECME 的检测培养基中，向第五个标记的单核细胞中加入 2.5 倍 10 的悬浮液。

让 ECME 在 37 摄氏度下凝固 15 到 20 分钟。现在加入 1 毫升 BrC 细胞和单核细胞培养基的一对一混合物。将共培养物在 37 摄氏度下在 5% 加湿的二氧化碳环境中孵育 24 小时、48 小时或 5 天，以跟踪不同时间点的变化。

为了降解 ECM 蛋白并从培养物中回收细胞，吸出并丢弃培养基，然后向培养物中加入 0.5 毫升含 0.1% 胰蛋白酶和 0.25% EDTA 的 1 XPBS。将细胞在 37 摄氏度下孵育 3 小时。孵育后，加入 0.5 mL 含 10% FBS 的 1 XPBS 以中和胰蛋白酶，并通过剧烈移液重新悬浮细胞以获得单细胞悬液。

沉淀细胞后，弃去上清液，将细胞重悬于 5 毫升含 10% FBS 的 1 XPBS 中。重复此步骤一次。使用适当的仪器对细胞悬液进行传真。

确保最终种群的纯度至少为 95%。在八孔室载玻片系统的每个孔中，铺上 40 μL 的 ECME 碱，并在 37 摄氏度下凝固 30 分钟。根据文本方案，在 400 微升补充的 DMEM F12 培养基中每孔接种 800 个 MCF10 A 细胞。

然后加入 400 μL 条件培养基或补充 DMEM F12 培养基，每毫升添加 20 ng人重组 IL1 β。将腔室载玻片放入装有 35 毫升培养皿的玻璃培养皿中，该培养皿中装有 2 毫升 PBS。MCF 10A 细胞应非常缓慢地接种到每个孔中，以避免损伤 ECME 的碱基并防止细胞沉淀并形成单体。

使用光学显微镜记录每 24 小时腺泡形成一次，持续 14 天。培养 14 天后，在一个 XPBS 中加入 100 μL 100 纳摩尔 dapy，并在室温下孵育样品，不断搅拌 25 分钟。在室温下用 1 个 XPBS 冲洗样品，3 次，每次 5 分钟，同时不断搅拌。

使用专门用于荧光染色的封固剂封固制剂。然后用透明抛光剂密封封固的样品，并保持载玻片，在 4 摄氏度下避光。在共聚焦显微镜中演示该程序的是国家高级显微镜实验室的研究员 Vadim Perez。

用共聚焦显微镜分析腺泡，拍摄腺泡不同深度的横向堆栈图像。使用适当的染色方案观察腺泡中的不同细胞蛋白。例如，在这里对 caheren 进行染色以评估细胞间粘附、细胞极性和口腔形成。

在 5 天内研究了在低密度和高密度 3D 培养物中生长的原代 BrC 细胞的形态。在最初的 48 小时内，细胞以细长的纺锤形粘附在 ECME 上，并在 5 天时形成针织状结构。在 3D 共培养 5 天后，MCF7 和 MDA-MB-231 商业 BrC 细胞均形成杂乱无章的聚集体。

然而，侵袭性 MDA-MB-231 细胞用于细长形式的聚集体，而非侵袭性 MCF7 细胞用于具有圆形聚集体，比 MDA-MB-231 细胞更致密。收获来自间接相互作用 3D 原代 BrC 培养物及其与原代单核细胞的 5 天共培养物的上清液。在原代 BrC 细胞单核细胞共培养物中观察到 IL1 β 和 IL8 水平显着升高。

以前与恶性进展相关的关键细胞因子和燃烧性细胞因子。用来自两种原代 BrC 细胞系的两种不同上清液培养 MCF10A 细胞，以观察管腔形成作为对 anoykis 耐药性的量度。与在标准条件下生长的 MCF10A 细胞不同，第 14 天的双共聚焦显微镜检查，球体的横向切割显示 MCF10A 细胞逃避了 anoykis，通过计数腺泡中中央细胞的数量来测量。

按照此程序，可以执行其他方法，例如医学分析，以回答其他问题。测试两种癌症迁移中的信号通路。开发后，这项技术为肿瘤微环境领域的研究人员在 3D 共培养系统中探索乳腺癌细胞与肿块细胞、成纤维细胞、中性粒甚至肿瘤细胞的不同克隆的通讯铺平了道路。

看完这个视频，你应该对如何建立 3D 培养系统来模拟肿瘤微环境有很好的了解。