基于细胞外基质提取物（ECME）的三维系统中单核细胞与原发性乳腺癌细胞间通讯的分析

本实验方案的总体目标是在三维共培养系统中研究原发性乳腺癌细胞与单核细胞之间的直接和间接通讯。该方法有助于解答乳腺癌炎症微环境领域中的关键问题，例如免疫细胞如何被识别和激活，这些细胞如何帮助维持肿瘤的炎症微环境，以及该微环境如何促进肿瘤细胞的侵袭。该技术的主要优势在于，它为研究肿瘤内通讯提供了一种经济可行的替代方法，并展示了体外三维细胞系统在探究肿瘤生物学特定特征方面的潜力。

特别是与肿瘤侵袭性相关的因素。首先，在10毫升RPMI1640培养基中培养2×10⁶个U937和THP1单核细胞，培养基中添加10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素-抗真菌剂。同时，在添加补剂的DMEM/F12培养基中培养新鲜的PMs。

将细胞置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育。每孔加入1毫升相应培养基，接种4 × 10⁵个单核细胞。在每孔中放入一个插入式培养小室，并加入900微升相应培养基中含4 × 10⁵个BrC细胞的细胞悬液。

将培养物置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中培养五天，收集上清液。如需进行后续分析，通过胰蛋白酶消化法回收细胞。设置各细胞培养物分别加入相应培养基的对照组。

在细胞培养前，使用市售的香豆素和罗丹明对BrC细胞和单核细胞进行标记时，先制备含有2 × 10⁶个目标BrC细胞的单层细胞，弃去原培养基，加入足量预热的荧光染料工作液。将细胞置于37°C、含5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育30分钟。随后吸除染料溶液，并用足量的1×PBS轻柔洗涤细胞。

吸去 PBS，加入标准培养基。消化细胞时，向培养瓶中加入 2 毫升 0.5% 胰蛋白酶和 0.48 毫摩尔/升 EDTA，于 37 摄氏度孵育 5 至 10 分钟。加入 200 微升 FBS 以终止胰蛋白酶消化，并加入 7 毫升不含添加剂的相应培养基。

用移液器吹打重悬细胞，然后取10微升细胞悬液加入血细胞计数板（Nuebauer chamber）中进行计数。接着，在室温下以430 × g离心5分钟收集细胞，弃去上清液，加入3毫升预热的荧光染料工作液重悬细胞。将细胞悬液置于37°C、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育30分钟。

再次离心收集细胞后，弃去染料工作液，加入五到七毫升的1×PBS，轻轻重悬细胞。接着再次离心收集细胞，弃去PBS，用五到七毫升的标准培养基重悬细胞。取10微升细胞悬液进行计数。

通过在四孔板系统的每个孔底部铺加足量的ECME，形成均匀的一层，以建立共培养体系。每孔加入20微升含有5×10⁵个标记BrC细胞的单细胞悬液。在37摄氏度孵育15至20分钟后，加入含有2.5×10⁵个标记单核细胞的悬液，体积为80微升，培养基为添加了60% ECME的检测培养基。

将ECME在37摄氏度下静置15至20分钟，使其凝固。随后加入1毫升由BrC细胞与单核细胞培养基按1:1比例混合的培养液。将共培养体系置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育，分别在24小时、48小时或5天时观察不同时间点的变化。

为了降解细胞外基质蛋白并从培养物中回收细胞，吸除并弃去培养基，然后向培养物中加入0.5毫升含0.1%胰蛋白酶和0.25% EDTA的1×PBS。将细胞在37°C下孵育3小时。孵育结束后，加入0.5毫升含10%胎牛血清（FBS）的1×PBS以中和胰蛋白酶，并通过剧烈吹打重悬细胞，获得单细胞悬液。

离心收集细胞后，弃去上清液，并将细胞重悬于5毫升含10%胎牛血清（FBS）的1×PBS中。重复此步骤一次。使用适当的仪器对细胞悬液进行流式分析。

确保最终细胞群体纯度至少达到95%。在八孔腔室载玻片系统的每个孔中加入40 µL的ECME作为基底，并在37 °C下孵育30分钟使其凝固。根据文本方案，将800个MCF10A细胞接种至每个孔中，培养基为400 µL添加了补充物的DMEM/F12培养液。

然后加入 400 微升条件培养基或补充了 20 纳克/毫升人重组 IL1β 的 DMEM/F12 培养基。将腔室载玻片放入一个玻璃培养皿中，该培养皿内放置一个 35 毫升的培养皿，其中盛有 2 毫升 PBS。MCF 10A 细胞应缓慢接种至每个孔中，以避免损伤 ECME 基底层，并防止细胞过早沉降形成单层细胞。

使用光学显微镜每24小时记录一次腺泡形成情况，持续14天。培养14天后，在1 mL PBS中加入100微升浓度为100纳摩尔的DAPI，将样品在室温下避光孵育25分钟，并持续搅拌。用1 mL PBS在室温下清洗样品，持续搅拌，每次5分钟，重复三次。

使用适用于荧光染色的封片剂进行封片。然后用透明指甲油密封样本，并将载玻片置于避光条件下，4°C保存。本实验操作将由来自国家先进显微技术实验室的研究人员Vadim Perez在共聚焦显微镜上进行演示。

使用共聚焦显微镜对腺泡进行分析，采集腺泡不同深度的横断面图像。通过适当的染色方案对腺泡中的不同细胞蛋白进行可视化观察。例如，此处对钙黏蛋白（caheren）进行染色，以评估细胞间的黏附、细胞极性以及腔体结构的形成。

在低密度和高密度条件下，对三维培养中的原代乳腺癌细胞形态进行了为期五天的观察。在前48小时内，细胞以细长的纺锤形黏附于ECME上，并在五天时形成类似编织物的结构。在三维共培养五天后，MCF7和MDA-MB-231两种商业化的乳腺癌细胞均形成了无序的细胞聚集体。

然而，侵袭性 MDA-MB-231 细胞形成的聚集体呈细长形态，而非侵袭性 MCF7 细胞形成的聚集体则呈更致密的圆形结构，其致密程度高于 MDA-MB-231 细胞。收集了间接相互作用的三维原代 BrC 培养物及其与原代单核细胞共培养五天后的上清液。在原代 BrC 细胞与单核细胞的共培养体系中，IL1β 和 IL8 的水平显著升高。

多种关键性及促炎性细胞因子此前已被证实与恶性进展相关。为观察腔隙形成（作为抵抗失巢凋亡能力的指标），将MCF10A细胞分别与两种不同原代乳腺癌细胞系的上清液共培养。与在标准条件下培养的MCF10A细胞不同，在培养第14天通过双共聚焦显微镜对球状体进行横切观察，结果显示，通过计数腺泡中央细胞数量可证实，MCF10A细胞已逃避失巢凋亡。

完成此操作后，还可进行其他方法，如医学分析，以回答更多问题。检测两种癌症迁移中的信号通路。该技术发展后，为肿瘤微环境领域的研究人员提供了途径，使其能够在三维共培养系统中探索乳腺癌细胞与肥大细胞、成纤维细胞、中性粒细胞，甚至不同肿瘤细胞克隆之间的相互作用。

观看本视频后，您应充分了解如何建立三维培养系统以模拟肿瘤微环境。