Name: 基于细胞外基质提取物 (ECME) 的三维系统中单核细胞与原代乳癌细胞的通讯分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 了解基于细胞外基质提取物的三维共培养系统如何分析原代乳腺癌细胞与单核细胞的直接及间接通讯，研究免疫细胞激活、肿瘤炎症微环境维持及癌细胞侵袭机制。

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本工作由 CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE 项目（编号 233061）资助 Ezequiel M. Fuentes-Pananá，以及由墨西哥联邦儿童医院 Federico Gómez 研究支持基金（项目编号 HIM-2014-053）资助。Espinoza-Sánchez NA 是墨西哥国立自治大学（UNAM）生物医学科学博士项目在读博士生，并获得 CONACYT 编号为 231663 的奖学金。E-S NA 还感谢墨西哥社会保险研究所（IMSS）提供的财政支持。

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作者声明不存在任何利益冲突。

上皮细胞以三维空间构象生长，其与细胞外基质（ECM）蛋白的相互作用对组织稳态至关重要。许多癌症研究基于在单层（2D）培养的细胞，尽管这些研究对理解肿瘤形成与进展的诸多方面具有关键作用，但单层培养无法重现细胞外基质赋予细胞的特性，例如：增殖受限、依赖黏附的细胞存活、顶-基底极性、细胞外基质重塑、细胞分化 等等。 重要的是，不仅肿瘤细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用对癌症进展至关重要，肿瘤细胞与非肿瘤细胞（如免疫细胞）之间的通讯也同样关键。本文提供的实验方案有助于理解在细胞外基质所构建的微环境中免疫细胞与癌细胞之间的相互作用、这些相互作用所引发的炎症反应，以及这种炎症状态如何形成正反馈循环，促进单核细胞的趋化募集和癌细胞的进一步侵袭。
使用ECME的一大优势在于其可提供一种适合构建多种实验性三维模型的生物支架22富含细胞外基质蛋白（如层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、entactin、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）以及生长因子，这些成分 体内 将与上皮细胞相互作用。其缺点在于，由于该物质来源于小鼠肉瘤的裂解物，...

肿瘤生物学远比此前认为的更为复杂。越来越多的证据表明，肿瘤细胞不仅仅是无限制增殖的细胞团；相反，不同的肿瘤细胞似乎执行着不同的功能，在肿瘤内部呈现出高度的组织性和层次性1。肿瘤细胞还与非转化细胞密切交流：巨噬细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、脂肪细胞、内皮细胞等均浸润于构成细胞外基质（ECM）的支架蛋白和多糖网络之中。转化细胞与非转化细胞之间以及这些细胞与ECM之间建立了大量直接和间接的相互作用，这些相互作用对疾病的发展进程具有重要影响2,3。以乳腺癌（BrC）为例，尤其重要的是解析BrC细胞与肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）之间的通讯机制，因为已有研究发现，TAMs在肿瘤进展中发挥关键作用，可增加转移和疾病复发的风险4,5。
为了分析肿瘤内部的相互作用及其可能的结果，研究人员已开发出基于细胞外基质（ECM）提取物的新型三维体外模型，相较于传统的单层细胞培养（细胞贴附于塑料表面生长），这些模型提供了更为复杂的微环境，更接近肿瘤生物学的真实情况。Petersen 和 Bissell6首次建立了在富含层粘连蛋白的基底膜上培养良性和恶性乳腺上皮细胞的模型，并首次描述了能够区分良性与恶性人乳腺上皮细胞的三维类器官结构。十年后，Debnath、Muthuswamy 和 Brugge7,8,9建立的模型为阐明腺泡恶性转化过程中受损的生物学通路提供了有力工具，例如因增殖失控导致的大腺泡形成、紧密连接蛋白错位表明细胞极性受损，以及由于细胞对失巢凋亡（anoikis）产生抵抗而导致腺泡腔的丧失——失巢凋亡是一种程序性细胞死亡，发生在依赖锚定生长的细胞脱离周围ECM时。Sameni、Jedeszko 和 Sloane 的模型则聚焦于成像细胞的蛋白水解活性，该特性与侵袭性密切相关，是肿瘤恶性表型的另一关键特征10,11,12。这些模型依赖于混合了不同荧光淬灭蛋白底物的蛋白基质（如DQ-明胶、DQ-胶原I型和DQ-胶原IV型），其中荧光信号的出现指示了胶原蛋白的蛋白水解降解。三维模型还被用于研究未转化细胞和肿瘤细胞的干细胞特性，在此类模型中，细胞聚集体（也称为球体）可在悬浮状态或类ECM蛋白中培养，以探究细胞分化、不对称细胞分裂、细胞间黏附及细胞运动等机制13,14。侵袭实验可用于评估肿瘤的内在侵袭能力，并鉴定在侵袭过程中充当趋化因子的分子15。总体而言，三维模型代表了一种经济可行的体外细胞培养多样化手段，能更真实地反映正常组织和肿瘤组织的形态发生过程。
我们基于上述模型设计了一种三维细胞共培养系统7,10,11，使用已知侵袭潜能的人类商业乳腺癌细胞系（管腔型和三阴性型）以及从乳腺癌患者体内分离的原代细胞。我们首先建立了一个模型，将非侵袭性（MCF-7）或侵袭性（MDA-MB-231）乳腺癌细胞与U937单核细胞在基于细胞外基质提取物（ECME）的三维系统中进行共培养，该系统允许细胞间直接接触。这些共培养体系用于研究这两种细胞谱系之间的相互作用如何影响一组与癌症侵袭行为相关基因的转录。结果显示，环氧合酶-2（COX-2）的转录水平显著升高，并伴随其产物之一前列腺素E2（PGE2）生成增加，突显了炎症在癌症进展中的作用。此外，在含有DQ-胶原蛋白IV的培养体系中，当侵袭性MDA-MB-231细胞与U937单核细胞共培养时，基质金属蛋白酶（MMP）的转录水平升高，并与胶原蛋白降解增强呈正相关。值得注意的是，我们的共培养实验结果并不支持细胞间相互作用机制是胶原降解所必需的这一假设，反而提示两种细胞谱系间的通讯由分泌性分子介导。此外，从这些共培养体系中收集的上清液含有可溶性因子，能够破坏由未转化的MCF-10A细胞形成的腺泡结构13研究发现，侵袭性及原发性乳腺癌（BrC）细胞分泌的单核细胞趋化分子MCP-1、GM-CSF和RANTES水平升高。因此，我们设计了一种三维培养体系，通过将细胞置于细胞培养小室中实现物理分离，以避免细胞间的直接接触。该培养体系用于研究BrC细胞与单核细胞之间的间接通讯。在这些实验中，采用了非侵袭性和侵袭性的商用BrC细胞系以及原发性BrC细胞，同时使用了三种不同类型的人源单核细胞：商用U937和THP-1细胞，以及从健康供体外周血中分离得到的原代单核细胞（PMs）（所有单核细胞均处于非活化状态）。在共培养体系中，观察到炎症性细胞因子IL-1β和IL-8的浓度显著升高。同样，MMP-1、MMP-2和MMP-10在BrC细胞与单核细胞的共培养体系中也呈现上调，从而进一步支持了先前的研究结果。14本文详细介绍了原代BrC细胞在三维培养中分离与检测的逐步实验流程，并提供了代表性结果。这项工作充分展示了该方法所具备的巨大潜力 体外 三维细胞系统可用于研究肿瘤生物学的特定方面。

<table><tbody><tr><td>U937</td><td>American Type Culture Collection ATCC&amp;nbsp;</td><td>CRL-1593.2</td><td>单核细胞系/组织细胞淋巴瘤&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>THP-1</td><td>American Type Culture Collection ATCC&amp;nbsp;</td><td>TIB-202</td><td>单核细胞系/急性单核细胞白血病&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MCF-10A</td><td>American Type Culture Collection ATCC&amp;nbsp;</td><td>CRL-10317</td><td>非转化乳腺细胞系</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>American Type Culture Collection ATCC&amp;nbsp;</td><td>HTB-22</td><td>乳腺癌细胞系</td></tr><tr><td>T47D</td><td>American Type Culture Collection ATCC&amp;nbsp;</td><td>HTB-133</td><td>乳腺癌细胞系</td></tr><tr><td>HS578T</td><td>American Type Culture Collection ATCC&amp;nbsp;</td><td>HTB-126</td><td>乳腺癌细胞系</td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>American Type Culture Collection ATCC&amp;nbsp;</td><td>HTB-26</td><td>乳腺癌细胞系</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高糖&amp;nbsp;</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>11964-092</td><td>4.5 g/L 葡萄糖</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>抗生素/抗真菌剂</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>100 U/mL 青霉素，100 &amp;micro;g/mL 链霉素，以及 0.25 &amp;micro;g/mL 两性霉素B</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>马血清&amp;nbsp;</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>16050114</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA 1X</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X（磷酸盐缓冲液）</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子（EGF）</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15 (1.00mg)</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I1882-100MG</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H088-5G</td><td></td></tr><tr><td>霍乱毒素 霍乱弧菌</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&amp;nbsp;</td><td>Corning Inc</td><td>356237</td><td>Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤，细胞外基质提取物，-20&amp;deg;C 保存，使用前置于 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>MCP-1</td><td>PeproTech</td><td>300-04</td><td></td></tr><tr><td>RANTES</td><td>PeproTech</td><td>300-06</td><td></td></tr><tr><td>IL-8</td><td>PeproTech</td><td>200-08</td><td></td></tr><tr><td>IL-1&amp;beta;</td><td>PeproTech</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>Hycel M&amp;eacute;xico</td><td>541</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 可渗透支持膜（插入式）</td><td>Corning Inc</td><td>3422</td><td>6.5 mm 直径，8 &amp;micro;m 孔径/24孔板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Transwell 可渗透支持膜（插入式）</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>140620</td><td>6.5 mm 直径，0.4 &amp;micro;m 孔径/24孔板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>人单核细胞分离试剂盒 II&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-153</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>人细胞因子/趋化因子磁珠检测试剂盒（96孔板）</td><td>EMD Millipore</td><td>HCYTOMAG-60K</td><td></td></tr><tr><td>Magpix 荧光分析系统及 xPonent 软件（基于激光的荧光分析仪器）</td><td>Luminex Corporation</td><td>40-072</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek 带盖腔室载玻片（8孔）</td><td>Nalge Nunc International</td><td>177402</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底微孔 35 mm 培养皿&amp;nbsp;</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr></tbody></table>

基于细胞外基质提取物（ecme）的三维系统中单核细胞与原发性乳腺癌细胞间通讯的分析

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

嵌入于细胞外基质（ECM）中的正常及肿瘤性上皮细胞与造血和非造血细胞密切相互作用，从而显著影响正常组织稳态及疾病进程。在乳腺癌中，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在疾病进展、转移和复发中发挥关键作用；因此，阐明单核细胞向肿瘤微环境趋化的机制及其与肿瘤细胞的相互作用，对于控制疾病具有重要意义。本文详细描述了一种人乳腺癌（BrC）细胞与人单核细胞的三维（3D）共培养体系。BrC细胞基础状态下可高水平分泌活化调节因子、正常T细胞表达和分泌的趋化因子（RANTES）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（G-CSF）；而在与单核细胞共培养时，促炎性细胞因子白细胞介素（IL）-1β和IL-8，以及基质金属蛋白酶（MMP）-1、MMP-2和MMP-10的表达均显著上调。该肿瘤间质微环境可促进MCF-10A细胞形成的3D腺泡样结构抵抗失巢凋亡，诱导单核细胞趋化，并增强侵袭性BrC细胞的侵袭能力。本文所提供的实验方案为研究肿瘤内部通讯提供了一种经济可行的替代方法，并展示了其在肿瘤生物学研究中的巨大潜力。 体外 三维细胞系统可用于研究与肿瘤侵袭性相关的肿瘤生物学特定特征。

3D 培养中 BrC 细胞的形态学分析：
在低密度和高密度条件下，对原代BrC细胞在三维培养中生长5天的形态进行了研究。在前48小时内，细胞黏附于ECME并保持低密度状态。此时可明显观察到细胞呈细长的梭形，部分细胞具有两个或多个细长的细胞质突起，且未表现出明显的细胞间接触。经过5天培养后，细胞在维持初始形态的同时发生增殖。此外，它们形成了类似网状的结构，无特定的空间组织模式，并呈现堆叠生长，无接触抑制现象。研究同时与未转化的MCF-10A细胞进行了对比，后者可形成类似腺泡的球形结构，呈现出特征性的、边界清晰且大小均一（约50 µm）的圆形规则结构。相比之下，原代BrC细胞的形态更接近于侵袭性强的BrC细胞MDA-MB-231（图1）。
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本文介绍了一种三维培养方法，用于分析原代乳腺癌细胞的形态，以及研究它们与单核细胞的直接/间接相互作用及其结果，例如胶原降解、免疫细胞募集、细胞侵袭和促进癌症相关炎症。

基于细胞外基质提取物（ECME）的三维系统中单核细胞与原发性乳腺癌细胞间通讯的分析

嵌入细胞外基质（ECM）中的正常与肿瘤上皮细胞与造血及非造血细胞密切相互作用，……

本实验方案的总体目标是在三维共培养系统中研究原发性乳腺癌细胞与单核细胞之间的直接和间接通讯。该方法有助于解答乳腺癌炎症微环境领域中的关键问题，例如免疫细胞如何被识别和激活，这些细胞如何帮助维持肿瘤的炎症微环境，以及该微环境如何促进肿瘤细胞的侵袭。该技术的主要优势在于，它为研究肿瘤内通讯提供了一种经济可行的替代方法，并展示了体外三维细胞系统在探究肿瘤生物学特定特征方面的潜力。特别是与肿瘤侵袭性相关的因素。首先，在10毫升RPMI1640培养基中培养2×10⁶个U937和THP1单核细胞，培养基中添加10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素-抗真菌剂。同时，在添加补剂的DMEM/F12培养基中培养新鲜的PMs。将细胞置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育。每孔加入1毫升相应培养基，接种4 × 10⁵个单核细胞。在每孔中放入一个插入式培养小室，并加入900微升相应培养基中含4 × 10⁵个BrC细胞的细胞悬液。将培养物置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中培养五天，收集上清液。如需进行后续分析，通过胰蛋白酶消化法回收细胞。设置各细胞培养物分别加入相应培养基的对照组。在细胞培养前，使用市售的香豆素和罗丹明对BrC细胞和单核细胞进行标记时，先制备含有2 × 10⁶个目标BrC细胞的单层细胞，弃去原培养基，加入足量预热的荧光染料工作液。将细胞置于37°C、含5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育30分钟。随后吸除染料溶液，并用足量的1×PBS轻柔洗涤细胞。吸去 PBS，加入标准培养基。消化细胞时，向培养瓶中加入 2 毫升 0.5% 胰蛋白酶和 0.48 毫摩尔/升 EDTA，于 37 摄氏度孵育 5 至 10 分钟。加入 200 微升 FBS 以终止胰蛋白酶消化，并加入 7 毫升不含添加剂的相应培养基。用移液器吹打重悬细胞，然后取10微升细胞悬液加入血细胞计数板（Nuebauer chamber）中进行计数。接着，在室温下以430 × g离心5分钟收集细胞，弃去上清液，加入3毫升预热的荧光染料工作液重悬细胞。将细胞悬液置于37°C、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育30分钟。再次离心收集细胞后，弃去染料工作液，加入五到七毫升的1×PBS，轻轻重悬细胞。接着再次离心收集细胞，弃去PBS，用五到七毫升的标准培养基重悬细胞。取10微升细胞悬液进行计数。通过在四孔板系统的每个孔底部铺加足量的ECME，形成均匀的一层，以建立共培养体系。每孔加入20微升含有5×10⁵个标记BrC细胞的单细胞悬液。在37摄氏度孵育15至20分钟后，加入含有2.5×10⁵个标记单核细胞的悬液，体积为80微升，培养基为添加了60% ECME的检测培养基。将ECME在37摄氏度下静置15至20分钟，使其凝固。随后加入1毫升由BrC细胞与单核细胞培养基按1:1比例混合的培养液。将共培养体系置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育，分别在24小时、48小时或5天时观察不同时间点的变化。为了降解细胞外基质蛋白并从培养物中回收细胞，吸除并弃去培养基，然后向培养物中加入0.5毫升含0.1%胰蛋白酶和0.25% EDTA的1×PBS。将细胞在37°C下孵育3小时。孵育结束后，加入0.5毫升含10%胎牛血清（FBS）的1×PBS以中和胰蛋白酶，并通过剧烈吹打重悬细胞，获得单细胞悬液。离心收集细胞后，弃去上清液，并将细胞重悬于5毫升含10%胎牛血清（FBS）的1×PBS中。重复此步骤一次。使用适当的仪器对细胞悬液进行流式分析。确保最终细胞群体纯度至少达到95%。在八孔腔室载玻片系统的每个孔中加入40 µL的ECME作为基底，并在37 °C下孵育30分钟使其凝固。根据文本方案，将800个MCF10A细胞接种至每个孔中，培养基为400 µL添加了补充物的DMEM/F12培养液。然后加入 400 微升条件培养基或补充了 20 纳克/毫升人重组 IL1β 的 DMEM/F12 培养基。将腔室载玻片放入一个玻璃培养皿中，该培养皿内放置一个 35 毫升的培养皿，其中盛有 2 毫升 PBS。MCF 10A 细胞应缓慢接种至每个孔中，以避免损伤 ECME 基底层，并防止细胞过早沉降形成单层细胞。使用光学显微镜每24小时记录一次腺泡形成情况，持续14天。培养14天后，在1 mL PBS中加入100微升浓度为100纳摩尔的DAPI，将样品在室温下避光孵育25分钟，并持续搅拌。用1 mL PBS在室温下清洗样品，持续搅拌，每次5分钟，重复三次。使用适用于荧光染色的封片剂进行封片。然后用透明指甲油密封样本，并将载玻片置于避光条件下，4°C保存。本实验操作将由来自国家先进显微技术实验室的研究人员Vadim Perez在共聚焦显微镜上进行演示。使用共聚焦显微镜对腺泡进行分析，采集腺泡不同深度的横断面图像。通过适当的染色方案对腺泡中的不同细胞蛋白进行可视化观察。例如，此处对钙黏蛋白（caheren）进行染色，以评估细胞间的黏附、细胞极性以及腔体结构的形成。在低密度和高密度条件下，对三维培养中的原代乳腺癌细胞形态进行了为期五天的观察。在前48小时内，细胞以细长的纺锤形黏附于ECME上，并在五天时形成类似编织物的结构。在三维共培养五天后，MCF7和MDA-MB-231两种商业化的乳腺癌细胞均形成了无序的细胞聚集体。然而，侵袭性 MDA-MB-231 细胞形成的聚集体呈细长形态，而非侵袭性 MCF7 细胞形成的聚集体则呈更致密的圆形结构，其致密程度高于 MDA-MB-231 细胞。收集了间接相互作用的三维原代 BrC 培养物及其与原代单核细胞共培养五天后的上清液。在原代 BrC 细胞与单核细胞的共培养体系中，IL1β 和 IL8 的水平显著升高。多种关键性及促炎性细胞因子此前已被证实与恶性进展相关。为观察腔隙形成（作为抵抗失巢凋亡能力的指标），将MCF10A细胞分别与两种不同原代乳腺癌细胞系的上清液共培养。与在标准条件下培养的MCF10A细胞不同，在培养第14天通过双共聚焦显微镜对球状体进行横切观察，结果显示，通过计数腺泡中央细胞数量可证实，MCF10A细胞已逃避失巢凋亡。完成此操作后，还可进行其他方法，如医学分析，以回答更多问题。检测两种癌症迁移中的信号通路。该技术发展后，为肿瘤微环境领域的研究人员提供了途径，使其能够在三维共培养系统中探索乳腺癌细胞与肥大细胞、成纤维细胞、中性粒细胞，甚至不同肿瘤细胞克隆之间的相互作用。观看本视频后，您应充分了解如何建立三维培养系统以模拟肿瘤微环境。

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癌症研究

基于细胞外基质提取物 (ECME) 的三维系统中单核细胞与原代乳癌细胞的通讯分析

我们开发了三维共培养模型，可用于实时活细胞成像，以观察乳腺肿瘤细胞与其微环境中其他细胞之间的相互作用，这些相互作用影响着向侵袭性表型的进展。这些模型可作为临床前筛选工具，用于靶向筛选影响侵袭性的旁分泌诱导的蛋白水解、趋化因子/细胞因子及激酶通路的药物。...

用于肿瘤的4D活细胞成像的MAME模型：影响恶性进展的微环境相互作用

本文描述了一种分析组织成纤维细胞对相关上皮细胞影响的简单方法。该方法与三维组织培养相结合，可促进从三维结构中分离后细胞的分析。该技术适用于具有不同恶性潜能的细胞，有助于系统研究肿瘤相关间质对肿瘤细胞的影响。...

从三维混合细胞球体共培养物中分离乳腺上皮细胞

本视频介绍了在基于细胞外基质提取物（ECME）的环境中，将乳腺癌细胞与单核细胞进行三维共培养的方法，以研究它们之间的相互作用。该方法有助于研究胶原蛋白降解、免疫细胞募集以及细胞侵袭等特定特征。...

三维共培养与直接相互作用：癌细胞与单核细胞共培养以研究其相互作用

在标准培养方法中，细胞被从其生理环境中取出，并在培养皿的塑料表面进行生长。为了研究原代人骨髓细胞的行为，我们建立了一种三维培养系统，使细胞在能够模拟组织天然微环境的条件下生长。...

一种用于研究原代人骨髓及其恶性病变的三维组织培养模型

本文详细介绍了利用三维（3D）实验方法定量分析乳腺癌细胞侵袭的技术。具体而言，我们讨论了建立此类实验所需的步骤、定量方法与数据分析，以及检测细胞侵袭过程中细胞膜完整性丧失的相关方法。...

三维模型定量分析乳腺癌细胞侵袭性

我们展示了一种生成三维乳腺癌替代模型的方法，该模型可通过灌注生物反应器系统进行培养，以提供氧气和营养物质。在培养完成后，将替代模型固定并经处理制成石蜡包埋样本，用于评估相关参数。本文详细说明了其中一项参数——细胞密度的评估方法。...

制备与分析 体外 三维乳腺癌替代模型

我们采用了一种可渗透的微孔膜插入装置来模拟肿瘤微环境（TME）。该模型包含混合细胞培养体系，可在无需荧光标记或细胞分选的情况下，简便地获得高度富集的单一细胞群体，并允许在正常或应激条件下研究肿瘤微环境中细胞间的相互通讯。...

肿瘤微环境的模拟：一种用于富集细胞群体及研究细胞间通讯的简单方法

本文介绍了一种分离完整小鼠乳腺组织以研究细胞外基质（ECM）表达及导管形态的实验方案。从小鼠第4对腹部乳腺中获取8至10周龄未产雌性小鼠的乳腺组织，经中性缓冲甲醛固定后进行切片，并采用免疫组织化学方法对细胞外基质蛋白进行染色。...

完整小鼠乳腺腺体的分离及其细胞外基质表达与腺体形态学分析

本文所述方法的目的是展示如何制备微环境微阵列（MEMA），并利用其研究数千种简单组合微环境对培养细胞表型的影响。...

利用微阵列技术探究肿瘤微环境对细胞表型的影响

本方案描述了一种利用现成材料和原代人乳腺组织构建体外微生理系统以研究乳腺癌的方法。...

使用微生理系统在人乳腺组织中建立乳腺癌模型

了解基于细胞外基质提取物的三维共培养系统如何分析原代乳腺癌细胞与单核细胞的直接及间接通讯，研究免疫细胞激活、肿瘤炎症微环境维持及癌细胞侵袭机制。

基于细胞外基质提取物（ECME）的三维系统中单核细胞与原发性乳腺癌细胞间通讯的分析

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